Todos los métodos en estudios en humanos y animales se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones institucionales pertinentes.

Aislamiento y cultivo de MSC adherentes plásticas y MSC inmunopositivas CD271 de tejido adiposo

Tras la aprobación ética de la Autoridad de Investigación en Salud del Servicio Nacional de Salud (NHS) (número LREC 12/EE/0136) y el consentimiento informado de todos los donantes, se aislaron MSC de PA y MSC CD271+ de AT que se habían cosechado como productos de desecho quirúrgico. El AT fue picado y tratado con 0.3 U / ml de colagenasa (Sigma, Dorset UK) durante dos horas a 37 °C, después de lo cual se añadió el Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal de ternera (FCS) al 20% (v/v) y penicilina y estreptomicina al 1% (v/v) (Todos de PAA, Yeovil, Somerset, UK) y la preparación digerida se centrifugó a 600 g durante 10 minutos. El pellet resultante se resuspendió en DMEM suplementado con FCS al 10% (v/v) y penicilina y estreptomicina al 1% (v/v), es decir, medio de cultivo estándar, y se pasó a través de un colador celular de 100 µm (BD Biosciences, Berkshire, Reino Unido). El filtrado se centrifugó de nuevo a 600 g durante 10 minutos y las células peletizadas se volvieron a suspender en un medio de cultivo estándar de 5 ml y se pasaron a través de un colador de células de 40 µm. La suspensión celular resultante se trató con Tampón de Lisis de Eritrocitos (Miltenyi Biotech, Surrey, Reino Unido) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para cada preparación AT, se aislaron CMM de las células mononucleadas presentes después de la lisis de eritrocitos a través de su mayor adhesión al plástico de cultivo de tiso8 o mediante clasificación de células asociadas magnéticas (MAC) para inmunopositividad a CD27114. Estas células se expandieron en medio de cultivo estándar en una atmósfera humidificada a 37 °C con paso de rutina por tripsinización a una confluencia del 80%. Las MSC de PA y las MSC CD271+ en los pasajes II-III se utilizaron para toda la experimentación posterior. Se utilizó citometría de flujo para evaluar el enriquecimiento de células CD271+ (utilizando la tecnología MACS), donde las células recién aisladas se almacenaron a -80 °C durante la noche después del aislamiento, y luego se descongelaron e inmunotinaron inmediatamente para CD271; para todas las muestras, >el 90% de las células eran inmunopositivas para CD271 en este momento (no se muestran datos).

Protocolos de diferenciación in vitro

La capacidad de diferenciación de las CMM de PA y CD271+ para formar osteocitos, condrocitos y adipocitos se evaluó como se describió previamente8,45. Brevemente, para la osteogénesis, los cultivos monocapa de CMM se trataron con dexametasona de 10 nM, ácido ascórbico de 50 ng/ml y glicerofosfato beta de 1 mM (versus controles portadores) cada 2-3 días durante un período de 4 semanas, después de lo cual los cultivos se recolectaron por fijación y se teñieron para la actividad de la fosfatasa alcalina de la siguiente manera: las células se fijaron con formalina tampón neutral al 10% durante 10 minutos. Mientras tanto, la solución de tinción se preparó colocando 25 mg de fosfato de naftol (fosfato de naftol AS-MX: Sigma) en 0,5 ml de dimetil formamida. Esta solución se mezcló con 50 ml de tampón Tris-HCl de 0,2 m que contenía 50 mg de TR rojo rápido (Sigma). Después de mezclar bien, la solución final se filtró con papel de filtro Whatman No.1 (Whatman). Luego se retiró la solución fijadora y se lavaron las células con PBS, luego se agregó 1 ml de la solución de tinción a cada pocillo durante 1 hora. Finalmente, se eliminó la mancha y se capturaron imágenes digitalizadas con un microscopio invertido. La diferenciación a lo largo del linaje osteogénico se evaluó mediante el aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina en células diferenciadas en comparación con células indiferenciadas utilizando un kit disponible comercialmente (Biovision, EE.UU.) y siguiendo el protocolo del fabricante; en resumen, las células se homogeneizaron en el tampón de ensayo. Las células homogeneizadas se centrifugaron para eliminar el material insoluble a 13.000 g durante 3 minutos. A continuación, se cargaron 80 µl de cada una de las muestras en pocillos separados de una placa de 96 pocillos. A continuación, se añadieron 50 µl de solución de pNPP de 5 mm a cada pocillo de muestra. Después de un paso de mezcla por pipeteo hacia arriba y hacia abajo, los pozos se incubaron a 25 °C durante 60 minutos. Se generó una curva estándar diluyendo 40 µl de 5 mm de pNPP en 160 µl de tampón de ensayo para generar 1 mm de pNPP estándar. Luego, se cargaron 0, 4, 6, 12, 16 y 20 µl de esta solución patrón en una placa de 96 pocillos para generar estándares pNPP de 0-20 nmol/ml que podrían medirse por espectrofotometría. Para la condrogénesis, se prepararon gránulos celulares en DMEM / glucosa alta (Sigma) suplementados con dexametasona de 100 nM (DEX), 37.5 µg/ml de ascorbato-2-fosfato, insulina al 1% (vol/vol), transferrina y selenio (ITS-X100; Sigma) y 10 ng/ml de factor de crecimiento transformador-β1 (TGF-β1) (PeproTech, Londres, Reino Unido), y penicilina y estreptomicina. Los cultivos control se trataron con DMEM / medios de glucosa altos con portadores solos, es decir, metanol, agua estéril y ASC a diluciones apropiadas. En el día 28, se examinó histológicamente la diferenciación condrogénica fijando los gránulos en formalina tamponada neutra al 10%, luego se incrustó en parafina y cortes de tejido, que se teñieron con azul de toluidina (Sigma) como marcador de la síntesis de proteoglicanos8. Además, el nivel de glicosaminoglicano secretado en el medio de diferenciación en las últimas 24 horas de cultivo antes de la cosecha en el día 28 se midió utilizando el ensayo DMMB. El protocolo de ensayo de DMMB se adaptó del método de Farndale et al., 1986 como sigue 46: (i)la solución de tinte DMMB se preparó añadiendo 3.04 g de glicina, 2,37 g de NaCl y 16 mg de 1,9 DMMB a 1 litro de agua desionizada; ii) el pH se ajustó a 3,0 con ácido clorhídrico y la solución de tinte se almacenó en una botella marrón; iii) se añadieron por triplicado a una placa de 96 pocillos 50 µl de solución de tinte DMMB al medio de cultivo y la absorbancia se evaluado a 540 nm inmediatamente. Se utilizó sulfato de condroitina (CS) de cartílago de tiburón (Sigma) para proporcionar una curva estándar de absorbancia (0-40 µg/ml, CS) a partir de la cual se calculó el contenido de mordaza en las muestras de medio de cultivo. Los niveles de absorbancia para el contenido de mordaza en las muestras de medio de cultivo se normalizaron para tener en cuenta la absorbancia de fondo resultante de la presencia de rojo fenólico dentro del medio disolviendo los estándares en medio DMEM. Para la adipogénesis, los cultivos MSC se mantuvieron en medios de cultivo que contenían 1 µM DEX, 0.5 mm 3-isobutil-metilxantina (Sigma), 1% de insulina, transferrina y selenio (premezcla ITS-X 100; PAA) y 100 µM de indometacina (Sigma), durante 28 días a 37 °C y 5% de CO2, como se describió previamente47. Las células de control se mantuvieron en soportes completos con portadores. Se examinó la diferenciación mediante tinción de gotitas lipídicas con Rojo oleoso. Las células se fijaron en formalina tampón neutra al 10% durante 1 hora, después de lo cual se añadió la solución de tinción. Se midió la acumulación relativa de aceite rojo O después del tratamiento con isopropanol al 100% durante 15 minutos y se leyó la absorbancia del sobrenadante a 540 nm utilizando un espectrofotómetro.

Trasplante de MSC en un modelo de defecto osteocondral femoral

Tras la revisión y aprobación ética institucional (Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fukui, Departamento de Ortopedia y Medicina de Rehabilitación: Número de aprobación 25-053), ratas desnudas atímicas (F344/N Jcl rnu/rnu, CLEA Japan, Inc. Tokio, Japón), de 6 a 10 semanas de edad y un peso de 150 a 170 gramos, se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos: i) MSC PA (n = 6 animales); ii) MSC CD271+ (n = 6 animales); iii) un grupo de control de armazón de Escudo Alfa Condro solo (sin células, n = 3 animales). Estos números de animales por grupo se han utilizado previamente en el mismo instituto para demostrar diferencias significativas entre los grupos de tratamiento al nivel del 5% 48. Las ratas fueron anestesiadas por exposición al 3% de isoflurano en gas O2 y mantenidas al 1,5% de isoflurano en gas O2 durante la cirugía. Después de esterilizar las rodillas con etanol al 70%, se realizó una incisión en la piel parapatelar medial, seguida de una disección a través del músculo y luego de exponer la articulación de la rodilla mediante dislocación lateral de la rótula. Se crearon defectos osteocondrales bilaterales de 2 mm de diámetro y 1 mm de profundidad en el surco rotuliano del fémur de cada animal utilizando un taladro quirúrgico de 2 mm de diámetro. El blindaje de Condro alfa se utilizó como soporte/armazón celular para administrar CMM de 5 × 104 PA o CMM CD271+ frente a células sin células (como controles). Antes del trasplante, las células se recolectaron por tripsinización y se sembraron en un volumen de 10 µl de medio de cultivo estándar en discos de 2 mm de diámetro de Escudo de Condro alfa, luego se incubaron en una atmósfera humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 minutos para promover la adherencia celular y la incorporación al armazón. Los armazones de células sembradas y de control se trasplantaron en los defectos y se fijaron en su lugar con pegamento de fibrina, que se dejó fijar durante unos 10-20 segundos (Fig. 6). La rótula fue reubicada, y el tejido conectivo y la piel suturados con suturas de nylon. Se permitió que los animales se movieran libremente después de la recuperación y se les alimentó con una dieta de mantenimiento estándar y agua ad libinum. A las 3 semanas después del trasplante, los animales fueron sacrificados por sobredosis de isoflurano al 3% para examinar la extensión de la reparación de heridas macroscópica e histológicamente.

Puntuación macroscópica de la cicatrización de heridas de cartílago

Después de exponer la articulación de la rodilla en animales sacrificados, el defecto fue puntuado macroscópicamente por dos cirujanos que estaban ciegos al brazo de tratamiento utilizando un sistema establecido para evaluar la cicatrización de heridas de cartílago en modelos de animales más pequeños49. El grado de reparación del tejido se valoró de 0 puntos (mejor resultado) a 4 puntos (peor resultado) cada uno para: (1) el color del tejido reparador; (2) la extensión de los vasos sanguíneos observados dentro del tejido reparador; (3) la suavidad de la superficie del tejido reparador; (4) el grado en que el defecto de la herida se llenó de tejido reparador; (5) el grado de degeneración del cartílago articular adyacente. Se agregaron los puntos anotados para cada criterio y se representó el grado de mejor reparación con la puntuación más baja de un puntaje total de 20.

Puntuación histológica de la cicatrización de heridas de cartílago

Después de la escisión quirúrgica, las rodillas de los animales se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% (Sigma) durante 48 horas y se colocaron en solución descalcificadora K-CX (FALMA, Tokio, Japón) durante 24-48 horas a 4 °C. Después de esto, las rodillas de rata se lavaron durante la noche en agua corriente del grifo, se procesaron y se incrustaron en bloques de cera de parafina listos para seccionar. Se cortaron secciones de tejido a un grosor de 5 micras en un microtomo rotativo estándar y se teñieron con hematoxilina y eosina (H&E) y azul de toluidina antes del montaje en DPX y el examen histológico. La extensión y la calidad de la reparación del cartílago fueron evaluadas de forma histológica e independiente por dos examinadores utilizando el sistema de puntuación Wakitani36, modificado para incluir dos parámetros adicionales, i. e. para examinar la presencia de vasos sanguíneos y células gigantes de cuerpo extraño (FBGCs). Por lo tanto, el sistema de puntuación constaba de siete parámetros diferentes: (1) morfología celular; (2) tinción de la matriz; (3) regularidad de la superficie; (4) grosor del cartílago; (5) integración del tejido reparador con el cartílago huésped; (6) grado de vascularización dentro del defecto; (7) grado de reacción de FBGC. Para cada uno de estos parámetros, la puntuación más baja (0) representaba la «mejor» reparación y una puntuación más alta (4) representaba la «peor» reparación. Las puntuaciones generales se añadieron y luego se compararon entre los grupos de una puntuación total de 21.

Inmunohistoquímica para antígeno mitocondrial humano

Las secciones de tejido se teñieron con un anticuerpo anti-antígeno mitocondrial humano (HMA) (Clon 113-1: Abcam, Cambridge, Reino Unido) para evaluar la presencia de CMM humanas. Después de la recuperación del antígeno, las secciones se sumergieron en tres cambios de PBS y se bloquearon durante 20 minutos con suero de caballo al 2,5% (Vector Labs Ltd) a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica. Las secciones se incubaron con el anticuerpo anti-HMA de ratón (1:400 diluciones en PBS) durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Después de esto, cualquier anticuerpo no unido se lavó suavemente en tres cambios de PBS y las secciones se incubaron con IgG anti-ratón biotinilada durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron tres veces en PBS y la actividad de peroxidación endógena se bloqueó utilizando peróxido de hidrógeno al 0,3% en metanol durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante esta etapa de incubación, el Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, Reino Unido) se preparó y se dejó reposar durante 30 minutos antes de su uso según las instrucciones del fabricante. Después de bloquear la actividad de peroxidación endógena, las secciones se lavaron en tres veces PBS y se incubaron con el reactivo ABC durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadió un cromógeno DAB (Vector labs) durante 6-8 minutos, dependiendo de la intensidad del color deseado. Las secciones se lavaron y deshidrataron a través de series de etanol (70-100%), se eliminaron con xileno y se montaron en Pertex. Como control positivo se utilizó pellets condrogénicos de CMM humanas. El control negativo incluyó pellets condrogénicos en los que se omitió el anticuerpo primario.

Microscopía electrónica de barrido

La adhesión de las MSC sembradas en el armazón de Blindaje Alfa Condro antes de la implantación se examinó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) de la siguiente manera: después de que los armazones sembrados en células se incubaron en una atmósfera humidificada a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 minutos, se lavaron en PBS y luego se fijaron en glutaraldehído al 2% en tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7,4) durante 2 horas, luego se lavaron en 0.Tampón de fosfato de 1 M antes del tratamiento con tetraóxido de osmio al 1% durante 1 hora. Las muestras se deshidrataron a través de una serie graduada de solución de etanol, se trataron con disolvente de transición, alcohol t-butílico durante 30 minutos, se liofilizaron, se cubrieron con paladio dorado y finalmente se tomaron imágenes con un microscopio electrónico de barrido JSM-6390 (JEOL, Tokio, Japón) o Zeiss EVO10 (Carl Zeiss, Cambridge, Reino Unido).

Tinción VIVA / MUERTA para evaluar la viabilidad celular en andamios sembrados con células

Los andamios sembrados con MSC se teñieron con solución de tinción VIVA/MUERTA siguiendo el protocolo del fabricante, como se describió previamente8. Brevemente, los andamios sembrados con células se sumergieron en la solución de tinción VIVA/MUERTA durante 30 minutos en la oscuridad a 37 °C. Luego, los andamios se retiraron de la solución de tinción, se lavaron en PBS y se tomaron imágenes de inmediato con un microscopio confocal (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS).

Ensayos de angiogénesis in vitro

La EA humana.la línea celular endotelial hy926 se utilizó como modelo para examinar cualquier actividad angiogénica del medio condicionado de cultivo de AP MSC y CD271 + MSC CM. EA.la proliferación/migración de células endoteliales hy926 y la formación de túbulos endoteliales se examinaron de la siguiente manera: (i) EA.las células hy926 se cultivaron en medio de cultivo estándar (DMEM / F-12 suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina) en placas de 24 pocillos durante 2 días hasta que se formaron monocapas confluentes al 100%. Se utilizó una punta de pipeta estéril para hacer un rasguño en la monocapa. Posteriormente, los pozos se lavaron con PBS estéril y luego se agregó 1 ml de medio acondicionado de cultivos MSC de PA o cultivos MSC CD271+ a cada uno de los pozos triplicados por condición analizada. Se utilizó un medio de cultivo DMEM libre de suero como control. La placa se incubó en la plataforma Cell IQ para la obtención de imágenes digitalizadas de células vivas durante un período de 2 días, después de lo cual se cuantificaron el cierre de la herida por rasguño, los números de células viables y el alcance de la migración de células individuales utilizando el software de análisis de imágenes Cell IQ. La respuesta proliferativa de la EA.también se examinaron células endoteliales hy926 a medios condicionados MSC para PA y MSC CD271+ (versus medio de control sin suero) utilizando el ensayo MTT; ii) EA.la formación de túbulos endoteliales hy926 se probó utilizando un Matrigel con factor de crecimiento reducido (BD Bioscience), que se aliquotó en placas de 96 pocillos (Matrigel de 50 µl/pocillo) y luego se incubó durante 30 min a 37 °C. EA.las células endoteliales hy926 se sembraron en el Matrigel a 2 × 104 células/pocillo en 200 µl de medios acondicionados MSC y MSC CD271+ o medio de cultivo de control sin suero. Las placas se incubaron a 37 °C durante 1 día, después de lo cual se tomaron imágenes utilizando la plataforma de imágenes Cell IQ (3 imágenes por pocillo). La longitud/imagen total del túbulo endotelial y el número total de puntos de ramificación/imagen del túbulo endotelial se midieron utilizando el software Cell IQ image analyser.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism6 (GraphPad Software, Inc. CA, USA). Para los experimentos in vivo, se probó un mínimo de n = 3 animales por condición. Para los experimentos in vitro, se realizaron n = 3-4 experimentos independientes para todos los análisis, donde los datos se analizaron con ANOVA unidireccional cuando había un factor variable, y ANOVA bidireccional cuando había dos factores variables. Para las puntuaciones macroscópicas e histológicas de reparación de cartílago, se examinaron las diferencias entre los grupos utilizando las pruebas de comparación múltiple de Dunn. Se consideró significativo un valor de p inferior a 0,05. Todos los datos se han presentado como medias ± SEMs o medias ± SDs (como se indica en las leyendas de las figuras).