kaikki menetelmät ihmis-ja eläinkokeissa tehtiin asiaankuuluvien institutionaalisten ohjeiden ja määräysten mukaisesti.

muoviin kiinnittyneiden MSCs: ien ja CD271: n immunopositiivisten MSCs: ien eristäminen ja viljely rasvakudoksesta

National Health Service (NHS) Health Research Authorityn (LREC-numero 12/ee / 0136) eettisen hyväksynnän ja kaikkien luovuttajien tietoon perustuvan suostumuksen jälkeen PA MSCs ja CD271+ MSCs eristettiin AT: stä, joka oli korjattu kirurgisina jätteinä. AT jauhettiin ja käsiteltiin 0: lla.3 U/ml kollagenaasia (Sigma, Dorset UK) kahden tunnin ajan 37 °C: ssa, minkä jälkeen dulbeccon muunneltua Eagle Medium-valmistetta (dmem) täydennettynä 20-prosenttisella (v/v) sikiön vasikan seerumilla (FCS) ja 1-prosenttisella (v/v) penisilliinillä ja streptomysiinillä (kaikki paa, Yeovil, Somerset, UK), ja sulatettua valmistetta sentrifugoitiin 600 grammassa 10 minuutin ajan. Saatu sakka suspendoitiin uudelleen DMEM: hen täydennettynä 10-prosenttisella (v/v) FCS: llä ja 1-prosenttisella (v/v) penisilliinillä ja streptomysiinillä eli standardiviljelyalustalla ja kulkeutui 100 µm: n solusiivilän läpi (BD Biosciences, Berkshire, UK). Suodos sentrifugoitiin uudelleen 600 grammassa 10 minuutin ajan, ja pelletoidut solut suspendoitiin uudelleen 5 ml: n standardiviljelyaineeseen ja johdettiin 40 µm: n solusiivilän läpi. Saatua solususpensiota hoidettiin sitten Erytrosyyttilyysipuskurilla (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) 10 minuutin ajan huoneenlämmössä. Kunkin valmistushetkellä MSCs eristettiin erytrosyyttilyysin jälkeen olevista mononukleaattisoluista lisäämällä niiden tarttumista kudosviljelmään plastic8 tai CD271: n immunopositiviteetti14 magneettisella liitännäissolulajittelulla (Macs). Näitä soluja kasvatettiin standardiviljelyaineessa kostutetussa ilmakehässä 37 °C: n lämpötilassa rutiininomaisella trypsiinoinnilla 80-prosenttisessa yhtymäkohdassa. Kaikissa myöhemmissä kokeissa käytettiin pa MSCs: ää ja CD271+ MSCs: ää kohdissa II-III. Virtaussytometriaa käytettiin cd271+ – solujen rikastuksen arvioimiseen (Macs-tekniikkaa käyttäen), jossa vastaeristetyt solut varastoitiin -80 °C: ssa yön yli eristyksen jälkeen, minkä jälkeen ne sulatettiin ja immunostettiin välittömästi CD271: lle; kaikkien näytteiden osalta >90% soluista oli CD271-immunopositiivisia tässä vaiheessa (tietoja ei näy).

in vitro-erilaistumisprotokollat

PA: n ja CD271+ MSCs: n erilaistumiskyky osteosyyttien, kondrosyyttien ja adiposyyttien muodostamiseksi arvioitiin edellä kuvatulla tavalla 8,45. Osteogeneesin osalta MSCs: n yksikerroksisia viljelmiä käsiteltiin 2-3 päivän välein 10 nM deksametasonilla, 50 ng/ml askorbiinihappoa ja 1 mM beetaglyserofosfaattia (kantajakontrolleihin verrattuna) 4 viikon ajan, minkä jälkeen viljelmät korjattiin kiinnittymällä ja värjättiin emäksisen fosfataasin aktiivisuuden varalta seuraavasti: solut kiinnitettiin 10-prosenttisella neutraalilla puskuriformaliinilla 10 minuutin ajan. Samaan aikaan värjäysliuosta valmistettiin sijoittamalla 25 mg naftoli-fosfaattia (naftoli AS-MX-fosfaatti: Sigma) 0,5 ml: aan dimetyyliformamidia. Tämä liuos sekoitettiin 50 ml: aan 0, 2 M Tris-HCl-puskuria, joka sisälsi 50 mg fast red TR (Sigma). Sekoittamisen jälkeen lopullinen liuos suodatettiin Whatman No. 1-suodatinpaperilla (Whatman). Fiksatiiviliuos poistettiin ja solut pestiin PBS: llä, sitten jokaiseen kaivoon lisättiin 1 ml värjäysliuosta 1 tunnin ajan. lopuksi tahra poistettiin ja digitoitiin kuvia ylösalaisin olevalla mikroskoopilla. Osteogeenisen linjan mukaista erilaistumista arvioitiin lisäksi lisäämällä alkalisen fosfataasin aktiivisuutta erilaistuneissa soluissa verrattuna erilaistumattomiin soluihin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa pakkausta (Biovision, USA) ja noudattamalla valmistajan protokollaa; lyhyesti sanottuna solut homogenoitiin määrityspuskurissa. Tämän jälkeen homogenoidut kennot sentrifugoitiin liukenemattoman aineen poistamiseksi 13 000 grammassa 3 minuutin ajan. Sitten 80 µl kutakin näytettä lastattiin 96 kaivolevyn erillisiin kaivoihin. Tämän jälkeen kuhunkin näytekuoppaan lisättiin 50 µl 5 mM: n pnpp-liuosta. Kun kuopat oli sekoitettu pipetoimalla ylös ja alas, niitä inkuboitiin 25 °C: ssa 60 minuutin ajan. Standardikäyrä luotiin laimentamalla 40 µl 5 mM pNPP: tä 160 µl: aan määrityspuskuria 1 mM: n pnpp-standardin aikaansaamiseksi. Tämän jälkeen 0, 4, 6, 12, 16 ja 20 µl tätä standardiliuosta ladattiin 96 porauslevylle, jolloin saatiin 0-20 nmol/ml pNPP-standardeja, jotka voitiin mitata spektrofotometrialla. Kondrogeneesia varten solupellettejä valmistettiin dmem/korkea glukoosi (Sigma) täydennettynä 100 nM: n deksametasonilla (DEX), 37.5 µg/ml askorbaatti-2-fosfaattia, 1% (vol/vol) insuliinia, transferriiniä ja seleeniä (ITS-X100; Sigma) ja 10 ng/ml muuntavaa kasvutekijää-β1 (TGF-β1) (PeproTech, Lontoo, UK) sekä penisilliiniä ja streptomysiiniä. Kontrolliviljelmät hoidettiin dmem: llä/korkean glukoosin elatusaineella pelkillä kantajilla eli metanolilla, steriilillä vedellä ja BSA: lla sopivilla laimennoksilla. Päivänä 28 kondrogeenista erilaistumista tutkittiin histologisesti kiinnittämällä pelletit 10-prosenttiseen neutraaliin puskuroituun formaliiniin, jonka jälkeen ne upotettiin parafiiniin ja leikattiin kudososioihin, jotka värjättiin toluidiinisinisellä (Sigma) proteoglykaanisynteesin merkkiaine8. Lisäksi differentioituvaan elatusaineeseen erittyneen glykosaminoglykaanin määrä viimeisen 24 tunnin viljelyn aikana ennen sadonkorjuuta 28.päivänä mitattiin DMMB-määrityksellä. DMMB-määritysprotokolla mukautettiin farndalen et al-menetelmän menetelmästä., 1986 seuraavina46: (i) DMMB-väriaineliuos valmistettiin lisäämällä 3.04 G glysiiniä, 2, 37 g NaCl: ää ja 16 mg 1,9 DMMB: tä 1 litraan deionisoitua vettä; ii) pH säädettiin arvoon 3, 0 suolahapolla ja väriaineliuos varastoitiin ruskeaan pulloon; iii) 50 µl solusiemennetyistä telineistä 28.päivänä korjattua viljelyainetta lisättiin kolmena kappaleena 96 kaivolevyyn; iv) 200 µl dmmb-väriaineliuosta lisättiin viljelyaineeseen ja absorbanssi arvioitiin heti 540 Nm: ssä. Hain rustosta (Sigma) saatua kondroitiinisulfaattia (CS) käytettiin absorbanssikäyrän (0-40 µg/ml, CS) määrittämiseen, josta laskettiin VILJELYAINEEN näytteiden GAG-pitoisuus. Gag-pitoisuuden absorbanssitasot viljelyliuoksesta otetuissa näytteissä normalisoitiin, jotta voidaan ottaa huomioon fenolipunan esiintymisestä viljelyliuoksessa johtuva taustaabsorbanssi liuottamalla standardit dmem-väliaineeseen. Adipogeneesiä varten MSC-viljelmiä säilytettiin 1 µM DEX, 0-pitoisissa viljelyaineissa.5 mM 3-isobutyylimetyyliksantiinia (Sigma), 1% insuliinia, transferriiniä ja seleeniä (ITS-X 100 esiseos; PAA) ja 100 µM indometasiinia (Sigma) 28 päivän ajan 37 °C: ssa ja 5% CO2: ssa, kuten edellä on kuvattu 47. Kontrollisolut säilytettiin täydellisessä väliaineessa kantajien kanssa. Erilaistumista tutkittiin käyttämällä Lipidipisaroiden Öljypunaista O-värjäystä. Solut kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuriformaliiniin 1 tunnin ajaksi, minkä jälkeen värjäysliuos lisättiin. Suhteellinen O-öljyn kertymä mitattiin 100% isopropanolikäsittelyn jälkeen 15 minuutin ajan ja supernatantin absorbanssi mitattiin spektrofotometrillä 540 nm: ssä.

MSC transplantation into a femoral osteochondral defect model

Following institutional ethical review and approval (the Institutional Animal Care and Use Committeet of Fukui University, Department of Orthopaedics and Rehabilitation Medicine: Approval Number 25-053), female athymic nude rats (F344/n Jcl rnu / rnu, Clea Japan, Inc. 6-10 viikon ikäiset ja 150-170 gramman paino jaettiin satunnaisesti seuraaviin ryhmiin: i) PA MSCs (N = 6 eläintä); ii) CD271+ MSCs (n = 6 eläintä); iii) kontrolliryhmä Alpha Chondro Shield scaffold yksinään (ei soluja, N = 3 eläintä). Näitä eläinten lukumääriä ryhmää kohti on käytetty aiemmin samassa laitoksessa osoittamaan merkittäviä eroja hoitoryhmien välillä 5 prosentin tasolla48. Rotat nukutettiin altistamalla O2-kaasussa 3% isofluraania ja O2-kaasussa 1, 5% isofluraania leikkauksen aikana. Kun polvet oli steriloitu 70-prosenttisella etanolilla, tehtiin mediaalinen parapatellaarinen ihoviilto, jonka jälkeen se leikattiin lihaksen läpi ja sitten paljastettiin polvinivel polvilumpion sivusuuntaisella sijoiltaanmenolla. Kunkin eläimen reisiluun polvilumpion uraan luotiin halkaisijaltaan 2 mm: n ja syvyydeltään 1 mm: n molemminpuoliset osteochondral-viat 2 mm: n leikkausporalla. Alpha Chondro Shieldiä käytettiin solukantajana/tukirakenteena 5 × 104 PA MSCs: n tai CD271+ MSCs versus no cells: n toimittamiseen (kontrolleina). Ennen elinsiirtoa solut kerättiin trypsiinillä ja kylvettiin 10 µl: n tilavuuteen standardiviljelyainetta Alpha Chondro Shieldin 2 mm: n läpimittaisille levyille, minkä jälkeen niitä inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä 37 °C: n ja 5%: n CO2: n lämpötilassa 30 minuutin ajan solujen kiinnittymisen edistämiseksi ja tukirakenteeseen liittämiseksi. Solunsiemen-ja säätötelineet siirrettiin vikoihin ja kiinnitettiin paikalleen fibriiniliimalla, jonka annettiin asettua noin 10-20 sekunnin ajaksi (Kuva. 6). Polvilumpio siirrettiin, ja sidekudos ja iho ommeltiin nailonsaumoilla. Eläimet saivat liikkua vapaasti toipumisen jälkeen, ja niille annettiin tavanomainen ylläpitoruokavalio ja vettä ad libinum. 3 viikkoa elinsiirron jälkeen eläimiä lopetettiin 3%: n isofluraaniyliannostuksella, jotta voitiin tutkia haavan korjaantumisen laajuus makroskooppisesti ja histologisesti.

rustohaavan paranemisen makroskooppinen pisteytys

kaksi kirurgia, jotka olivat altistaneet polvinivelen uhratuilla eläimillä, teki vian makroskooppisesti käyttäen vakiintunutta järjestelmää rustohaavan paranemisen arvioimiseksi pienemmissä eläinmalleissa49. Kudoksen korjausaste pisteytettiin 0 pisteestä (paras tulos) 4 pisteeseen (huonoin tulos) kullekin: (1) korjauskudoksen väri; (2) korjauskudoksessa Havaittujen verisuonten laajuus; (3) tasaisuus pinnan korjauskudoksen; (4) missä määrin haavan vika oli täytetty korjauskudoksen; (5) laajuus rappeutuminen viereisen nivelruston. Jokaisen kriteerin pisteet lisättiin ja parhaan korjauksen aste esitettiin alimmalla pistemäärällä 20 kokonaispisteestä.

rustohaavan paranemisen histologinen pisteytys

kirurgisen leikkauksen jälkeen eläimen polvet kiinnitettiin 10-prosenttiseen neutraaliin puskuroituun formaliiniin (Sigma) 48 tunnin ajaksi ja laitettiin k-CX-kalkittomaan liuokseen (FALMA, Tokio, Japani) 24-48 tunniksi 4 °C: ssa. Tämän jälkeen rotan polvet pestiin yön yli juoksevassa vesijohtovedessä, käsiteltiin ja upotettiin parafiinilohkoihin, jotka olivat valmiita lohkomiseen. Kudososat leikattiin 5 mikronin paksuisiksi tavallisessa pyörivässä mikrotomissa, ja ne värjättiin hematoksyliinilla ja eosiinilla (h&E) ja toluidiinisinisellä ennen asennusta DPX: ssä ja histologisessa tutkimuksessa. Kaksi tutkijaa arvioi rustokorjauksen laajuuden ja laadun histologisesti ja riippumattomasti käyttäen Wakitanin pisteytysjärjestelmää36, johon on muutettu kaksi lisäparametria, ts. tutkia läsnäolo verisuonten ja roskan jättisoluja (FBGCs). Pisteytysjärjestelmä koostui siis seitsemästä eri muuttujasta: 1) solun morfologia, 2) matriisin värjäytyminen, 3) pinnan säännöllisyys, 4) ruston paksuus, 5) korjauskudoksen integrointi isäntärustoon, 6) verisuonittumisen laajuus viassa, 7) fbgc-reaktion laajuus. Kunkin parametrin osalta alin pistemäärä (0) edusti ”parasta” korjausta ja korkein pistemäärä (4) ”huonointa” korjausta. Kokonaispisteet lisättiin ja sitten vertailtiin ryhmien välillä kokonaispisteistä 21.

ihmisen mitokondrioantigeenin immunohistokemia

Kudososiot värjättiin anti-human mitokondrioantigeenin (HMA) vasta-aineella (klooni 113-1: Abcam, Cambridge, UK) ihmisen MSC: n esiintymisen arvioimiseksi. Antigeenin hakemisen jälkeen osat upotettiin kolmeen PBS: n muutokseen ja estettiin 20 minuutin ajan 2, 5%: n hevosseerumilla (Vector Labs Ltd) huoneenlämmössä epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi. Tämän jälkeen osat inkuboitiin hiiren anti-HMA-vasta-aineella (1:400 laimennettuna PBS: ssä) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä kostutetussa kammiossa. Tämän jälkeen sitoutumaton vasta-aine pestiin pois kolmessa PBS: n muutoksessa varovasti ja osioita inkuboitiin biotinyloidulla anti-hiiri-IgG: llä 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Osat pestiin kolme kertaa PBS: llä ja endogeeninen peroksidointi estettiin käyttämällä 0,3-prosenttista vetyperoksidia metanolissa 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tämän inkubaatiovaiheen aikana valmistettiin Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, UK), jonka annettiin seistä 30 minuuttia ennen käyttöä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Endogeenisen peroksidisen aktiivisuuden estämisen jälkeen osat pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin ABC-reagenssilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä. Tämän jälkeen lisättiin Dab-kromogeeni (Vector labs) 6-8 minuutiksi halutun värin voimakkuudesta riippuen. Tämän jälkeen osat pestiin ja dehydratoitiin etanolisarjalla (70-100%), puhdistettiin ksyleenillä ja asennettiin Pertexiin. Chondrogenic pelletti ihmisen MSCs käytettiin positiivinen kontrolli. Negatiivinen kontrolli sisälsi kondrogeenisen pelletin, jossa ensisijainen vasta-aine jätettiin pois.

Pyyhkäisyelektronimikroskopia

Alfa-Kondronisuojatelineeseen ennen implantaatiota kylvettyjen MSCs: n kiinnittymistä tutkittiin pyyhkäisyelektronimikroskopialla (sem) seuraavasti: sen jälkeen, kun soluun kylvettyjä tukirakenteita oli inkuboitu kostutetussa ilmakehässä 37 °C: ssa ja 5% CO2: ssa 30 minuutin ajan, ne pestiin PBS: ssä, minkä jälkeen ne oli kiinnitetty 2-prosenttiseen glutaarialdehydiin 0, 1 M: n fosfaattipuskurissa (pH 7, 4) 2 tunnin ajan, minkä jälkeen ne pestiin 0: ssa.1 M fosfaattipuskuria ennen käsittelyä 1% osmiumtetraoksidilla 1 tunnin ajan. Tämän jälkeen näytteet dehydratoitiin etanoliliuoksella, käsiteltiin siirtymäliuottimella, t-butyylialkoholilla 30 minuutin ajan, kylmäkuivattiin, pinnoitettiin kullalla palladiumilla ja lopuksi kuvattiin JSM-6390: lla (JEOL, Tokio, Japani) tai Zeiss EVO10-pyyhkäisyelektronimikroskoopilla (Carl Zeiss, Cambridge, UK).

LIVE/DEAD staining to assay solukelpoisuus in cell-seeded telineet

MSC-seeded telineet värjättiin LIVE / DEAD staining solution in the cell-seeded telineet was distinced with LIVE / DEAD staining solution in the manufacturer ’ s protocol, as described previous8. Kennoon kylvetyt telineet upotettiin hetkeksi elävään / kuolleeseen värjäysliuokseen 30 minuutiksi pimeässä 37 °C: ssa.sen jälkeen telineet poistettiin värjäysliuoksesta, pestiin PBS: llä ja kuvattiin välittömästi konfokaalimikroskoopilla (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS).

in vitro angiogeneesimääritykset

ihmisen EA.hy926-endoteelisolulinjaa käytettiin mallina tutkittaessa pa MSC: n ja CD271+ MSC CM: n viljellyn väliaineen angiogeenistä aktiivisuutta. EA.hy926 endoteelisolujen proliferaatiota/migraatiota ja endoteelitubulusten muodostumista tutkittiin seuraavasti: i) EA.hy926-soluja viljeltiin standardiviljelyaineessa (dmem / F-12 täydennettynä 10% FBS: llä, 1% penisilliinillä ja streptomysiinillä) 24 kaivolevyllä 2 päivän ajan, kunnes muodostui 100% yhdistelmäkerroksia. Steriilillä pipetin kärjellä tehtiin naarmu yksikerroksiseen. Tämän jälkeen kuopat pestiin steriilillä PBS: llä ja sen jälkeen jokaiseen kolmikerroksiseen kuoppaan lisättiin 1 ml pa MSC-viljelmistä tai CD271+ MSC-viljelmistä saatua ehdollistettua väliainetta testattua tilaa kohden. Kontrollina käytettiin seerumitonta DMEM-viljelyainetta. Levy inkuboitiin Cell IQ-alustalla elävien solujen digitoitua kuvantamista varten 2 päivän ajan, minkä jälkeen naarmujen sulkeutuminen, elinkelpoisten solujen määrä ja yksittäisten solujen migraation laajuus kvantitoitiin solun IQ-kuvaanalyysiohjelmiston avulla. EA: n proliferatiivinen vaste.hy926 endoteelisolut pa MSC: hen ja CD271+ MSC: hen ehdollistettuun väliaineeseen (verrattuna seerumista vapaaseen kontrolliaineeseen) tutkittiin myös MTT-määrityksellä; ii) EA.hy926 endoteelin tubulusmuodostusta testattiin kasvutekijävähennetyllä Matrigelilla (BD Bioscience), joka allikoitiin 96-kuoppalevyihin (50 µl Matrigeliä/kuoppa) ja inkuboitiin 30 min 37 °C: ssa.EA.hy926-endoteelisolut kylvettiin Matrigeliin 2 × 104 solussa/kuoppa 200 µl: ssa pa MSC: tä ja CD271+ MSC: tä ehdollistetussa väliaineessa tai seerumittomassa kontrolliviljelyaineessa. Levyjä inkuboitiin 37 °C: ssa 1 päivä, jonka jälkeen ne kuvattiin Cell IQ-kuvantamisalustalla (3 kuvaa kaivoa kohti). Endoteelin tubuluksen kokonaispituus / kuva ja endoteelin tubuluksen haarautumispisteiden/kuvan kokonaismäärä mitattiin Cell IQ image analyser-ohjelmistolla.

tilastoanalyysi

tilastoanalyysi tehtiin käyttäen Grappad Prism6-ohjelmistoa (Grappad Software, Inc. CA, YHDYSVALLAT). In vivo-kokeissa testattiin vähintään N = 3 eläintä tilaa kohti. In vitro-kokeissa N = 3-4 riippumatonta koetta tehtiin kaikille analyyseille, joissa tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVALLA, kun oli yksi muuttuva tekijä, ja kaksisuuntaisella ANOVALLA, kun oli kaksi muuttuvaa tekijää. Makroskooppisten ja histologisten ruston korjauspisteiden osalta ryhmien välisiä eroja tutkittiin Dunnin monivertailutesteillä. Alle 0,05: n p-arvoa pidettiin merkittävänä. Kaikki tiedot on esitetty menetelminä ± SEMs tai ± SDs (kuten kuvassa legendat).