Wenn es um die Solubilisierung und Denaturierung von Proteinen vor der isoelektrischen Fokussierung und 2D-Gelelektrophorese geht, entscheiden sich die meisten Forscher für Harnstoff. Dies ist nicht überraschend, da dieses milde chaotrope Mittel die Wechselwirkungen zwischen Proteinmolekülen vollständig stören und die Effizienz der Proteaseaktivität bei der Proteinverdauung erhöhen kann, während effektiv verhindert wird, dass Proteine aggregieren und / oder ausfallen. Darüber hinaus wird Harnstoff auch zur Renaturierung von Proteinen aus zuvor denaturierten Proben verwendet.

Trotz seiner Beliebtheit als wirksames Proteindenaturierungsmittel ist die Verwendung von Harnstofflösung bei der Verdauung von Proteinen mit einer besonderen Herausforderung verbunden – sie erhöht das Risiko einer Carbamylierung. Warum sollte dich das beunruhigen? Hier sind einige Gründe, warum Carbamylierung für Ihr Experiment schädlich sein kann und warum es um jeden Preis vermieden werden sollte.Abgesehen von der Blockierung der N-terminalen Enden von Proteinmolekülen stört die Carbamylierung die Proteincharakterisierung und macht sie für die weitere Verwendung nicht verfügbar.

Es greift aggressiv die Seitenketten von Arginin- und Lysinresten an und macht das Protein für enzymatische Verdauungen ungeeignet.

Es behindert die enzymatische Verdauung von Proteinen und beeinträchtigt die Identifizierung und Quantifizierung von Proteinen in der MS-Analyse.

Es verwechselt die Ergebnisse von Peptiden mit unerwarteten Retentionszeiten und erhöht die Komplexität der Probe.

Es reduziert die Ionisationseffizienz und wirkt sich negativ auf die Signalintensität der erkannten Peaks aus.

Es induziert eine Änderung des isoelektrischen Punktes von Proteinen und führt zu künstlichen Ergebnissen.

Es kann die Ergebnisse von In-vivo-Carbamylierungsstudien beeinflussen.

Was verursacht Carbamylierung?Per Definition bezieht sich Carbamylierung auf die posttranslationale Modifikation, die die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Proteinen verändert. Dies wird durch die nicht-enzymatische Reaktion zwischen Isocyansäure und den freien Aminogruppen bewirkt.

In wässrigen Lösungen liegt Harnstoff im Gleichgewicht mit Ammoniumcyanat vor. Es ist wichtig zu beachten, dass (1) Harnstoff in Lösung spontan unter Bildung von Cyanat- und Ammoniumionen dissoziiert, (2) zu Isocyansäure (CNOH) abgebaut wird, der Form, die aktiv mit Proteinamingruppen reagiert und Carbamylierung induziert, und (3) Die Geschwindigkeit, mit der Harnstoff dissoziiert und das Ausmaß der Carbamylierung hängt von der Temperatur, dem pH-Wert und der Inkubationszeit ab.

Carbamylierung verhindern: Einige nützliche Tipps

Nichts kann die Tatsache ändern, dass Harnstoff in Gegenwart von Wärme und Proteinen immer zu Carbamylierung führt. Sie können den hochwertigsten verfügbaren Harnstoff verwenden und trotzdem das Risiko einer Carbamylierung eingehen.

Zum Glück gibt es mehrere Möglichkeiten, Peptide vor Carbamylierung zu schützen. Hier sind einige effektive Strategien, die verwendet werden können, um dieses Ziel zu erreichen.

• Verwenden Sie bei der Durchführung proteomischer Verfahren immer frisch zubereitete Reagenzien auf Harnstoffbasis. Verwenden Sie hochwertige trockene, vorgemischte und gebrauchsfertige Puffer auf Harnstoffbasis aus glaubwürdigen Quellen und seien Sie bei der Vorbereitung Ihrer Proben äußerst vorsichtig. Hinweis: Lagern Sie festes Material bei Raumtemperatur und halten Sie die Handhabung auf ein Minimum.
• Entfernen Sie Harnstoff aus der Proteinprobe vor dem Aufschluss durch Dialyse und/oder schnelle Umkehrphasenchromatographie oder durch Verwendung von Spinsäulen.
• Halten Sie die Probe auf einer relativ niedrigen Temperatur, um die Zersetzungsrate von Harnstoff zu verringern. Vermeiden Sie es, harnstoffhaltige Puffer über 37oC zu erhitzen, um das Risiko einer Carbamylierung zu verringern.
• Deionisieren Sie die Harnstofflösung mit einem Ionenaustauscherharz, um die Cyanatkonzentration zu reduzieren.
• Harnstofflösung (100 mM HCl)ansäuern, um die Bildung von Isocyansäure zu verhindern.
• Verwenden Sie Reagenzien wie Ethanolamin, Ethylendiamin, Methylamin und Tris-HCl, um die Protein / Peptid-Carbamylierung zu minimieren. Diese Reagenzien helfen, indem sie nach Cyanatmolekülen suchen, wodurch sie für Peptide nicht verfügbar sind.

Zugegebenermaßen haben diese Strategien ihre eigenen Nachteile (z., erfordern eine längere Handhabungszeit, induzieren die Ausfällung von leicht denaturierten Proteinen und können für zahlreiche enzymatische Aufschlussverfahren ungeeignet sein), aber da Enzymverdauungen bei erhöhten Temperaturen über einen langen Zeitraum durchgeführt werden, haben Sie keine andere Wahl, als Harnstoff aus der Aufschlussmischung zu entfernen. Andernfalls besteht immer das Risiko einer Carbamylierung. Es ist ein Risiko, das Sie nicht eingehen möchten.