Der Pilz Candida guilliermondii ist in der Natur weit verbreitet, einschließlich der menschlichen Mikrobiota der Haut- und Schleimhautoberflächen.22 Obwohl diese Art im Vergleich zu anderen Candida-Arten eine geringere Virulenz aufweist,3 gilt sie derzeit als aufstrebender Erreger mit einer großen Inzidenz in Lateinamerika.18C. guilliermondii wurde als ätiologischer Erreger einer Vielzahl klinischer Infektionen anerkannt, einschließlich disseminierter Infektionen hauptsächlich bei immungeschwächten patienten22 und nosokomialer Ausbrüche bei chirurgischen Patienten mit intravaskulären Geräten.13 Derzeit umfasst die empfohlene Behandlung für invasive Candidiasis bei neutropenischen Patienten Caspofungin (CFG) oder Micafungin (MFG) als Erstlinientherapien, wobei liposomales Amphotericin B (LAMM) und Anidulafungin (AFG) Alternativen sind, während Fluconazol (FLC) nur empfohlen wird, wenn die Anfälligkeit für dieses Arzneimittel bestätigt ist.23 Mehrere Studien haben jedoch gezeigt, dass C. guilliermondii eine verminderte Anfälligkeit für FLC8,15,19 aufweist, und es wurde über Therapieversagen im Zusammenhang mit Isolaten mit hohen minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) von Amphotericin B (AMB) berichtet.9,12,24 Obwohl fast 90% der Isolate Echinocandine-Mikrofone aufweisen, die gleich oder niedriger als die klinischen Haltepunkte (CBP) der Empfindlichkeit (2 µg / ml) sind,17 ähnlich wie bei anderen Candida-Arten wie C. parapsilosis, zeigen einige Isolate von C. guilliermondii Mikrofone erheblich hoch.8,15 Die verfügbaren Daten zur Wirksamkeit von AFG bei invasiver Candidiasis sind begrenzt, und die potenzielle Rolle dieses Arzneimittels in der klinischen Praxis ist wenig bekannt.23 In diesem Zusammenhang können Tierversuche eine wichtige Rolle für ein besseres Verständnis der In vitro–in vivo-Korrelation spielen.11 Daher bestand unser Hauptziel darin, die In vitro- und in vivo-Aktivitäten von AFG gegen verschiedene Isolate von C. guilliermondii zu bewerten und die Ergebnisse mit denen von AMB und FLC zu vergleichen.
Materialien und Methodenpilzisolate
Vier klinische Isolate von C. guilliermondii (UTHSC 11-142, UTHSC 10-499, UTHSC 11-685 und UTHSC 10-3207) wurden in der In-vitro-Studie verwendet und zwei von ihnen (UTHSC 11-685 und UTHSC 11-142) wurden aufgrund ihrer unterschiedlichen In-vitro-Empfindlichkeit für das Mausmodell ausgewählt. Die Isolate wurden identifiziert, indem die interne transkribierte Spacer (ITS) –Region und die D1-D2-Domänen der rRNA sequenziert und die Sequenzen mit denen des Typstamms dieser Spezies verglichen wurden.
In-vitro-Studien
Die In-vitro-Empfindlichkeit der vier Stämme gegenüber AMB, FLC und AFG wurde unter Verwendung einer Referenzbrühe-Mikrodilutionsmethode bewertet, wobei 6Candida parapsilosis ATCC 22019 und Candida krusei ATCC 6258 als Qualitätskontrollen einbezogen wurden.
Time-Kill-Kurven wurden für alle Stämme nach früheren Studien entwickelt.5,20 In Kürze wurde eine Stammlösung jedes Antimykotikums hergestellt, AMB (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, USA) und AFG (Pfizer Inc., Madrid, Spanien) wurden in Dimethylsulfoxid und FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spanien) in destilliertem Wasser. Ferner wurden Arzneimittelverdünnungen in 9 ml Standardmedium RPMI 1640 hergestellt, um Konzentrationen von 0.03, 0.12, 0.5, 1, 2, 8 und 32µg/ml jeder Droge. Die Isolate wurden 24h bei 35°C auf Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Platten subkultiviert. Kulturen von C. guilliermondii wurden in steriler Kochsalzlösung suspendiert und die resultierenden Suspensionen wurden auf 5 × 106 koloniebildende Einheiten (KBE) / ml durch Hämozytometerzählungen und durch serielle Plattierung auf PDA eingestellt, um die Lebensfähigkeit zu bestätigen. Verdünnungen und Kontrollen (arzneimittelfrei) wurden mit 1 ml der Pilzsuspensionen inokuliert, was zu einem Ausgangsinokulum von 5 × 105 CFU / ml führte, und bei 35 ° C inkubiert. Ein Aliquot von 100 µl aus jedem Röhrchen wurde bei gesammelt 0, 2, 4, 6, 8, 24, und 48h nach Inokulation und verdünnt in destilliertem Wasser; 30 µl davon wurden auf PDA-Platten kultiviert und zur KBE/ml-Bestimmung 48h bei 35°C inkubiert. Eine KBE-Abnahme von ≥99,9% oder 3 log10-Einheiten im Vergleich zum Ausgangsimpulum wurde als fungizid angesehen, während eine Reduktion von
log10-Einheiten als fungistatisch angesehen wurde. Die Nachweisgrenze lag bei 50CFU/ml. Alle Time-Kill-Curve-Studien wurden in duplicate.In vivo-Studien
Männliche OF-1-Mäuse (Charles River; Criffa SA, Barcelona, Spanien) mit einem mittleren Gewicht von 30g wurden im Experiment verwendet. Mäuse wurden in Standardboxen mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Alle Tierverfahren wurden von der Tierschutz- und Ethikkommission der Universitat Rovira i Virgili überwacht und genehmigt.
Mäuse wurden einen Tag vor der Infektion durch eine intraperitoneale (i.p.) Injektion von 200 mg/kg Cyclophosphamid (Genoxal; Laboratorios Funk SA, Barcelona, Spanien) plus einer intravenösen (i.v.) injektion von 5-Fluorouracil (Fluorouracil; Ferrer Farma SA, Barcelona, Spanien) bei 150 mg / kg.10,14 Am Tag der Infektion wurden Mäuse i.v. mit 1 × 108CFU / Tier von jedem der beiden Stämme von C. guilliermondii, UTHSC 11-685 und UTHSC 11-142, in 0,2 ml steriler Kochsalzlösung in die laterale Schwanzvene in Frage gestellt.3,4
Gruppen von acht Tieren wurden nach dem Zufallsprinzip für jeden Stamm und jedes Arzneimittel festgelegt. Die Gruppen wurden wie folgt behandelt: Amphotericin B-Desoxycholat (AMBd) (Xalaban Pharmacy, Barcelona, Spanien) in Dosen von 0,8 mg/kg i.v. einmal täglich (QD); liposomales Amphotericin B (LAMM) (Gilead Sciences S.A., Madrid, Spanien) bei 10 mg / kg i.v., QD; FLC (Pfizer Inc., Madrid, Spanien) bei 25 mg / kg oral (p.o.) durch Gavage, zweimal täglich (BID); und AFG (Ecalta; Pfizer Ltd., Sandwich, Kent, Vereinigtes Königreich) bei 10 mg/kg Körpergewicht/Dosis i.p., QD. Alle Behandlungen begannen 24 Stunden nach der Herausforderung und dauerten 7 Tage. Kontrollen erhielten keine Behandlung. Um bakteriellen Infektionen vorzubeugen, erhielten alle Mäuse 5 mg / kg Ceftazidim subkutan von Tag 1 bis 7 nach der Infektion. Mäuse wurden täglich überprüft und am Tag 8 nach der Infektion durch CO2-Anoxie eingeschläfert. Die Wirksamkeit jedes Arzneimittels wurde durch Gewebebelastungsreduzierung und histopathologische Studien bewertet. Nieren wurden aseptisch entfernt, und einer von ihnen wurde gewogen und in 2 ml steriler Kochsalzlösung homogenisiert. Serielle 10-fache Verdünnungen der Homogenate wurden auf PDA plattiert und für 48h bei 35°C zur KBE/g-Berechnung inkubiert. Für die histopathologische Studie wurde die verbleibende Niere mit 10% gepuffertem Formalin fixiert, dehydriert, in Paraffin eingebettet und in 2µm–Schnitte geschnitten, die mit Hämatoxylin-Eosin (H-E) – und Periodsäure-Schiff (PAS) -Färbung zur lichtmikroskopischen Untersuchung gefärbt wurden.
Statistik
Koloniezählungen aus Gewebe wurden mit dem Mann–Whitney U-Test unter Verwendung von Graph Pad Prism 4.0 für Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) analysiert. Wenn die P-Werte unter 0,05 lagen, wurden die Unterschiede als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnissein-vitro-Studien
MHK von AMB waren 0,25-1µg/ml, 0,06–0,25µg/ml für AFG und 0,5–1µg/ml für FLC. Nach den Cut-offs der Empfindlichkeit für AMB, FLC und AFG gegen C. guilliermondii,16 alle Isolate waren anfällig für die drei Medikamente. Qualitätskontrolle und Empfindlichkeit lagen innerhalb der akzeptierten Bereiche.6
Die Abtötungskinetik von AMB zeigte eine schnelle fungizide Aktivität, die mit der Wirkstoffkonzentration zunahm. Bei Konzentrationen, die der MHK entsprechen, zeigte dieses Arzneimittel eine fungizide Wirkung gegen drei der vier getesteten Isolate (Abb. 1). Diese Aktivität begann unmittelbar nach der Inokulation bei Konzentrationen über 1µg/ml, wobei der fungizide Endpunkt nach 4h bei 32µg/ml erreicht wurde. AFG bei Konzentrationen über 0,5 µg / ml zeigte fungizide Aktivität ab 4h Inkubation. Der fungizide Endpunkt wurde nach 12–24h Inkubation bei 32µg/ml erreicht (Abb. 2). FLC zeigte fungistatische Aktivität gegen alle vier Isolate (Abb. 3).
Zeittötende Kinetik-Assays von AMB gegen vier Stämme von C. guilliermondii. (■) 0,03 µg/ml, (▴) 0,12 µg/ml, (□) 0,5 µg/ml, (○) 1 µg/ml, (Δ) 2 µg/ml, (▿) 8 µg/ml, (♦) 32 µg/ml, (●) Kontrolle. Gestrichelte Linien stellen eine KBE-Abnahme von 3log10-Einheiten im Wachstum im Vergleich zum anfänglichen Inokulum (fungizide Aktivität) dar, gestrichelte Linien zeigen die Quantifizierungsgrenze des Tests an.
Zeittötende Kinetik-Assays von AFG gegen vier Stämme von C. guilliermondii. (■) 0,03 µg/ml, (▴) 0,12 µg/ml, (□) 0,5 µg/ml, (○) 1 µg/ml, (Δ) 2 µg/ml, (▿) 8 µg/ml, (♦) 32 µg/ml, (●) Kontrolle. Gestrichelte Linien stellen eine KBE-Abnahme von 3 log10 Einheiten im Wachstum im Vergleich zum anfänglichen Inokulum (fungizide Aktivität) dar, gestrichelte Linien zeigen die Quantifizierungsgrenze des Tests an.
Zeittötende Kinetik-Assays von FLC gegen vier Stämme von C. guilliermondii. (■) 0,03 µg/ml, (▴) 0,12 µg/ml, (□) 0,5 µg/ml, (●) 1 µg/ml, (Δ) 2 µg/ml, (▿)8 µg/ml, (♦) 32 µg/ml, (●) Kontrolle. Gestrichelte Linien stellen eine KBE-Abnahme von 3log10-Einheiten im Wachstum im Vergleich zum anfänglichen Inokulum (fungizide Aktivität) dar, gestrichelte Linien zeigen die Quantifizierungsgrenze des Tests an.
In vivo Studien
LAMB bei 10 mg / kg war das einzige Medikament, das die Pilzbelastung in den Nieren von Mäusen, die mit jedem der beiden Stämme infiziert waren, reduzieren konnte, wobei die Reduktion signifikant höher war als die der anderen Therapien (P≤0,04). AMBd und FLC waren nur in der Lage, die Gewebebelastung bei Mäusen zu reduzieren, die mit dem Stamm infiziert waren, der die niedrigsten MKS für diese beiden Arzneimittel aufwies, d. H. 0,25 µg / ml für AMB und 0,5 µg / ml für FLC (P≤ 0,008). Im Fall von AFG war die Reduktion der Pilzlast bescheiden und niedriger als bei AMBd und reduzierte die Gewebebelastung in der Niere nur in Bezug auf die Kontrollgruppe für Stamm UTHSC 11-685 (P = 0,002) signifikant (Abb. 4).
Effects of antifungal treatment on colony counts of C. guilliermondii in kidney of neutropenic mice, 8 days post infection. LAMB 10, liposomal amphotericin B at 10mg/kg QD; AMBd 0.8, amphotericin B deoxycholate at 0.8mg/kg QD; AFG 10, anidulafungin at 10mg/kg QD. aP0.05 versus control; bP0.05 versus AMBd 0.8, AFG 10 und FLC 50; cP0.05 gegenüber AFG 10 und FLC 50.
Die histologische Studie zeigte eine fokale Infiltration von Pilzzellen in Nieren unbehandelter Tiere und in Mäusen, die mit AMBd, FLC oder AFG behandelt wurden. Nieren von Mäusen, die mit LAMM behandelt wurden, zeigten nur eine leichte Pilzinvasion. Anzeichen von Nekrose, Entzündungsreaktion oder Parenchymveränderungen wurden weder bei Kontrollen noch bei behandelten Tieren beobachtet (Abb. 5).
Vorhandensein einer Pilzinfiltration (schwarzer Pfeil) im Nierenabschnitt einer mit C. guilliermondii infizierten Kontrollmaus 8 Tage nach der Infektion (Periodsäure-Schiff-Färbung, Vergrößerung 1000 ×). Stange=10µm.
Diskussion
Die In-vitro-Studien zeigten keine verminderte Empfindlichkeit von C. guilliermondii-Isolaten gegenüber FLC oder AFG. In Übereinstimmung mit früheren Studien zeigten Time-Kill-Kurven von AMB eine konzentrationsabhängige fungizide Aktivität gegen alle Isolate,4,5,7 und FLC zeigten unabhängig von der getesteten Konzentration eine fungistatische Wirkung.7 Es ist bekannt, dass AMBd eine höhere Wirksamkeit als seine lipidische Formulierung aufweist, insbesondere in der Niere, wenn beide in den gleichen Dosen verabreicht werden.1 Pharmakokinetische Studien zeigten jedoch, dass nach Verabreichung von 0,75 mg / kg AMBd die im Mäuseserum erreichte Cmax von AMB 0,30 µg / ml betrug.25 Die AMB-MHK eines der beiden getesteten Isolate ist jedoch höher als dieser Wert; Daher haben wir eine hohe Dosis LAMB verwendet, um höhere Konzentrationen zu erreichen.1 In der Tat war die Verabreichung von LAMM bei 10 mg / kg wirksam bei der Verringerung der Pilzlast beider Stämme. Diese Tatsache korrelierte mit Abtötungskurven, bei denen AMB seine fungizide Aktivität gegen die beiden in vivo getesteten Isolate bei Konzentrationen von 1 µg / ml erreichte. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, in der versucht wurde, einen Zusammenhang zwischen der Abtötungskinetik und der in vivo experimentellen Wirksamkeit von AFG und FLC gegen klinische Isolate von C. guilliermondii herzustellen. Es gibt nur eine frühere Studie zu Echinocandinen, insbesondere zu Caspofungin (CFG) bei disseminierter Infektion durch C. guilliermondii. CFG bei 1 mg / kg war wirksam bei der Verringerung der Nierenpilzbelastung bei Mäusen, die mit einem Stamm von C. guilliermondii mit einer MHK von 8 µg / ml infiziert waren, während die Zeittötung zeigte, dass bei Konzentrationen von 64 µg / ml keine fungizide Aktivität erreicht wurde.4 Umgekehrt zeigte unsere Studie eine konzentrationsabhängige Aktivität von AFG, die bei 32µg / ml eine fungizide Aktivität ausübte, wie zuvor berichtet,17 bei 24h und bei 8µg / ml. Frühere Studien berichteten über AFG-Konzentrationen in Serum und Niere von ungefähr 13 µg / ml nach 7-tägiger Behandlung in Dosen von 10 mg / kg.21 Hier konnte AFG die Pilzbelastung in den Nieren von neutropenischen Mäusen, die mit einem der beiden getesteten Stämme infiziert waren, nur geringfügig reduzieren, was nicht mit dem geringen AFG-MICs-Unterschied zwischen den beiden getesteten Stämmen (1 Verdünnung) in Zusammenhang zu stehen scheint, was darauf hindeutet, dass das Ansprechen auf die AFG-Behandlung stammabhängig ist. In ähnlicher Weise konnte FLC auch die Pilzbelastung in Nieren von Mäusen, die mit einem der beiden Stämme in Frage gestellt wurden, trotz der verabreichten Dosis, die Serumkonzentrationen oberhalb der MKS erreichte, nur geringfügig reduzieren2, was aufgrund seiner fungistatischen Aktivität ebenfalls nicht überraschend war.
Zusammenfassend zeigte unsere Studie die höhere Aktivität und Wirksamkeit von LAMM gegen die beiden Stämme von C. guilliermondii, im Gegensatz zu der schlechten Wirkung von FLC und AFG. Es sollten jedoch weitere Studien mit mehr Isolaten von C. guilliermondii durchgeführt werden, die ein breiteres Spektrum von AFG-MHK darstellen, um festzustellen, ob ein Zusammenhang zwischen MHK-Werten und AFG-Wirksamkeit besteht.
Interessenkonflikt
Keine zu deklarieren.
