Zirkulierende Zellenbearbeiten
Die zur Gewinnung isolierter Zellen erforderlichen Techniken variieren je nach erforderlichem Zelltyp. Zirkulierende Zellen wie Blutzellen oder einige Tumorzellen können durch Entnahme einer Blutprobe isoliert werden. Da Blutproben eine Mischung aus vielen verschiedenen Zelltypen enthalten, muss ein Verfahren zur Trennung von Zellen in verschiedene Typen verwendet werden. Die am häufigsten verwendete Methode hierfür ist die Durchflusszytometrie, bei der ein automatisierter Analysator einen engen Zellstrom inspiziert. In einer Version dieser Technik wird ein Licht auf den Zellstrom gerichtet, und der Analysator erkennt das reflektierte Licht oder die Fluoreszenz, bevor er diese Informationen verwendet, um die interessierenden Zellen schnell in eine Sammelkammer zu manövrieren.
Feste Gewebebearbeiten
Wenn es um feste Gewebe geht, kann es schwieriger sein, Gewebe für die Zellisolierung zu erhalten. Überschüssiges menschliches Gewebe kann manchmal zum Zeitpunkt der geplanten Operation erhalten werden, beispielsweise werden Proben des rechten Vorhofanhangs häufig während einer Operation am offenen Herzen, wie einer Bypass-Operation an der Koronararterie, herausgeschnitten und verworfen. Andere Gewebe wie Pankreas- oder Blasenproben können als Biopsie entnommen werden. Alternativ wird Gewebe von Tieren häufig erhalten, indem das Tier geopfert wird.
Nachdem eine Gewebeprobe gewonnen wurde, muss sie von einer Lösung bei einer geeigneten Temperatur umgeben oder perfundiert werden, die die Salze und Nährstoffe enthält, die erforderlich sind, um die Zellen am Leben zu erhalten. Dies kann durch einfaches Eintauchen des Gewebes in die Lösung erfolgen oder komplexere Anordnungen wie die Langendorff-Perfusion beinhalten. Häufig verwendete Lösungen enthalten Modifikationen der Tyrode-Lösung oder der Krebs- und Henseleit-Lösung Diese Lösungen enthalten präzise Konzentrationen von Elektrolyten, einschließlich Natrium, Kalium, Kalzium, Magnesium, Phosphat, Chlorid und Glucose. Die Konzentrationen dieser Elektrolyte müssen sorgfältig ausbalanciert werden, wobei auf den osmotischen Druck zu achten ist. Der Säuregehalt der Lösung muss reguliert werden, häufig unter Verwendung eines pH-Puffers wie HEPES. Die Isolierung von Zellen aus einigen Geweben kann durch Sauerstoffanreicherung der Lösung verbessert werden. In den Anfangsstadien ist die Perfundierung des Gewebes mit einer Lösung, die kein Kalzium enthält, insbesondere bei der Isolierung von Herzmyozyten nützlich, da die Abwesenheit von Kalzium eine Trennung der eingelagerten Scheiben verursacht.
Der Lösung können dann proteolytische Enzyme zugesetzt werden. Enzyme, die Kollagen (Kollagenasen) verdauen, werden häufig verwendet, wenn Zellen aus dem Herzen oder der Blase isoliert werden. Allzweckenzyme, die viele Arten von Proteinen (Proteasen) verdauen, können ebenfalls verwendet werden. Bei der Isolierung von Zellen aus Hirngewebe können andere Enzyme erforderlich sein, die DNA (DNAasen) abbauen.
Diese Enzyme können neben der Verdauung der extrazellulären Matrix auch andere wichtige Proteine verdauen, die für die Funktion der interessierenden Zellen essentiell sind. Wenn Zellen diesen Enzymen zu lange ausgesetzt sind, führt dies zum Zelltod, aber wenn sie den Enzymen nicht lange genug ausgesetzt sind, ist die Verdauung der extrazellulären Matrix nicht vollständig. Nachdem die Enzyme durch Perfundieren mit einer zweiten Lösung, die keine Enzyme enthält, aus dem Gewebe entfernt wurden, können Zellen mechanisch getrennt oder dissoziiert werden. Eine einfache Technik zur Dissoziation von Zellen besteht darin, das Gewebe in kleine Stücke zu schneiden, bevor die Stücke in einer Lösung mit einer Pipette gerührt werden.
