Ergebnisse

Identifizierung von IL-7-Rezeptor α-Kette (CD127) als Marker für Speicher-T-Zellen. Auf der Suche nach neuen Markern zur Definition von Effektor- und Gedächtnis-T-Zell-Teilmengen in der Maus analysierten wir die Oberflächenexpression des IL-7-Rezeptors α-chain / CD127 (Abb. 1a ). Während der primären Reaktionen auf Lm können verschiedene Subpopulationen von antigenspezifischen Milz-T-Zell-Populationen basierend auf CD127-Expressionsniveaus unterschieden werden. CD127 niedrig exprimierende Zellen (CD127low) überwiegen während der akuten Effektorphase. Während des Übergangs in die Speicher-T-Zell-Phase verschwinden CD127low-Zellen jedoch allmählich, während Populationen, die hohe Spiegel (CD127high) exprimieren, im Laufe der Zeit bemerkenswert stabil bleiben (Abb. 1 a und c). Diese unterschiedlichen kinetischen Werte deuten stark darauf hin, dass die CD127-Expression eine selektive Eigenschaft für langlebige Gedächtnis-T-Zellen ist. Während der Effektorphase wandern cd127niedrige CD8+ T-Zellen bevorzugt zu nichtlymphoiden Organen, während in LN nur CD127hohe CD8 + T-Zellen nachgewiesen werden (Abb. 1b ). Die Milz stellt ein „Zwischenorgan“ dar, in dem alle verschiedenen Subpopulationen früh nach der Immunisierung gefunden werden (22, 23). Später während der Gedächtnisphase sind antigenspezifische T-Zellen in allen Organen durch einen CD127high-Phänotyp gekennzeichnet (Abb. 1 b und c). Ein Vergleich der Fähigkeit von CD127low- und CD127high-Antigen-spezifischen T-Zellen, sich als Reaktion auf Stimulation zu vermehren, ergab auffällige Unterschiede zwischen den beiden Untergruppen. Wie in Fig. 1d , gereinigte Listeria-spezifische CD127high T-Zellen vermehren sich schnell nach Anti-CD3-Stimulation, während CD127low T-Zellen schlecht vermehren. Es ist unwahrscheinlich, dass diese Unterschiede in der Proliferation einen Vorteil von CD127-positiven Zellen durch Ab-vermittelte IL-7R-Stimulation widerspiegeln, da verschiedene mAb-Klone mit bekannter CD127-aktivierender oder blockierender Aktivität den gleichen Effekt in kurzfristigen In-vitro-Stimulationsassays zeigten (Daten nicht gezeigt).

Um direkter zu demonstrieren, dass langlebige Gedächtnis-T-Zellen ausschließlich im CD127-hochexprimierenden Kompartiment früh nach dem In vivo-Priming vorhanden sind, führten wir adoptive Transferstudien durch, indem wir eine kürzlich entwickelte reversible MHC-Multimer-Färbetechnik (21) verwendeten, um antigenspezifische T-Zellen direkt ex vivo funktionell zu isolieren. Nach adoptivem Transfer von cd127hohen LLO91-99-spezifischen T-Zellen aus 10 Tage mit Lm infizierten Mäusen waren die transferierten Zellen noch einige Wochen später in der Milz naiver Empfängermäuse nachweisbar (Abb. 2a), während die Zellzahlen nach Transfer von cd127-Stammzellen an der Nachweisgrenze lagen. Diese Beobachtung war nicht auf Unterschiede der In-vivo-Migration von übertragenen CD127-High- und CD127-Low-Zellen zurückzuführen, da wir ähnliche Unterschiede für die Lunge fanden (Abb. 2a) und andere Organe (LN und Leber, Daten nicht gezeigt). Um die Interpretation weiter zu unterstützen, dass CD127high T-Zellen ausschließlich antigenspezifische Gedächtniszellen aufrechterhalten, wurden Empfängermäuse nach adoptivem Transfer mit Listerieninfektion herausgefordert. Wiederum war nur bei Mäusen, die vor der Infektion CD127hohe T-Zellen erhalten hatten, eine schnelle Expansion von übertragenen LLO91-99-spezifischen T-Zellen nachweisbar (Abb. 2b ). Auch dieses Ergebnis war nicht auf Unterschiede in der Migration zurückzuführen, da in keinem anderen Organ die Erhaltung oder Expansion von übertragenen cd127-T-Zellen nachweisbar war (Abb. 2b und nicht dargestellte Daten). Obwohl diese Ergebnisse aus adoptiven Transferstudien die Hypothese, dass langlebige Gedächtnis-T-Zellen ausschließlich im CD127high-T-Zellen-Kompartiment vorhanden sind, stark unterstützen, beobachteten wir auch erhebliche Einschränkungen dieses experimentellen Ansatzes. Insbesondere Gedächtnis-T-Zellen mit Soforteffektorfunktion scheinen sehr empfindlich gegenüber adoptiven Transferexperimenten zu sein und sterben nach Reinigung und i.v.-Anwendung schnell ab; obwohl sie Monate bis Jahre überleben, wenn sie in vivo unberührt bleiben (11). Obwohl unsere Ergebnisse aus dem adoptiven Transfer mit der Interpretation übereinstimmen, dass CD127 ein Marker für langlebige Gedächtnis-T-Zellen ist, können wir nicht ausschließen, dass intrinsische Probleme bezüglich des Überlebens verschiedener T-Zell-Subpopulationen ebenfalls zum Ergebnis dieser Experimente beitragen.

Die Befleckung von Antigen-spezifischen T-Zell-Populationen mit CD127 und CD62L ermöglicht die Unterscheidung zwischen Speicher-T-Zell-Subpopulationen. Eine weitere Charakterisierung der CD127high T-Zellpopulation zeigte, dass sie in Subpopulationen unterteilt werden kann, die hohe und niedrige CD62L-Spiegel exprimieren (Abb. 3). Die direkte ex vivo Funktionsanalyse (21) gereinigter T-Zellen (10-12 Tage nach Infektion, wenn alle Subpopulationen gleichzeitig in der Milz nachweisbar sind) deckte weitere funktionelle Unterschiede auf. Während CD62Llow T-Zell-Untergruppen eine kräftige und unmittelbare ex vivo zytolytische Aktivität zeigen, zeigen CD127high / CD62Lhigh T-Zellen eine sehr schlechte Lyse von peptidbeschichteten Zielzellen (Abb. 3). Die intrazelluläre Zytokinfärbung von sortierten Subpopulationen ergab, dass CD127high / CD62Llow T-Zellen wie die CD127low / CD62Llow-Untergruppe die Effektorzytokine INF-γ und Tumornekrosefaktor α produzieren; Im Gegensatz dazu produziert die CD127high / CD62Lhigh-Untergruppe IL-2, jedoch nicht IFN-γ und Tumornekrosefaktor α. Somit ermöglicht die Markerkombination von CD127 und CD62L die Identifizierung von T-Zell-Subpopulationen mit Eigenschaften, die den zuvor beim Menschen beschriebenen sehr ähnlich sind. CD127low / CD62Llow T-Zellen zeigen alle bekannten Eigenschaften einer echten Effektor-T-Zellpopulation (TE, schlechte proliferative Aktivität, begrenztes In-vivo-Überleben und sofortige Effektorfunktion). Die CD127high / CD62Lhigh-Teilmenge entspricht den Eigenschaften von TCM, und die CD127high / CD62Llow-T-Zellen passen zur Beschreibung von TEM.

Die Erzeugung verschiedener Speicher-T-Zell-Subpopulationen hängt von der CD40L-vermittelten T-Zell-Hilfe ab. Da wir der Meinung waren, dass es problematisch sein könnte, die Interpretation, dass die CD127-Expression als Marker zur Unterscheidung zwischen Effektor- und Langzeitgedächtnis-T-Zellen verwendet werden kann, ausschließlich auf adoptive Zelltransferexperimente zu stützen, beschlossen wir, Mausmutantenlinien mit Defekten bei der Erzeugung von T-Zellgedächtnis zu analysieren. Wenn CD127 tatsächlich ein „früher“ Gedächtnis-T-Zell-Marker ist, sollten wir in der Lage sein, Unterschiede während früher und später Zeitpunkte innerhalb der CD127-positiven Teilmengen bei Mäusen mit Gedächtnisdefekten zu identifizieren.Da neuere Studien die Bedeutung der T-Zell-Hilfe für die Erzeugung lang anhaltender Gedächtnisreaktionen zeigten (2-4), haben wir uns entschlossen, festzustellen, ob die Anwesenheit oder Abwesenheit von CD4 + T-Zell-Hilfe während des CD8 + T-Zell-Primings zu Unterschieden in der antigenspezifischen T-Zell-Teilmenge führt Zusammensetzungen, die in der frühen Posteffektorphase nachgewiesen wurden. MHC II-defiziente Mäuse, denen herkömmliche CD4 + T-Zellen fehlen, haben eine defekte CD8 + -Speicherantwort, und die Schutzqualität nimmt mit der Zeit ab (2-4). Die Färbung für T-Zell-Subpopulationen 10 Tage nach der Primärinfektion ergab, dass die CD127high / CD62Llow–Untergruppe in MHC II– /- Mäusen fast vollständig fehlt (Abb. 4a); Die anderen Subpopulationen sind mit ähnlichen Frequenzen wie bei WT C57BL / 6-Mäusen vorhanden. Diese Daten zeigen, dass das Fehlen von T-Zell-Hilfe die effiziente Erzeugung einer T-Zell-Untergruppe mit einem Effektor-Gedächtnis-Phänotyp verhindert, was für eine schnelle In-vivo-Expansion und Effektorfunktion entscheidend zu sein scheint.

Da wichtige Mechanismen der CD4+ T–Zell–Hilfe durch die Interaktion von CD40 und CD40L vermittelt werden (24-26), untersuchten wir, ob CD40L–/– Mäuse einen ähnlichen Phänotyp aufweisen wie MHC II-/- Mäuse. In Übereinstimmung mit anderen neueren Studien (27) zeigen CD40L– / – Mäuse keine Unterschiede in der bakteriellen Belastung oder bakteriellen Clearance nach primärer Listerieninfektion (Daten nicht gezeigt) und haben normale primäre CD8 + T-Zell-Reaktionen auf eine subletale Dosis von Lm (Abb. 4c ). Ihre Fähigkeit, eine Reinfektion mit einer höheren Lm-Dosis (≈10 × LD50) schnell zu beseitigen, ist jedoch verringert (Abb. 4b), die mit beeinträchtigten CD8+ -Gedächtnis-T-Zell-Antworten korrelieren (Abb. 4c) und eine stark reduzierte CD127high/CD62Llow-Teilmenge (Abb. 4e und f) während der frühen Posteffektorphase. Während der Reinfektion mit Listerien ist die Proliferation von antwortenden T–Zellen in CD40L– / – Mäusen äquivalent zu der von Zellpopulationen in WT-Mäusen, was darauf hinweist, dass der Phänotyp nicht auf einen allgemeinen Defekt in der Proliferationskapazität von Speicher-T-Zellen zurückzuführen ist (Abb. 4d), sondern auf eine verringerte Anzahl von Gedächtnis-T-Zellen, die in der Lage sind, sofort auf Antigen-Reencounter zu reagieren. Dieser Phänotyp wurde durch in vivo-Markierungsexperimente nachgewiesen, bei denen BrdUrd während der gesamten Expansionsphase eingebaut wurde (Abb. 4d) und durch In vivo BrdUrd Pulse–Chase-Studien zur Überwachung des Markierungsverlusts bei der Proliferation (Daten nicht gezeigt).

Die reduzierte Erzeugung von T-Zell-Teilmengen mit einem Effektor-Speicherphänotyp früh nach dem Priming wird in den späten Speicher-T-Zell-Pool übertragen. Unsere Daten zeigen, dass in Abwesenheit von CD4 + T-Zellen oder CD40L die CD127high / CD62Llow T-Zell-Untergruppe früh nach dem Priming signifikant reduziert ist. Ferner werden wir (Fig. 4b) und andere (3-5) zeigten, dass eine beeinträchtigte T-Zell-Hilfe während des T-Zell-Primings zu Veränderungen in der Qualität der schützenden Immunität gegenüber einer Reinfektion mit Lm oder lymphozytischem Choriomeningitis-Virus führt. Um den beobachteten Defekt in der frühen Generation von CD127high / CD62Llow T-Zellen klarer mit der Qualität des nachfolgenden T-Zellgedächtnisses in diesen Mäusen zu verknüpfen, analysierten wir antigenspezifische T-Zellpopulationen während der Gedächtnisphase (5 wk nach primärer Listerieninfektion) genauer. Zu diesem Zeitpunkt muss die Analyse von antigenspezifischen T-Zellen an Zellen durchgeführt werden, die aufgrund ihres unterschiedlichen Migrationsverhaltens aus verschiedenen Geweben stammen. Neben der Milz wählten wir LN als repräsentatives Gewebe für lymphatische Organe und die Lunge als typisches peripheres, nichtlymphoides Kompartiment. Zu diesem Zeitpunkt sind die antigenspezifischen T-Zellen in diesen Organen fast alle CD127hoch (Abb. 1b); Die Zellen in der Lunge sind CD62Llow (Daten nicht gezeigt), während die meisten antigen-spezifischen Speicher-T-Zellen in der LN CD62Lhigh sind (Abb. 5b). Um die Anzahl der antigen-spezifischen Gedächtnis-T-Zellen mit klarer Soforteffektorfunktion in den verschiedenen Organen zu bestimmen, führten wir eine intrazelluläre Zytokinfärbung für IFN-γ durch. Wie in Fig. 5a sind CD40L-/- Mäuse im Vergleich zu WT-Mäusen durch eine wesentlich verminderte Anzahl an Antigen-spezifischen Gedächtnis-T-Zellen mit Soforteffektorfunktion gekennzeichnet. Dieses Ergebnis gilt auf der Ebene der Frequenzen (Prozentsatz) innerhalb des CD8 + T-Zellkompartiments und in absoluten Zahlen (Abb. 5a). Die MHC-Tetramerfärbung von LN-abgeleiteten Lymphozyten (Abb. 5b) zeigten nahezu identische Anzahlen antigen-spezifischer T-Zellen mit einem cd62lhohen Phänotyp. Einige CD62Llow-Antigen-spezifische T-Zellen sind auch in LNs von WT-Mäusen nachweisbar, was mit den Frequenzen von IFN-γ-produzierenden Zellen korreliert (Abb. 5a). Diese Population fehlt grundsätzlich in LNs von CD40L- / – Mäusen; Die gesamte CD8 + / CD62Llow–Teilmenge ist in CD40L– / – Mäusen reduziert, was auf einen allgemeinen Defekt bei der Erzeugung dieser T-Zell-Teilmenge hindeutet. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass die Abwesenheit von CD40L-abhängiger CD4 + T-Zellhilfe während der Primingperiode zu quantitativen Unterschieden in antigenspezifischen CD8 + T-Zell-Subpopulationen führt, wobei die Anzahl der Zellen, die einen Effektorgedächtnisphänotyp aufweisen, stark reduziert ist (CD127high / CD62Llow). Diese quantitativen Unterschiede in Zellen mit sofortiger früher Effektorfunktion werden in die Gedächtnisphase übertragen und beeinflussen die Qualität der schützenden Immunität.