Resumen
La presión creciente de la vida social moderna intensifica el impacto del estrés en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, que incluyen la trombosis venosa profunda (TVP). La denervación simpática renal se ha aplicado como uno de los abordajes clínicos para el tratamiento de la hipertensión resistente a los medicamentos. Además, la estrecha relación entre el estrés oxidativo y las enfermedades cardiovasculares ha sido bien documentada. El presente estudio está diseñado para explorar el mecanismo por el cual el sistema nervioso simpático renal y el estrés oxidativo afectan el sistema de coagulación de la sangre en el desarrollo de la TVP. Se aplicó un modelo de choque crónico de pies en ratas para imitar un estado de estrés fisiológico similar al de los humanos. Nuestros resultados mostraron que el procedimiento de choque crónico del pie podría promover la TVP, que puede ser a través de la activación de la agregación de plaquetas. El empeoramiento de la TVP y la activación de las plaquetas se aliviaron con denervación simpática renal o tratamiento antioxidante (Tempol). Al mismo tiempo, el tratamiento de denervación también podría reducir los niveles de factores de oxidación circulantes en ratas. Estos resultados demuestran que tanto el sistema nervioso simpático renal como el estrés oxidativo contribuyen al desarrollo de la TVP en respuesta al estrés crónico, lo que puede proporcionar una estrategia novedosa para el tratamiento de pacientes con TVP en la clínica.
1. Introducción
La trombosis venosa profunda (TVP) es una secuela común asociada a la enfermedad cardiovascular, la embolia pulmonar, que es la tercera causa más común de muerte por enfermedades cardiovasculares después de un ataque cardíaco y un accidente cerebrovascular. Un flujo sanguíneo lento, daño en la pared venosa y un estado hipercoagulable son los tres principales factores de riesgo para el desarrollo de TVP. En consecuencia, los anticoagulantes y los trombolíticos son los dos tratamientos principales para los pacientes clínicos de TVP. La tríada de factores de riesgo que predisponen a la formación de trombo, postulada por Virchow, incluye cambios en la relación entre los componentes sanguíneos, la integridad de la pared del vaso y la tasa de flujo sanguíneo. El sistema de coagulación de la sangre juega un papel clave en la protección de los mamíferos contra el sangrado letal. En todas las formas de trombosis, la coagulación y la inflamación son las dos vías principales que actúan juntas para coordinar las respuestas del cuerpo a la lesión .
En las últimas décadas, los factores psicológicos, como el estrés y la depresión, se han reconocido como factores importantes que afectan a la salud humana . Largos períodos de ansiedad inducirán el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. Además, al ocurrir simultáneamente, la depresión y la ansiedad agravarán aún más el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. Además, se ha demostrado que el estrés y otros factores psicológicos están estrechamente relacionados con la aparición de ictus e infarto de miocardio . Numerosos estudios también han demostrado que el estrés puede causar daños estructurales duraderos a tejidos y órganos . El procedimiento de choque eléctrico crónico del pie se ha caracterizado como un modelo de estrés psicológico incontrolable e impredecible , que ha demostrado ser capaz de inducir el aumento de la presión arterial sistólica . Sin embargo, todavía no hay informes relacionados con los efectos del shock crónico en el desarrollo de TVP.
El papel del nervio renal simpático en el desarrollo de hipertensión ha sido demostrado tanto en observaciones experimentales como clínicas . Hay dos tipos de nervio renal simpático: nervios aferentes renales y nervio eferente renal. Las fibras simpáticas aferentes se originan en los riñones y, al modular el flujo simpático central, modifican directamente la hipertensión neurogénica. Al mismo tiempo, el nervio eferente mejora la retención de sodio y agua, estimula la liberación de renina y altera el flujo sanguíneo renal . De esta manera, la presión arterial a corto y largo plazo podría verse influenciada por el nervio simpático renal . Estudios clínicos han reportado los efectos beneficiosos de la denervación simpática renal en pacientes con hipertensión refractaria . Además del efecto reductor de la denervación en la presión arterial, también se han reportado beneficios adicionales en enfermedades cardiovasculares, diabetes , disfunción renal, hipertrofia cardíaca , insuficiencia cardíaca y arritmias . La hipertensión, un factor de riesgo importante para muchas enfermedades, puede aumentar la disfunción endotelial y promover la trombosis, y también está estrechamente relacionada con la incidencia de enfermedades vasculares cardiocerebrales . Por lo tanto, la denervación simpática renal puede proporcionar una nueva estrategia en la prevención y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares en condiciones de alto estrés.
Recientemente, los experimentos muestran que el estrés oxidativo podría ser responsable del cambio en la función endotelial . El aumento de las especies reactivas de oxígeno producidas por el endotelio vascular y las células sanguíneas circulantes perjudicará las funciones de barrera vasomotora y endotelial y mejorará la formación de trombo . También se encontró que el estrés oxidativo era un determinante de la activación plaquetaria, que era el factor de riesgo de aterotrombosis. Sin embargo, todavía se desconoce si el estrés crónico podría afectar el sistema de coagulación al aumentar el estrés oxidativo.
Actualmente, no hay informes que vinculen directamente el estrés psicológico con el sistema de coagulación y las enfermedades vasculares cardiocerebrales. Considerando que la activación del sistema de coagulación tiene una influencia importante tanto en la hemostasia fisiológica como en la trombosis patológica , aplicamos el modelo de estrés por choque de pies en ratas para explorar si la crónica podría afectar el desarrollo de la TVP y los posibles mecanismos involucrados.
2. Materiales y Métodos
2.1. En este estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho de diez semanas de edad, obtenidas del Centro de Animales de Laboratorio de Shanghai. Los animales se mantuvieron en un ambiente con temperatura controlada de 25 ° C con un ciclo de luz y oscuridad de 12 : 12 horas. Las ratas expuestas al protocolo de estrés se colocaron individualmente en una caja de estrés de choque de pies, donde recibieron una sesión de 4 horas de choque eléctrico de pies a través de un piso de rejilla electrificada que proporcionaba un choque de 0,15 mA de 5 segundos de largo cada 30 segundos. El nervio simpático renal de rata fue cortado quirúrgicamente mientras los animales estaban bajo anestesia inducida por hidrato de cloral al 10%. Después de un período de recuperación de una semana, se inició el protocolo de choque de pies. Se administró Tempol (10 mg/kg/día) por inyección intraperitoneal después del inicio del protocolo de estrés . La trombosis venosa se indujo en condiciones de anestesia con hidrato de cloral al 10%, como describió previamente Leung . Brevemente, se abrió el abdomen, y la vena cava inferior (IVC), después de separarse cuidadosamente de los tejidos circundantes, se ligó firmemente justo debajo de la vena renal izquierda con un hilo de algodón. Luego, se cerró el abdomen con una doble capa de suturas, cerrando el peritoneo primero con los músculos y luego la piel por separado. Al cabo de doce horas, se anestesió de nuevo a los animales, se reabrió el abdomen y se recogieron el plasma y el trombo para su posterior análisis . El presente estudio se realizó de conformidad con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para Experimentación y Otros Fines Científicos (número 123 del Consejo de Europa, Estrasburgo, 1985). Todos los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por la Universidad de Soochow y realizados de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales establecidas por la Universidad de Soochow.
2.2. Las mediciones de los niveles plasmáticos de corticosterona
Se midieron utilizando un kit de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) disponible en el mercado (TSZ Elisa, EE. UU.).
2.3. Mediciones de peso del trombo
De la cavidad abdominal reabierta, se extrajo el segmento ligado de la vena cava y se abrió longitudinalmente para eliminar el trombo formado, que se enjuagó y pesó en papel de filtro.
2.4. El análisis de los Parámetros de coagulación sanguínea
El tiempo de protrombina (PT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (APPT) y el tiempo de trombina (TT) se midieron mediante un analizador automatizado de coagulación sanguínea (Sysmex Corporation CA-50, Japón). De la cavidad abdominal reabierta, se recogió sangre (4,5 ml) de la vena cava inferior utilizando una jeringa desechable, que contenía 0,5 ml de una solución de citrato de sodio al 3,8%, y se transfirió a tubos de centrífuga autoclavados. La mitad de la sangre se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos y se recogió el suero. Se combinó una alícuota sérica de 0,1 ml para obtener 0.1 mL de reactivo PT. Después del precalentamiento durante 20 min, el TP se midió utilizando un analizador automático de coagulación sanguínea, como se mencionó anteriormente. El APPT y el TT se midieron utilizando el mismo método que el TP.
La agregación plaquetaria se midió mediante un analizador de agregación plaquetaria (Chrono-Log 560 Ca, Alemania). Después de la reapertura de la cavidad, se recogieron 4,5 ml de sangre de la vena cava inferior utilizando una jeringa desechable con 0,5 ml de citrato de sodio (3,8%) y luego se transfirieron al tubo de centrífuga. La segunda mitad de la sangre se centrifugó a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener el plasma rico en plaquetas. La sangre que quedaba en el tubo se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos para preparar el plasma pobre en plaquetas. Luego, se estimuló la coagulación de las muestras de plasma utilizando proteína de colágeno y adenosina difosfato disódico (ADP) (1 mm, 10 ml) como agonistas plaquetarios.
2.5. Determinación de la Concentración plasmática de noradrenalina (NA)
Los niveles plasmáticos de noradrenalina (NA) se midieron utilizando un kit de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) disponible en el mercado (TSZ Elisa, EE.UU.).
2.6. Se midieron los Niveles de Peroxidación Lipídica y la actividad plasmática de Superóxido Dismutasa (SOD) y Glutatión Peroxidasa (GSH-Px)
La actividad plasmática de SOD y GSH-Px y los niveles de peroxidación lipídica (sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico, TBARS) utilizando kits de ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) disponibles en el mercado (TSZ Elisa, EE.UU.).
2.7. Análisis estadísticos
Todos los datos fueron presentados como media ± MEM. La significación estadística de las comparaciones entre más de dos grupos se evaluó mediante un ANOVA bidireccional seguido del test de Newman-Keuls o mediante un test de Student de dos colas no emparejado. los valores < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
3. Resultados
3.1. El efecto del Shock, la Denervación y el Tratamiento con Tempol sobre las Concentraciones Plasmáticas de Corticosterona
Los niveles plasmáticos de corticosterona (el marcador de estrés) aumentaron notablemente en el grupo de choque de pie en comparación con el grupo control (, Figura 1) y se suprimieron notablemente tanto en el grupo de denervación más choque como en el de Tempol más choque en comparación con el grupo de choque de pie solo (, Figura 1). Este resultado indicó que el choque crónico del pie aumentó significativamente la corticosterona plasmática cuando el cuerpo estaba bajo estrés, y tanto la denervación como el tratamiento con Tempol podrían aliviar el estado de estrés.
3.2. El efecto del Shock, la Denervación y el Tratamiento con Tempol sobre el Peso de los trombos Inducidos por Ligadura IVC
Los trombos se recogieron 12 horas después de la ligadura IVC y se ponderaron. En el grupo de choque de pie, el peso del trombo aumentó significativamente en comparación con el del grupo control (, Figura 2). Sin embargo, el peso del trombo de los grupos de denervación más choque y Tempol más choque se mantuvo sin cambios en comparación con los trombos del grupo control, pero disminuyó significativamente en comparación con los trombos del grupo de choque del pie (, Figura 2). Estos resultados sugieren que el shock crónico podría facilitar la formación de TVP, mientras que tanto la denervación como el tratamiento con Tempol podrían inhibir el aumento de la formación de TVP inducido por el estrés.
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3.3. El efecto del Shock, la Denervación y el Tratamiento con Tempol sobre los Parámetros de Coagulación Sanguínea
Se midieron los parámetros sanguíneos (PT, APPT, TT y agregación plaquetaria) Después de la extracción de sangre de la IVC. Hubo una diferencia significativa en los parámetros de TP, TT y agregación plaquetaria entre el grupo control y el grupo de choque de pie. El TP del grupo de choque de pie fue menor que el del grupo control; sin embargo, el TT y los parámetros de agregación plaquetaria fueron mayores en el grupo de choque de pie en comparación con el grupo control. Paralelamente, se observó una disminución significativa en los parámetros de TT y agregación plaquetaria de los grupos de denervación más choque y Tempol más choque en comparación con el grupo de choque de pie (, Tabla 1 y Figura 3). Estos resultados revelan que el shock crónico podría mejorar el sistema de coagulación mediante la activación de la agregación plaquetaria.
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| PT, prothrombin time; APPT, activated partial thromboplastin time; TT: tiempo de trombina; versus grupo de control; versus grupo de choque. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
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3.4. El efecto del Choque, la Denervación y el Tratamiento con Tempol sobre las Concentraciones plasmáticas de Noradrenalina (NA)
El choque de pies aumentó significativamente los niveles plasmáticos de noradrenalina (NA) en comparación con el grupo control (, Figura 4). Los niveles plasmáticos de NA en el grupo de denervación más choque y Tempol más choque se suprimieron significativamente en comparación con el grupo de choque de pie (, Figura 4). Estos resultados confirman el éxito del procedimiento quirúrgico de denervación renal.
3.5. Efecto del Shock, la Denervación y el Tratamiento con Tempol sobre la Actividad plasmática de SOD y GSH-Px y sobre los niveles de TBARS
La actividad plasmática de SOD en el grupo de estrés se redujo notablemente en comparación con el grupo control (, Figura 5(a)). La actividad plasmática de SOD en los grupos de denervación más choque y Tempol más choque fue notablemente elevada en comparación con el grupo de choque de pie (, Figura 5(a)).
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La actividad plasmática de GSH-Px en el grupo de choque de pie también fue notablemente superior a la del grupo control (, Figura 5(b)). La actividad plasmática de GSH-Px en los grupos de denervación más choque y Tempol más choque fue notablemente elevada en comparación con el grupo de choque de pie (, Figura 5(b)).
El choque en el pie produjo un marcado aumento de los niveles plasmáticos de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) en comparación con el grupo de control (, Figura 5 c)). Los niveles plasmáticos de TBARS en los grupos de denervación más choque y Tempol más choque fueron notablemente suprimidos en comparación con el grupo de choque de pie (, Figura 5(c)).
4. Discusión
En este estudio, identificamos que la formación de TVP se facilita en condiciones de estrés y que los cambios en el sistema de coagulación de la sangre son inducidos por el estrés. La acumulación de datos ha demostrado que el estrés psicológico crónico activó dos sistemas: uno es el sistema de corteza hipotálamo-hipofisaria-suprarrenal (HPA) que fue mediado principalmente por la liberación de catecolamina, cortisol, vasopresina, endorfinas y aldosterona ; el otro es a través de la activación del sistema medular simpático-suprarrenal . Como se muestra en los datos, los niveles de corticosterona del grupo de choque crónico se incrementaron significativamente, lo que indica que la HPA se activó. ¿Cuál es el papel del sistema nervioso simpático en respuesta al estrés? Puesto que se ha demostrado que la activación del sistema simpático renal está altamente relacionada con el desarrollo de hipertensión, y la denervación renal es un nuevo tratamiento clínico para pacientes con hipertensión refractaria , el sistema simpático renal debe desempeñar un papel importante en las enfermedades cardiovasculares. Además, observaciones recientes muestran que la condición de alto estrés está altamente relacionada con las enfermedades cardiovasculares, especialmente el infarto cardíaco y cerebral; por lo tanto, especulamos si el estrés crónico activará el sistema de coagulación a través de la activación del sistema nervioso simpático renal. En el presente estudio, en primer lugar, encontramos que el estrés crónico podría agregar la formación de TVP, lo que sugiere que el estrés aumentará el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Además, medimos parámetros que definen la actividad del sistema de coagulación de la sangre, incluyendo TP, TPA, TT y agregación plaquetaria. Nuestros datos mostraron que hubo un cambio significativo en la agregación plaquetaria inducida tanto por ADP como por colágeno, lo que sugiere que el efecto agravante del estrés en la formación de TVP fue mediado por la activación de plaquetas. Nuestros resultados revelan en primer lugar el mecanismo que vincula la condición de alto estrés y las enfermedades cardiovasculares. Aunque nuestros datos actuales demuestran claramente el papel del sistema nervioso simpático renal en el desarrollo inducido por el shock crónico de la TVP, es difícil identificar si el nervio aferente o eferente juega un papel importante debido a la limitación del procedimiento quirúrgico. Especulamos que ambos están involucrados; la razón es que el nervio aferente podría afectar el control neurogénico de la presión arterial, lo que puede contribuir al desarrollo de TVP; y el nervio eferente podría regular la secreción renal de noradrenalina, lo que también puede contribuir al desarrollo de TVP.
La presencia de endotelio dañado y factores de coagulación activados o plaquetas facilita el desarrollo y la progresión de la TVP . La agregación plaquetaria (es decir, cuando las plaquetas se adhieren unas a otras) que ocurre en los sitios de lesión vascular se ha reconocido durante mucho tiempo como crítica para el desarrollo de trombosis . En el presente estudio, nos centramos principalmente en la función plaquetaria en la TVP. Los fenómenos de adhesión, liberación o agregación de plaquetas también se conocen como activación plaquetaria . Las plaquetas activadas juegan un papel importante en el proceso de trombosis. Nuestros datos muestran que la agregación plaquetaria aumentó después del tratamiento de estrés, junto con la mejora de la formación de TVP. El recuento de plaquetas se utilizó para normalizar la medida de la actividad plaquetaria; sin embargo, no se realizaron estadísticas sobre el número de plaquetas en cada grupo.
Nuestros análisis de la actividad plasmática de GSH-Px y SOD, así como del nivel plasmático de TBARS, mostraron que el cuerpo se encuentra en un estado de estrés oxidativo inducido por el tratamiento de choque crónico de pies, que fue inhibido por la denervación renal. Varios informes han demostrado que la actividad de la oxidasa NAD (P)H podría incrementarse directamente por los receptores α1 y β2 a través de las catecolaminas (CA) liberadas por el nervio simpático renal. Además, se demostró que los antagonistas de los receptores β1 reducen el estrés oxidativo vascular causado por la activación de la oxidasa NAD (P)H. Por lo tanto, podemos decir que la inervación simpática renal aumenta directamente los niveles de estrés oxidativo. Se ha reportado que la agregación plaquetaria, un factor de riesgo adicional para trombo, se asocia con estrés oxidativo . El estrés oxidativo podría aumentar directamente la agregación plaquetaria a través de radicales libres de oxígeno ubicados en la superficie plaquetaria . La evidencia sólida ha demostrado que el estrés oxidativo podría activar directamente las plaquetas a través de una variedad de formas. Como el producto del estrés oxidativo O2-podría reaccionar con plaquetas o endotelio, entonces NO derivado de ONOO -, que es de particular importancia para la trombosis vascular, también tiene tales efectos. Varios estudios han demostrado que el O2, que podría reducir el umbral de activación plaquetaria a trombina, colágeno o ADP, y el O2, incluso podría inducir agregación espontánea . La plaqueta activada incluso podría producir ROS; el papel de este ROS endógeno es similar al ROS exógeno en la activación plaquetaria. En general, existen varios escenarios que conducen a la agregación plaquetaria inducida por estrés. En el primero, el nervio simpático renal se activa por el estrés, lo que conduce a un aumento del estrés oxidativo en todo el cuerpo, que luego es seguido por un aumento de la agregación plaquetaria. En el otro escenario, el estrés desencadena directamente la producción de estrés oxidativo del cuerpo, lo que aumenta directamente la agregación plaquetaria. La denervación del nervio simpático renal puede afectar directamente a la activación plaquetaria, sin embargo, su mecanismo aún no se ha explorado.
Nuestros datos mostraron que el tratamiento del estrés crónico no tiene un efecto significativo ni en la TPPA ni en la TP, lo que sugiere que la TVP facilitada por el estrés puede no estar asociada con el sistema de coagulación extrínseco o intrínseco. Sin embargo, el tratamiento de estrés crónico podría aumentar notablemente el TT, lo que indica que el tiempo de conversión del fibrinógeno en fibrina se prolongó debido a una hiperfibrinólisis. Por lo tanto, especulamos que la hiperfibrinólisis fibrinolítica se debió a una coagulación sanguínea aumentada en condiciones de estrés crónico. Al mismo tiempo, la denervación renal y el tratamiento antioxidante podrían disminuir la agregación plaquetaria, lo que a su vez suprimió la coagulación sanguínea. Con base en nuestros datos, pudimos observar que el TT tendía a una tasa normal en estas dos condiciones en comparación con el grupo de choque.
Cabe señalar que, en nuestra observación actual, encontramos que el tratamiento con Tempol podría reducir el aumento de los niveles de corticosterona inducido por el estrés crónico, lo que sugiere la participación del estrés oxidativo en la liberación hormonal inducida por la activación de HPA, lo que indica que el tratamiento antioxidante puede proporcionar algunos efectos beneficiosos en la lesión orgánica inducida por la activación de HAP. Sin embargo, no encontramos ninguna diferencia entre los tratamientos de denervación y antioxidantes en ningún parámetro, lo que indica que el nervio simpático y el estrés oxidativo pueden contribuir de forma independiente al desarrollo de TVP inducida por shock crónico.
En conclusión, el estrés crónico podría aumentar la agregación plaquetaria directamente a través de la activación del nervio simpático renal y el aumento del estrés oxidativo. Luego, la TVP se ve facilitada por el aumento de la agregación plaquetaria. Varios estudios han demostrado que la aterosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares están estrechamente asociadas con el estrés oxidativo y que los pacientes a menudo presentan niveles bajos de antioxidantes en sangre y niveles elevados de marcadores de estrés oxidativo . Por lo tanto, en vista de las enfermedades vasculares cardiocerebrales y la TVP, podemos prevenir y tratar estas enfermedades dirigiendo la terapia a los niveles hormonales y antioxidantes. Además de esto, es una nueva forma de terapia a través del nervio simpático renal.
Conflicto de Intereses
Los autores declaran no hay intereses financieros.
Contribución de los autores
Guo-Xing Zhang concibió y diseñó los experimentos. Tao Dong, Yu-Wen Cheng, Pei-Wen Sun y Chen-Jie Zhu realizaron los experimentos. Fei Yang ayudó con la agregación plaquetaria. Guo-Xing Zhang contribuyó con reactivos / materiales y analizó datos. Guo-Xing Zhang, Tao Dong y Yu-Wen Cheng escribieron el artículo.
Agradecimientos
Los autores agradecen al profesor Li Zhu y a otros miembros del laboratorio Zhu por su asesoramiento y asistencia experimental. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81270316, 814170563) y el Programa de Investigación de la Universidad de Soochow (Q413400111).
