CPZ dämpft Kolitis unabhängig von TRPV1
Um den Mechanismus in Frage zu stellen, durch den CPZ-Einläufe experimentelle Kolitis abschwächen, induzierten wir Dextransulfat-Natrium (DSS) -Kolitis in Wildtyp- (WT) und TRPV1- defiziente Mäuse (jede Gruppe n = 8). Obwohl widersprüchliche Berichte existieren, entwickelten TRPV1-defiziente Mäuse DSS-Kolitis und Gewichtsverlust in gleichem Maße wie die congenic WT-Mäuse in unserem Labor, was unseren Ergebnissen aus dem zuvor veröffentlichten Modell der TNBS-Kolitis entspricht7,8,9,10,11,12. Für CPZ-Klistierbehandlungen verwendeten wir die gleiche Konzentration von CPZ (531 µM), von der zuvor berichtet wurde, dass sie die DSS-Kolitis (5%) bei Ratten dämpft8. Der Verlauf der Colitis wurde täglich durch Körpergewichtsmessungen und Endoskopie überwacht. Zweimal tägliche Anwendungen von CPZ (531 µM) -Einläufen schwächten die DSS-Kolitis sowohl bei WT− als auch bei TRPV1− / –Mäusen in gleichem Maße ab, was sich in einem verbesserten endoskopischen Score und einem verringerten Gewichtsverlust widerspiegelte (Abb. 1A-C). H&E-Flecken aus dem distalen Dickdarm am Ende des 7-tägigen DSS-Experiments zeigten eine zerstörte Schleimhautgewebsarchitektur mit zahlreichen infiltrierenden Immunzellen in den Dickdärmen der Kontrollen. Dies stand in krassem Gegensatz zu einer weitgehend intakten Mukosa und dem Fehlen einer signifikanten Immunzellinfiltration im Dickdarm von CPZ-behandelten Mäusen beider Genotypen (Abb. 1D). Entsprechend diesen Befunden war der histologische Score bei den CPZ-behandelten Mäusen beider Genotypen stark reduziert (Abb. 1E).
CPZ aktiviert TRPA1
Die In-vivo-Beobachtung, dass CPZ-Einläufe die Kolitis bei TRPV1-Nullmutanten Mäusen wirksam hemmten, stellte die Frage nach TRPV1-unabhängigen neuronalen Effekten von CPZ. Da sich gezeigt hatte, dass TRPA1 in verschiedenen Entzündungsmodellen, einschließlich Colitis6, 12,14, von entscheidender Bedeutung ist, testeten wir, ob CPZ auf TRPA1 wirkt.
CPZ-induzierte Ionenströme durch hTRPA1
Patch-Clamp-Experimente wurden im Voltage-Clamp-Modus an HEK293t-Zellen durchgeführt, die rekombinantes hTRPA1 exprimieren (hTRPA1-HEK293t-Zellen). Bei einem Haltepotential von -60 mV induzierte CPZ (10 µM) einen Einwärtsstrom, der durch den selektiven TRPA1-Antagonisten HC-030031 (HC, 10 µM) fast vollständig inhibiert wurde (93% Inhibierung, n = 5) (Abb. 2A). In allen Zellen, in denen ein CPZ-induzierter Einwärtsstrom aufgezeichnet wurde, rief Carvacrol (100 µM), ein etablierter TRPA1-Agonist, ebenfalls große Einwärtsströme bei gleichem Haltepotential hervor, was eine funktionelle Expression von hTRPA1 zeigte. Diese hTRPA1-HEK293-Zellen wurden ebenfalls Spannungsrampen von -100 bis +100 mV von 400 ms Dauer alle 4 s ausgesetzt (Abb. 2B). Die CPZ-induzierte Strom-Spannungs-Beziehung zeigte eine leicht nach außen gerichtete Gleichrichtung und ein Umkehrpotential nahe 0 mV (Abb. 2C). Die durch CPZ (10 µM) evozierten Ströme wurden durch HC (10 µM) inhibiert. Der Effekt war bei negativen Potentialen ausgeprägter (89% ± 5% Hemmung bei -80 mV, Mittelwert ± SD, n = 7) als bei positiven Potentialen (80% ± 9% Hemmung bei +80 mV).
Capsazepin (CPZ) aktiviert heterolog exprimiertes humanes TRPA1.
(A) CPZ (10 µM) evoziert hTRPA1-vermittelte Ströme in transfizierten HEK293t-Zellen. Beachten Sie die vollständige Hemmung der Ströme durch den selektiven TRPA1-Antagonisten HC030031 (HC, 10 µM). (B) Repräsentative Rampenströme, die in einer hTRPA1-transfizierten HEK293-Zelle durch 400 ms Spannungsrampen von -100 bis +100 mV hervorgerufen werden, die alle 4 s angelegt werden. Jedes Symbol stellt die Stromamplitude bei -80 mV (Quadrate) und +80 mV (Kreise) dar. Der CPZ-induzierte Strom wurde durch HC stark inhibiert. (C) Beispiele für einzelne Rampenströme entsprechend den ausgefüllten Symbolen und Zahlen in B. (D) CPZ (50 µM, 10 s) evoziert große Calciumtransienten in hTRPA1-HEK293-Zellen (schwarze Spur, n = 128). HC (20 µM; rote Spur, n = 209) und A-967079 (10 µM; blaue Spur, n = 140) hemmten die Reaktion auf CPZ vollständig. Die Daten stellen Mittelwerte (gerade Linien) ± SEMs (gepunktete Linien) dar. (E) Die Aktivierung von hTRPA1 durch CPZ (10 µM) ist konzentrationsabhängig. Schwarze Spur: hTRPA1-HEK293-Zellen (n = 52) wurden durch Erhöhung der CPZ-Konzentrationen für 20 s in 3 min-Intervallen stimuliert. Graue Spur: Untransfizierte HEK293-Zellen (n = 101) wurden den gleichen CPZ-Konzentrationen unterworfen. (F) Die Aktivierung von hTRPA1 durch CPZ (1 µM) beinhaltet drei kritische Cysteine im N-Terminus des Kanals. Schwarze Spur: reaktion von n = 123 HEK293-Zellen, die WT hTRPA1 exprimieren, auf aufeinanderfolgende Anwendungen von CPZ (1 µM), Carvacrol (100 µM) und Allylisothiocyanat (AITC, 50 µM). Graue Spur: Reaktion von n = 165 HEK293-Zellen, die die Mutante hTRPA1-3C exprimieren, auf dieselbe Sequenz von Stimuli. Beachten Sie die erhebliche Verringerung der Reaktion der hTRPA1-3C-Mutante auf CPZ und AITC, nicht jedoch auf Carvacrol. (G) Der Unterschied in der CPZ-Empfindlichkeit zwischen den Genotypen wurde bei 100 µM CPZ aufgehoben. (H) Die Aktivierung von hTRPA1 durch CPZ kann durch den Fänger N-Acetylcystein (NAC) verhindert werden. Schwarze Spur: in Kontrollexperimenten wurden hTRPA1-HEK293-Zellen mit CPZ (50 µM; 60 s; n = 74) herausgefordert. Rote Spur: In einem separaten Experiment wurden die Zellen zunächst für 30 s einer Kombination aus CPZ (50 µM) und NAC (15 mM) ausgesetzt, unmittelbar gefolgt von CPZ allein für weitere 30 s (n = 83).
CPZ-induzierter Calcium-Zustrom durch hTRPA1
Die selektive Wirkung von CPZ auf TRPA1 wurde durch Anwendung der Calcium-Mikrofluorimetrie bestätigt. hTRPA1-HEK293-Zellen wurden durch zwei Anwendungen von CPZ (50 µM) für 10 s in 5-min-Intervallen stimuliert (Abb. 2D). Die selektiven Antagonisten HC (20 µM) und A-967079 (10 µM) wurden 1 min vor und während der ersten CPZ-Challenge appliziert. Die CPZ-Reaktion wurde von beiden Antagonisten vollständig aufgehoben. Es ist anzumerken, dass die Entfernung von HC zu einem Calciumeinstrom führte, wahrscheinlich aufgrund der verbleibenden CPZ-Wirkung, während dieser Aus-Effekt im Fall von A-967079, das sich langsamer ablösen kann, fehlte (Abb. 2D). Anschließend analysierten wir die Konzentrationsabhängigkeit von CPZ-Effekten. Zunehmende CPZ-Konzentrationen (100 nM, 500 nM, 5 µM und 50 µM) wurden auf hTRPA1-HEK293-Zellen für jeweils 20 s in 3-min-Intervallen aufgebracht. Beginnend mit 100 nM evozierten alle Konzentrationen von CPZ Calcium-Transienten mit immer größeren Amplituden (Abb. 2E). Carvacrol (100 µM) wurde am Ende des Experiments angewendet, um die funktionelle TRPA1-Expression zu kontrollieren, aber die Carvacrol-Reaktion nach 50 µM CPZ war auffällig gering, was auf eine Kreuzdesensibilisierung hindeutet. Untransfizierte HEK293-Zellen wurden den gleichen CPZ-Anwendungen unterzogen und nur die höchste getestete Konzentration (50 µM) induzierte einen minimalen Anstieg des Calciums. Wir erwarteten, dass CPZ die drei kritischen Cysteinreste in der N-terminalen Domäne des Kanals angreifen würde, da es sich um eine elektrophile Verbindung handelt. HEK293-Zellen, die WT hTRPA1 exprimieren, und Zellen, die die Triple-Cystein-Mutante hTRPA1-3C (C621S, C641S, C665S) exprimieren, wurden einer CPZ-Applikation (1 µM, 20 s) unterzogen, gefolgt von dem nicht-elektrophilen Agonisten Carvacrol (100 µM, 20 s) und dem hochelektrophilen AITC (50 µM, 30 s). Ionomycin wurde am Ende des Experiments als Positivkontrolle appliziert. Die Amplitude des durch 1 µM CPZ evozierten Calciumübergangs war in Zellen, die hTRPA1-3C exprimieren, im Vergleich zu Zellen, die WT hTRPA1 exprimieren, wesentlich reduziert (>80%) (Fig. 2F), während der Unterschied in der CPZ-Empfindlichkeit zwischen den Genotypen bei 100 µM CPZ-Konzentration aufgehoben wurde (Abb. 2G). Die AITC-Reaktion war in den mutierten Zellen verringert, während Carvacrol sowohl bei WT- als auch bei 3C-Mutanten große Calciumionentransienten hervorrief. Zusammengenommen weisen diese Zellantworten darauf hin, dass die relativ hohe Potenz von CPZ von den drei kritischen Cysteinen abhängt. Wenn die Konzentration von CPZ jedoch 100-mal höher ist, übernehmen andere Bindungsstellen die Aktivierung von hTRPA1. Diese hohe Konzentration des lipophilen CPZ könnte auch mit der zellulären Lipidmembran interagieren und indirekt TRPA1 aktivieren, wie zuvor für die Lipid-A-Komponente von Lipopolysacchariden gezeigt16. Darüber hinaus konnte in Gegenwart des elektrophilen Scavengers N-Acetylcystein (NAC) bei einer Sättigungskonzentration (15 mM) 50 µM CPZ keine Reaktion hervorgerufen werden. Nach Entfernung von NAC evozierte CPZ große Calciumtransienten in den hTRPA1-transfizierten HEK293t-Zellen (Abb. 2H), was bestätigt, dass CPZ als elektrophiler Agonist für hTRPA1 wirkt.
CPZ aktiviert eine Subpopulation von AITC-sensitiven Dorsalwurzelganglion (DRG) Neuronen
DRG Neuronen wurden in Primärkultur gehalten und durch Calcium-Mikrofluorimetrie untersucht. Die Zellen wurden durch CPZ (50 µM, 20 s) stimuliert, gefolgt von AITC (100 µM, 30 s), Capsaicin (CAP, 1 µM, 10 s) und KCl (60 mM, 30 s). Abbildung 3A zeigt Beispiele für DRG-Neuronen, die auf all diese vier Reize reagieren. Eine typische Fraktion von DRG-Neuronen wurde durch AITC aktiviert (301 von 906 Neuronen, 33%, n = 8 Mäuse), was auf eine funktionelle Expression von TRPA1 hinweist. Eine Subpopulation dieser AITC-sensitiven Neuronen wurde ebenfalls durch CPZ aktiviert (185 von 301 Neuronen, 61%). Die Empfindlichkeit gegenüber CPZ war fast vollständig auf AITC-responsive Neuronen beschränkt. Von insgesamt 200 CPZ-sensitiven Neuronen wurden 185 (93%) ebenfalls durch AITC aktiviert, was auf eine starke Übereinstimmung der Sensitivitäten gegenüber CPZ und AITC hinweist (Abb. 3). Wie im Fall von hTRPA1-exprimierenden HEK293-Zellen waren die von CPZ in DRG-Neuronen hervorgerufenen Calcium-Transienten konzentrationsabhängig mit einem EC50-Wert, der auf 30 µM CPZ geschätzt wurde, und die kleine AITC-Reaktion nach 100 µM CPZ deutete erneut auf eine Kreuzdesensibilisierung hin (Abb. 3B, C). Abbildung 3D zeigt die Überlappung der CPZ-, CAP- und AITC-Reaktionsfähigkeit in den DRG-Neuronen bei gegebenen Konzentrationen: 14% der DRG-Neuronen reagierten auf AITC, aber nicht auf CAP (125/906), 16% reagierten auf CAP, aber nicht auf AITC, während CPZ in 78% der Neuronen, die sowohl auf AITC als auch auf CAP reagierten, Kalziumtransienten induzierte (137 von 176). Um die Spezifität der beobachteten Effekte zu demonstrieren, wurden TRPV1−/− und TRPA1- / – DRG-Neuronen dem obigen Protokoll ausgesetzt. Etwa 90% der TRPV1-defizienten DRG-Neuronen, die AITC-sensitiv waren, reagierten ebenfalls auf CPZ (509/572 Zellen), während keines der 448 getesteten TRPA1-defizienten DRG-Neuronen einen Calciumzufluss als Reaktion auf CPZ (100 µM) zeigte, wie durch repräsentative Beispiele in Fig. 3E, F.
Capsazepin (CPZ) aktiviert murines TRPA1 in dorsalen Wurzelganglionneuronen.
(A) CPZ (50 µM) aktiviert eine Subpopulation von AITC (100 µM) -sensitiven Neuronen des dorsalen Wurzelganglions (DRG) der Maus. Individuelle Reaktionen von drei verschiedenen AITC- und Capsaicin (CAP, 1 µM) -sensitiven DRG-Neuronen, die durch CPZ aktiviert wurden. CPZ wurde für 20 s, AITC für 30 s und CAP für 10 s in Intervallen von 4 min angewendet, um eine Erholung zu ermöglichen. KCl (60 mM) wurde am Ende des Experiments angewendet, um die Lebensfähigkeit kultivierter Neuronen sicherzustellen. (B) Gemittelte Reaktion von n = 135 AITC-sensitiven Neuronen auf drei verschiedene Konzentrationen von CPZ (jeweils 25, 50, 100 µM, 20 s). Beachten Sie die Konzentrationsabhängigkeit der Amplitude von Ca2 + Transienten. Gerade Spuren stellen den Mittelwert dar und gepunktete Spuren stellen SEMs dar. (C) Konzentrationsabhängiger Anstieg des CPZ-induzierten i in AITC-sensitiven DRG-Neuronen, normalisiert auf einen depolarisierenden Stimulus mit KCl (60 mM). Die EC50 von ∼30 µM wurde durch Anpassung an die Dosis-Wirkungs-Funktion berechnet. Die Daten sind repräsentativ für zwei Versuchsreihen und zeigen Mittelwerte ± REM; für CPZ 1, 10, 25 µM: n = 169, für CPZ 25, 50, 100 µM: n = 138. (D) Darstellung von Populationen von CPZ-, AITC- und CAP-sensitiven DRG-Neuronen und deren Überlappung. In insgesamt 906 abgebildeten Neuronen (ausgewählt durch ihre Reaktion auf KCl) wurden 200 (22%) durch CPZ (50 µM), 301 (33%) durch AITC (100 µM) und 323 (36%) durch CAP (1 µM) aktiviert (detaillierte Analyse der Fraktionen, siehe SI Abbildung Legende 3). (E) CPZ (100 µM, 20 s) aktiviert AITC (100 µM, 20 s) -empfindliche DRG-Neuronen von TRPV1-defizienten Mäusen. Individuelle Antworten von verschiedenen AITC-sensitiven Neuronen, die durch CPZ aktiviert wurden. Etwa 90% (509/572 Zellen) der TRPV1-defizienten DRG-Neuronen, die AITC-sensitiv waren, reagierten auf CPZ. CAP (1 µM, 10 s) induzierte keine Ca2+ −Transienten in TRPV1−/- Neuronen. (F) Mangel an CPZ (100 µM) -induziertem Ca2 + -Zustrom in TRPA1-defizienten DRG-Neuronen. Individuelle Antworten von verschiedenen CAP (1 µM) -sensitiven DRG-Neuronen (von 448 getesteten Neuronen), die weder durch CPZ noch durch AITC (10 µM) aktiviert wurden.
Systemische Desensibilisierung durch TRPA1 lindert Schmerzen
Nachdem wir entdeckt hatten, dass CPZ ein potenter TRPA1-Agonist ist, verstanden wir, warum die ersten CPZ-Einläufe (zweimal täglich) bei den WT-Mäusen offensichtlich schmerzhaft waren. Anschließend quantifizierten wir das CPZ (531 µM) Klistier-induzierte nozifensive Verhalten bei gesunden Tieren (jeweils n = 6), indem wir die Krümmungsreaktionen zählten und viszeromotorische Reflexreaktionen (VMRs) durch die integrierte Elektromyographie (EMG) der Bauchmuskelwand aufzeichneten (Abb. 4A, B). Im Verlauf der Wiederholung der zweimal täglichen CPZ-Behandlungen stellten wir fest, dass die TRPA1-Knockouts zu keinem Zeitpunkt ein schmerzbezogenes Verhalten zeigten. Darüber hinaus zeigten die WT-Mäuse eine progressive Abnahme der anfänglich starken Schmerzreaktionen mit einem steilen Rückgang um Tag 3, was zu einer schließlich vollständigen Desensibilisierung in beiden nozifensiven Parametern führte. Dieser Verlust der Schmerzwahrnehmung im Dickdarm bei ansonsten normalen Mäusen erhöhte die Erwartung, dass die Einläufe CPZ eine pharmakodynamische Menge geliefert haben könnten, die ausreicht, um systemische Hypoalgesie zu induzieren. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir den Eye-Wipe-Test mit AITC (100 µM) und CAP (1 mM) (Abb. 4C,D) (n = 6). Beide Tests zeigten eine deutliche Abschwächung der Augentuschzahlen bei den WT-Mäusen, die mit CPZ-Einläufen behandelt worden waren (bis 12-16 h vor dem Test). Diese Effekte wurden höchstwahrscheinlich eher durch TRPA1-Desensibilisierung als durch TRPV1-Blockierung vermittelt, da TRPV1-defiziente Mäuse gegenüber einer Instillation von Senföl (AITC, 100 µM) in das Auge in gleichem Maße unempfindlich waren wie WT-Mäuse (Abb. 4C). Umgekehrt waren CPZ-Einläufe bei TRPA1− / −Mäusen unwirksam, wenn diese Mäuse durch CAP-Instillationen in das Auge herausgefordert wurden (Abb. 4D).
Capsazepin-Einläufe desensibilisieren lokale und entfernte Schmerzreaktionen.
(A) Akute Writhing-Reaktionen als Reaktion auf CPZ (531 µM) -Einläufe während der ersten 5 Minuten nach der Anwendung. Wiederholte CPZ-Einläufe (zweimal täglich) führten zu einer fortschreitenden Abnahme der sich windenden Reaktionen. Eine dramatische Schrittreduktion wurde nach 5 Einläufen bei WT-Mäusen beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten TRPA1− /− Mäuse, die mit CPZ (531 µM) behandelt wurden, oder WT-Mäuse, die mit Vehikel (PBS) -Einläufen behandelt wurden, nur wenige Writhings, die innerhalb der ersten 30 s auftraten (jeweils n = 6). (B) Viszeromotorische Reaktionen (VMRs) auf CPZ-Einläufe. CPZ-Einläufe zweimal täglich führten zu einer kontinuierlichen Abnahme der VMRs bei WT-Mäusen, ähnlich dem Verlauf von Writhing-Reaktionen. VMRs als Reaktion auf Vehikel unterschieden sich nicht signifikant von denen zu CPZ−Einläufen in TRPA1−/ – (beide n = 6). (A, B) WT CPZ-Gruppe im Vergleich zur Fahrzeuggruppe. (C) Wiederholte CPZ-Einläufe dämpfen das Abwischverhalten der Augen auf AITC (100 µM). Sowohl WT− als auch TRPV1− / –Mäuse, die mit CPZ-Einläufen behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu Vehikeln eine tiefgreifende Verringerung der Anzahl der Augenabwischungen (beide n = 6). Die Kontrollen bestanden aus Mäusen ohne Einläufe, die Vehikel (PBS) -Tropfen in das Auge erhielten. (D) CPZ-Einläufe dämpfen das Abwischverhalten der Augen auf die KAPPE (1 mM). WT-Mäuse, die mit Vehikel behandelt wurden, und TRPA1− / − Mäuse, die zweimal täglich für 7 d mit CPZ-Einläufen behandelt wurden, zeigten zahlreiche augenähnliche Reaktionen auf die Instillation der KAPPE in das Auge, getestet 12 h nach dem letzten CPZ-Einlauf (beide n = 6). WT-Mäuse, die mit CPZ-Einläufen behandelt wurden, zeigten eine tiefgreifende Verringerung der Anzahl der Augenwischtücher. (E) Thermische und (F) mechanische Entzugsschwellen beider Hindpaws im Verlauf der oralen CPZ- (531 µM) oder AITC- (500 µM) Medikation über Trinkwasser. (E) CPZ und AITC über 10 d im Vergleich zur vehikelbehandelten Gruppe induzierten während 3-5 d einen progressiven Anstieg der Entzugslatenzen zur Strahlungswärmestimulation, der sich innerhalb von 2 Wochen nach dem Auswaschen normalisierte (jeweils n = 6). (F) Mechanische Schwellenwerte zur Stimulation mit einem elektrodynamischen von-Frey-Filament zeigten keinen systematischen Trend unter beiden Verbindungen (jeweils n = 6). Alle wiederholten Maßnahmen ANOVA und Dunnett Post-Test, außer in (C,D) Mann Whitney U-Test.
Da wiederholte Einläufe ein unangenehmer Verabreichungsweg sind, haben wir eine mögliche anti-nozizeptive Wirkung von peroralem CPZ (531 µM) im Trinkwasser getestet. Das Trinkregime über 10 Tage wurde gut vertragen, ohne dass offensichtliche Nebenwirkungen auftraten. Im Verlauf der kontinuierlichen oralen CPZ-Verabreichung nahm die Pfotenentzugslatenz gegenüber der Strahlungswärmestimulation (Hargreaves-Methode) in beiden Hinterbeinen progressiv zu (Abb. 4E). Die Toleranzzeit war an Tag 7 etwa verdoppelt und blieb von Tag 2 bis 10 signifikant erhöht. Nach 2 Wochen Erholung mit reinem Trinkwasser waren die Entzugslatenzen auf das Ausgangsniveau zurückgekehrt. Die mechanische Reaktionsfähigkeit auf Stimulation mit der linear ansteigenden Kraft eines elektrodynamischen von Frey-Filaments wurde während der zehntägigen CPZ-Behandlung nicht signifikant beeinflusst (Abb. 4F). Es stellte sich die Frage, ob die Hitze- und chemische Hypoalgesie einen Klasseneffekt der Desensibilisierung von TRPA1-Agonisten darstellte oder ob sie spezifisch für CPZ war. So verabreichten wir AITC in einer ähnlichen und gut verträglichen Konzentration (500 µM) über das Trinkwasser. Das gleiche Dosierungsschema für AITC wie für CPZ beschrieben führte zu einer progressiven Erhöhung der Paw-Entzugslatenz gegenüber der Strahlungswärmestimulation, die signifikant geringer war als die durch CPZ induzierte (Abb. 4E). Die mechanische Reaktionsfähigkeit wurde unter dem AITC-Trinkregime nicht verändert (Abb. 4F).
CPZ bewirkt nachhaltige Desensibilisierung von TRPA1/TRPV1-exprimierenden peptidergen sensorischen Neuronen
Wir haben dann die Frage gestellt, ob die Desensibilisierung ganzer Tiere durch CPZ auf zellulärer Ebene reproduziert werden kann. Zu diesem Zweck führten wir Calcium-Imaging-Experimente mit isolierten DRG-Neuronen durch, die von Kontrollmäusen und von Tieren erhalten wurden, die 7 Tage lang zweimal täglich mit CPZ-Einläufen behandelt wurden. Diese Neuronen wurden notwendigerweise 16 bis 24 Stunden in Gegenwart von NGF in Kultur gehalten. Insgesamt wurden 399 Neuronen von Kontrollmäusen und 584 Neuronen von einlaufbehandelten Mäusen mit Fura-2 beladen und Calcium-Transienten, die durch AITC, Carvacrol, CAP und eine KCl-reiche Lösung hervorgerufen wurden, aufgezeichnet. Die Reaktionen auf diese TRPA1 (AITC und Carvacrol) – und TRPV1 (CAP) -Agonisten unterschieden sich in DRG-Neuronen nicht signifikant von Kontrolltieren und einlaufbehandelten Tieren (Abb. S1). Die TRPA1-mRNA-Expression (qPCR) war jedoch in lumbosakraler DRG, die unmittelbar nach dem endgültigen CPZ-Einlauf hergestellt wurde, etwa doppelt so hochreguliert (Abb. S2), während nach Ablauf von 24 h in vivo nach dem letzten Einlauf keine Veränderung der TRPA1-Expression festgestellt wurde. Die TRPV1-mRNA veränderte sich unter beiden Umständen nicht. Somit hatte aufgrund der multiplen CPZ-Einläufe eine transkriptionelle Hochregulation der TRPA1-Genexpression stattgefunden, die jedoch bei Absetzen der CPZ-Versorgung rasch rückgängig gemacht wurde. Unter DRG-Kultivierungsbedingungen hatte wahrscheinlich die gleiche epigenetische Umkehrung stattgefunden und alle verbleibenden CPZ wurden wahrscheinlich ausgewaschen, so dass tatsächlich keine restliche Desensibilisierung zu erwarten war. Da die zellulären Modelle die überdauernde CPZ-induzierte Desensibilisierung der gesamten Tiere in vivo nicht widerspiegelten, suchten wir nach einem weiteren starken Indikator für die überraschende systemische Wirkung. Die Mehrheit der nozizeptiven Neuronen ist peptiderg und exprimiert überwiegend Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid (CGRP) und Substanz P (SP) 15,17. Bei der Depolarisation, wie durch KCl und Calciumzufluss, werden diese Neuropeptide aufgrund der Aktivierung spannungsgesteuerter Calciumkanäle in einer quasi-efferenten Funktion aus den Nervenfasern freigesetzt (neurogene Entzündung). Andererseits sind aktivierte TRP-Kanäle selbst sehr gute Calciumleiter und benötigen keine Unterstützung durch spannungsgesteuerte Natrium- oder Calciumkanäle, um eine vesikuläre Exozytose von CGRP18 hervorzurufen. Somit kann die stimulierte Freisetzung von CGRP als Index der (peptidergen) Nozizeptoraktivierung dienen. Aus dem gleichen Grund haben vasoaktive Neuropeptide verschiedene Auswirkungen auf den Entzündungsprozess an sich, und es wurde gezeigt, dass eine Depletion oder Desensibilisierung der peptidergen sensorischen Neuronenpopulation Colitis19,20,21 abschwächt. Um festzustellen, ob CPZ (531 µM) -Einläufe lokal und systemisch durch TRPA1 desensibilisieren, verwendeten wir isolierte Maus-Colon- und Hautpräparate. Doppelpunkte gesunder C57BL / 6-Mäuse (n = 8) wurden einer CPZ (100 µM) ausgesetzt, die eine massive CGRP-Freisetzung induzierte (Abb. 5); nachfolgende Anwendungen von AITC (100 µM) 5 min oder 15 min nach CPZ (Abb. 5A,B) konnte keine CGRP-Freisetzung mehr induzieren, was auf eine tiefgreifende akute funktionelle Kreuzdesensibilisierung gegenüber dem TRPA1-Agonisten hindeutet. Dieser Effekt kann nicht auf eine Depletion zurückzuführen sein, da die resultierende KCl-Reaktion (60 mM) normal war. Doppelpunkte von Mäusen, die wiederholt in vivo zweimal täglich für 7 d mit CPZ (531 µM) -Einläufen behandelt worden waren, wurden isoliert und 12-16 h nach dem letzten Einlauf getestet. Weder CPZ (100 µM) noch AITC (100 µM) induzierten in diesem Zustand eine CGRP-Freisetzung (Abb. 5C, D); insbesondere wurde die CAP (30 nM) -induzierte CGRP-Freisetzung stark reduziert, aber nicht aufgehoben (Abb. 5E). Im Gegensatz dazu war die KCl (60 mM) -induzierte CGRP-Freisetzung durch unspezifische Depolarisation nicht nur nicht reduziert, sondern nach den CPZ-Einläufen tatsächlich verstärkt. Dies deutete darauf hin, dass die Nervenfasern des Dickdarms nicht an CGRP verarmt, sondern überfüllt waren, aber im Wesentlichen nachhaltig desensibilisiert gegenüber chemischer Aktivierung durch TRPA1 sowie TRPV1 (n = 6). Schließlich zeigte auch das 12-16 h nach dem letzten CPZ-Einlauf isolierte Hautpräparat, dass die AITC (100 µM) und CAP (1 µM) -induzierte CGRP-Freisetzung entsprechend der in den Verhaltenstests beobachteten körperweiten Desensibilisierung stark reduziert war (Abb. 5F, G, siehe Fig. 4A-F) (n = 6).
Lokale und systemische Desensibilisierung von peptidergen sensorischen Nerven durch Capsazepin (CPZ), angezeigt durch veränderte Freisetzung von Calcitonin-Gen-related Peptide (CGRP).(A) Akute CGRP-Freisetzung aus isolierten Kolonpräparaten von WT-Mäusen, induziert durch CPZ (100 µM); Nachfolgende Senföl-Expositionen (AITC, 100 µM) induzieren keine CGRP-Freisetzung, während eine unspezifische Depolarisation durch KCl (60 mM) normal wirksam ist. Die Daten sind Mittelwerte + SEMs (n = 8). (B-D) Die CPZ (100 µM) – und AITC (100 µM) -induzierte kolonische CGRP-Freisetzung wurde bei Mäusen, die bis zum Tag vor dem Freisetzungsexperiment mit zweimal täglichen CPZ-Einläufen für 7 d vorbehandelt wurden, abgeschafft, während die CAP (1 µM) -induzierte kolonische CGRP-Freisetzung bei diesen Mäusen im Vergleich zu Kontrollen stark reduziert, aber nicht aufgehoben wurde. (**P < 0.01, ***P < 0.001, Mann Whitney U-Test, jeweils n = 6). (E) In ähnlicher Weise wurde die AITC (100 µM) -induzierte CGRP-Freisetzung in isolierten Hautpräparaten aus den Hindpaws von Mäusen, die mit CPZ-Einläufen vorbehandelt waren, aufgehoben. (F) Im Gegensatz dazu war die CAP (1 µM) -induzierte CGRP-Freisetzung von der Haut dieser Mäuse im Vergleich zu Kontrollen stark reduziert. (**P < 0.01, ***P < 0.001, Mann Whitney U-Test, jeweils n = 6). Beachten Sie, dass alle KCl (60 mM) -Reaktionen nach desensibilisierten CPZ- und AITC-Reaktionen normal waren (B, C, E), während die KCl-Reaktionen der unvollständig desensibilisierten CAP-stimulierten Neuronenpopulation (D, F) ebenso stark reduziert waren wie in allen Kontrollexperimenten, was auf eine Erschöpfung des CGRP-Speichers hindeutet, die durch eine wirksame Desensibilisierung der CPZ / AITC-sensitiven Neuronen-Subpopulation verhindert wird.
