Herstellung von Proteinkomponenten zur Rekonstitution

Komponenten des E. coli-Translationsapparates, einschließlich Translationsfaktoren und aaRS, wurden wie zuvor beschrieben46 hergestellt. Herstellung von RNaseP-Komponenten, M1-RNA und C5-Protein wurden ebenfalls wie zuvor beschrieben hergestellt29. Wir modifizierten das Protokoll für das C5-Protein, indem wir es mit 80% gesättigtem Ammoniumsulfat fällten und durch Dialysieren gegen Puffer A (50 mM Natriumacetat pH 6,5, 5 mM EDTA, 0,25 M NaCl und 7 mM 2-Mercaptoethanol) lösten. Der entstandene Niederschlag wurde abzentrifugiert und durch Dialysieren gegen Puffer B bestehend aus 50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM NH4Cl, 6 M Harnstoff und 10 mM Dithiothreitol (DTT) gelöst. Gelöste Proteine wurden auf eine 5 ml HiTrap SP HP Säule (#17115101, GE Healthcare, USA) aufgebracht, mit Puffer B enthaltend 7 mM 2-Mercaptoethanol als Ersatz für 10 mM DTT gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 100 mM bis 2 M NH4Cl in Puffer B eluiert. Fraktionen enthaltend C5-Protein wurden mittels SDS-PAGE analysiert, gewonnen, gegen Puffer D (50 mM HEPES-KOH pH 7,6, 0,8 M NH4Cl, 10 mM MgCl 2, 2 M Harnstoff, 7 mM 2-Mercaptoethanol), dann weiter gegen Puffer D ohne Harnstoff dialysiert. Erhaltene Lösungen wurden mit einem Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) eingeengt und gegen Puffer D ohne Harnstoff mit 50% Glycerin dialysiert. Das gereinigte C5-Protein wurde bei -30 °C gelagert.

Herstellung von Modifikationsenzymen für iVTtRNAs

Modifikationsenzyme für iVTtRNAs wurden wie folgt hergestellt. E. coli-Gene von TSAb, TsaC, TsaD, TsaE, TrmD, GlyA, MnmC, MnmE und GidA wurden aus dem E. coli A19-Genom unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert (Ergänzende Daten 5). Amplifizierte Gene für TsaC, TsaD, TsaE, GlyA, MnmC, MnmE und GidA wurden in pET15b (# 69661, Merck Millipore, USA) als kleine Ubiquitin-like Modifier (SUMO) Proteinfusionsproteine kloniert, wobei His-Tag, SUMO-Protein und Modifikationsenzyme tandemartig angeordnet wurden. Gene für TSAb und TrmD wurden als His-Tag-Fusionsprotein in pET15b kloniert. Alle Gene wurden mit Gibson assembly technique (#E2611, New England Biolabs, USA) kloniert. Resultierende Plasmide wurden in einen E. coli BL21(DE3) Stamm transformiert und in 1 L LB Medium zu einem OD660 von 0,6–1,0 bei 37°C gezüchtet. Die Überexpression wurde durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM für TSAb, TsaC, TsaD, TsaE und TrmD oder 0,1 mM für GlyA, MnmC, MnmE und GidA induziert. Nach 3 h Kultivierung bei 37°C wurden Zellen geerntet. TSAb-, TsaC-, TsaE-, TrmD- und MnmE-überexprimierte Zellen wurden in 40 ml Lysepuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2 und 7 mM 2-Mercaptoethanol) resuspendiert und durch Beschallung aufgeschlossen. Resultierendes Lysat wurde zentrifugiert und der Überstand wurde zurückgewonnen und mit 5 ml vollständigem His-tag Reinigungsharz (#05893801001, Roche, Schweiz) für 1 h mit Rotator gemischt. Das Harz wurde mit 100 ml Lysepuffer gewaschen und anschließend das Protein mit 25 ml Elutionspuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 400 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 400 mM Imidazol und 7 mM 2-Mercaptoethanol) eluiert. TSAb und TrmD wurden mit Amicon Ultra 3 kDa (#UFC800324, Merck Millipore, USA) aufkonzentriert und anschließend gegen Stammpuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7) dialysiert.6.500 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 7 mM 2-Mercaptoethanol und 30% Glycerin). Sie wurden mit flüssigem Stickstoff blitzgefroren und bei -80°C gelagert. Für TsaC, TsaE und MnmE wurde den gewonnenen Fraktionen Ulp1 (#12588018, Thermo Fischer Scientific, USA) bis zu einer Endkonzentration von 23 µg/ml zugegeben, um das His-markierte SUMO-Protein zu entfernen. Die Fraktionen wurden über Nacht gegen Spaltpuffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl und 7 mM 2-Mercaptoethanol) dialysiert, während der Spaltpuffer 500 mM KCl zur MnmE-Herstellung enthielt. Die dialysierten Proben wurden erneut mit 5 ml vollständigem His-Tag-Reinigungsharz mit Rotator vermischt. Dann wurden die Durchflussfraktionen, die Modifikationsenzyme enthalten, gesammelt. Die gewonnenen Proben wurden mit Amicon Ultra 3 kDa für TsaE oder Amicon Ultra 10 kDa (#UFC901024, Merck Millipore, USA) für TsaC und MnmE konzentriert. Sie wurden gegen Stammpuffer dialysiert, mit flüssigem Stickstoff blitzgefroren und bei -80 ° C gelagert. Für die GlyA-Herstellung enthielten alle Puffer 10% Glycerin und die anderen Verfahren waren die gleichen wie für die MnmE-Herstellung. TsaD erwies sich nach Beschallung als unlöslich. Daher wurde das Protein durch Zentrifugation bei 20.400×g bei 4°C für 45 min pelletiert und in Lysepuffer, ergänzt mit 4% Triton X-100, resuspendiert. Die Suspension wurde erneut durch Zentrifugation bei 20.400×g für 45 min pelletiert. Das Pellet wurde mit Lysepuffer, ergänzt mit 6 M Harnstoff, gelöst. Die andere Vorgehensweise war dieselbe wie bei der MnmE-Herstellung, mit dem Unterschied, dass alle Puffer 2 M Harnstoff enthielten. Für die MnmC-Präparation waren alle Schritte bis zur Entfernung des His-markierten SUMO-Proteins dieselben wie für die GlyA-Präparation. Da MnmC unspezifisch an das His-Tag-Reinigungsharz gebunden ist, wurde die Reinigung mit Anionenaustauscherchromatographie gewählt. Die Lösung wurde nach Ulp1-Behandlung gegen IEX-Puffer (50 mM Hepes-KOH, pH 7,6, 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2 und 7 mM 2-Mercaptoethanol) dialysiert und anschließend auf eine 5 ml HiTrap Q HP Säule (#17115401, GE Healthcare, USA) appliziert. Die Säule wurde mit 25 ml IEX-Puffer gewaschen und anschließend MnmC mit einem Liner-Gradienten von 100 mM bis 1 M KCl in IEX-Puffer eluiert. Fraktionen, die MnmC enthielten, wurden mit Amicon Ultra 30 kDa (#UFC903024, Merck Millipore, USA) konzentriert, gegen Stammpuffer dialysiert, mit flüssigem Stickstoff blitzgefroren und bei -80 °C gelagert.

Herstellung von iVTtRNA

Gene für jede iVTtRNA (Ergänzende Daten 1) wurden in den pGEMEX-1-Vektor (#P2211, Promega, USA) zwischen XbaI- und BamHI-Restriktionsstellen kloniert. Unter Verwendung der resultierenden Plasmide als Templates wurden DNA-Templates für die In-vitro-Transkription unter Verwendung eines T7-Promotorprimers als Forward-Primer und geeigneter Reverse-Primer für jede iVTtRNA PCR-amplifiziert (Ergänzende Daten 1). Jeder Reverse Primer enthielt eine 2′-Methoxy-Modifikation am zweiten Nukleotid vom 5′-Terminus, um die Templat-unabhängige Zugabe eines zusätzlichen Nukleotids zu verhindern28. Die Produkte wurden durch Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol (25: 24: 1) -Extraktion gereinigt, gefolgt von Ethanolfällung, und Fällmittel wurden in Wasser gelöst. Run-off transcription of precursor iVTtRNAs with 27 extra nucleotides introduced at the 5′-terminus (5′-GGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGA-3′) was performed using the resultant DNA templates for 3 h at 37°C in 20 mL reaction mixtures containing 30 nM T7 RNA polymerase, 1 mM each ATP, GTP, CTP, and UTP, 40 mM HEPES-KOH pH 7.6, 20 mM MgCl2, 1.5 mM spermidine, 5 mM DTT, 20 μg PCR products, and 0.2 U/mL inorganic pyrophosphatase (#10108987001, Roche, Switzerland). Anschließend wurden RNase-P-Komponenten aus C5-Protein und M1-RNA zur Entfernung der 27 zusätzlichen Nukleotide bei 150 nM zu Reaktionsgemischen gegeben und die Reaktionen für 1 h bei 37 °C inkubiert. Transkribierte iVTtRNAs wurden dann mit saurer Phenolextraktion, anschließender Chloroform/Isoamylalkohol (10: 1) -Extraktion und anschließender Reinigung durch Anionenaustauscherchromatographie verarbeitet. Proben, die iVTtRNAs enthielten, wurden auf 10 ml HiTrap Q HP Säulen (#17115401, GE Healthcare, USA) geladen und mit Q Puffer (20 mM HEPES-KOH pH 7,6 und 200 mM KCl) gewaschen. iVTtRNAs wurden mit einem linearen Gradienten von 200 mM bis 1 M KCl in Q-Puffer eluiert. Fraktionen, die Ziel-iVTtRNAs enthielten, bestimmt durch Harnstoff-PAGE, wurden durch Isopropanolfällung gewonnen, und ausgefällte iVTtRNAs wurden in Wasser gelöst und bis zur Verwendung bei -80 ° C gelagert. Wir stellen fest, dass wir alle Plasmide auf Anfrage teilen können.

Modifikation von iVTtRNA

t6A37 Modifikation wurde in der Reaktionsmischung enthaltend 50 mM Hepes-KOH, pH 7 durchgeführt.6, 300 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 50 mM NaHCO3, 1 μM CaCl2, 1 mM ATP, 1 mM Thr, 5 μM TsaC, 5 μM TsaB, 5 μM TsaD, 5 μM TsaE, 4 A260 unit/mL tRNAIleGAU or tRNAAsnGUU or tRNAPheGAA. m1G37 modification was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 36.4 μM S-adenosyl methionine (SAM), 1.5 μM TrmD, 10 A260 unit/mL tRNAProGGG or tRNAPheGAA. mnm5U34 was performed in the reaction mixture containing 50 mM Hepes-KOH, pH 7.6, 150 mM KCl, 12.5 mM MgCl2, 5 mM DTT, 500 μM FAD, 1 mM tetrahydrofolate, 4 mM GTP, 2.5 mM NADH, 0.2 mM Pyridoxal-5′-phosphat, 1 mM Ser, 1 mM Gly, 36,4 µM SAM, 0,1 Einheit / µL rekombinanter RNase-Inhibitor (# 2313 A, TaKaRa, Japan), 10 µM GlyA, 3 µM GidA, 3 µM MnmE, 2,5 µM MnmC, 6 A260 Einheit / ml tRNAGluUUC oder tRNAGluCUC. Nach Inkubation bei 37 ° C für 2 h für t6A37- und m1G37-Modifikation oder 4 h für mnm5U34-Modifikation wurden tRNAs mit saurer Phenolextraktion gefolgt von Chloroform / Isoamylalkohol (10: 1) -Extraktion verarbeitet und durch Isopropanolfällung gewonnen. Ausgefällte tRNAs wurden in Wasser gelöst und bei -80°C gelagert. Zur Modifikation von mnm5U34 wurde die Reaktion erneut mit wiedergewonnenen tRNAs durchgeführt. Sie wurden mit saurer Phenolextraktion und anschließender Chloroform/Isoamylalkohol (10: 1) -Extraktion verarbeitet, mit MicroSpin G-25-Säulen (# 27532501, GE Healthcare, USA) entsalzt und durch Isopropanolfällung gewonnen. Ausgefällte tRNAs wurden in Wasser gelöst und bei -80°C gelagert. Zur Quantifizierung der Modifikationseffizienz wurden 57,1 µM Thr anstelle von 1 mM Thr verwendet und die Mischung ohne TsaD als Kontrolle für die t6A37-Modifikation verwendet. 36.Es wurde 4 µM S-adenosyl-Methionin eingesetzt und die Mischung ohne TrmD als Kontrolle für die M1G-Modifikation und ohne GidA als Kontrolle für die mnm5U34-Modifikation verwendet. Nach Inkubation bei 37°C wurden Aliquots (10 µL) entnommen und auf Whatman 25 mm GF/C Filterscheiben (#1822-025, GE Healthcare, USA) getupft. Filterscheiben wurden zweimal mit 10% TCA, dann Ethanol gewaschen, gefolgt von Messung der Radioaktivität durch einen Flüssigszintillationszähler. Zur Quantifizierung der mnm5U-Modifikation wurden tRNAs wie oben gereinigt und stattdessen 0,02 A260-Einheit auf den Filterscheiben entdeckt.

Aminoacylierung

Aminoacylierungsversuche wurden gemäß einem früheren Bericht47 durchgeführt. Reaktionsgemische (10 µL) enthielten 100 mM HEPES-KOH pH 7,6, 15 mM MgCl2, 40 mM KCl, 1 mM DTT, 4 mM ATP, 1 Einheit/µL rekombinanten RNase-Inhibitor (#2313 A, TaKaRa, Japan), 50 nM oder 1,5 µM aaRS entsprechend jeder Aminosäure, 20 µM -Aminosäure oder 68 µM Asn für Asparagin-Aminoacylierung und 2 A260 Einheit/ml tRNA. Zur Messung der Methylierung wurde stattdessen eine Mischung aus 0,6 µM Met und 3,4 µM kaltem L-Methionin verwendet. Cys wurde durch Reduktion von -Cystin mit 50 mM DTT bei 37°C für 15 min erhalten. Zur Messung der Cysteinylierung betrug die DTT-Konzentration 5 mM. Bei Verwendung von nativen tRNA-Gemischen wurden stattdessen 40 A260 unit/ml tRNA-Gemische (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei 37°C wurden Aliquots (8 µL) entnommen und auf Whatman 25 mm GF/C Filterscheiben (#1822-025, GE Healthcare, USA) getupft. Filterscheiben wurden zweimal mit 10% TCA, dann mit Ethanol gewaschen, gefolgt von Messung der Radioaktivität durch einen Flüssigszintillationszähler.

Octapeptidsynthese mit dem PURE-System

Für Octapeptide kodierende DNA-Templates wurden mit geeigneten Primern PCR-amplifiziert (Ergänzende Daten 2) unter Verwendung des pURE1-Vektors (#PUREV001, BioComber, Japan), der eine T7-Promotorsequenz und die Ribosomenbindungsstelle (Shine-Dalgarno-Sequenz) als Template enthielt. Amplifizierte DNA-Templates wurden mit einem QIAquick PCR Purification Kit (#28104, QIAGEN, Deutschland) gereinigt. Octapeptidsynthesereaktionen enthielten 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM Kaliumglutamat, 13 mM Magnesiumacetat, 2 mM Spermidin, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM UTP, 1 mM CTP, 20 mM Kreatinphosphat, 10 µg / ml 10-Formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolsäure, 0,2 µM Ribosom, 4 nM DNA-Template, proteinhaltige REINE Systemkomponenten einschließlich Translationsfaktoren und Enzyme, Aminosäuren und tRNAs. Die Konzentrationen an proteinhaltigen REINEN Systemkomponenten waren wie in einem früheren Protokoll beschrieben46. Wir stellen fest, dass alle 20 aaRSs in diesem Experiment enthalten waren, unabhängig von DNA-Templates und Testcodons. Die Zusammensetzung und Konzentration der Aminosäuren, die von den Testcodons abhängen, sind in den ergänzenden Daten 2 aufgeführt. Die Zusammensetzung der iVTtRNAs hängt von der Vorlage ab, und die Reaktionen wurden unter Verwendung von basalen iVTtRNAs (ergänzende Daten 2) in Gegenwart oder Abwesenheit von Test-iVTtRNAs (ergänzende Daten 2) durchgeführt. Die Konzentration jeder iVTtRNA wurde auf 6 µM fixiert. Bei Verwendung von nativen tRNA-Mischungen wurden stattdessen 56 A260 unit/ml tRNA-Mischungen (#10109541001, Sigma-Aldrich, USA) zugegeben. Die Reaktionen wurden für 60 min bei 37 °C durchgeführt und Aliquots wurden entnommen, auf Whatman 3 MM Filterpapiere (#1822-025, GE Healthcare, USA) getupft, in 10% TCA bei 90 °C für 30 min gekocht, um Aminoacyl-RNAs zu deacylieren. Die Radioaktivität in der 10%igen TCA-unlöslichen Fraktion wurde mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen.

Proteinsynthese mit dem PURE System

Proteinsyntheseexperimente wurden mit einem PUREfrex 2.0 Kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japan) ohne tRNA-Mischungen in Lösung I (Puffermischung) durchgeführt. Wir haben zusätzlich 0 hinzugefügt.2 µM Met, 4 nM PCR-amplifizierte DNA-Template für DHFR- oder sfGFP-Expression (Ergänzende Daten 3) und eine spezifizierte Menge iVTtRNA-Gemisch oder natives tRNA-Gemisch. Reaktionen wurden bei 30 oder 37 ° C für 12 h durchgeführt und synthetisierte Proteine wurden analysiert.

Analyse synthetisierter Proteine

Synthetisiertes DHFR und sfGFP mit radioaktivem Met wurden mit 15% SDS-PAGE analysiert und das Gelbild mit einem BAS-5000 Bio-Imaging Analyzer (GE Healthcare, USA) visualisiert. Die Zeitverlaufsanalyse der sfGFP-Expression wurde durch Messung der sfGFP-Fluoreszenz alle 3 min unter Verwendung eines StepOne qRT-PCR-Systems (# 4376373, Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Fluoreszenzbilder von synthetisiertem sfGFP in Reaktionsgemischen wurden mit einem LAS-4000-Instrument (GE Healthcare, USA) erhalten. Die Aktivität von synthetisiertem DHFR wurde wie zuvor beschrieben gemessen44. Reaktionsgemische (2 ml) enthielten 50 mM MES-KOH pH 7,0, 25 mM TRIS-HCl pH 7,0, 25 mM Ethanolamin, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 0.1 mM EDTA, 100 µM Dihydrofolsäure und ein 10 µL Aliquot der REINEN Reaktionsmischung zugegeben und 15 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 20 mM NADPH bis zu einer Endkonzentration von 200 µM zugegeben und die Abnahme der Extinktion bei 340 nm über einen Zeitraum von 10 min mit einem V-550 Spektralphotometer (Jasco, Japan) gemessen. Eine Einheit DHFR wurde definiert als die Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 µmol Dihydrofolsäure in 1 min bei 37°C zu verarbeiten.

LC-MS-Analyse synthetisierter Proteine

DHFR mit FLAG-Sequenz am Terminus (Ergänzende Daten 3) wurde mit einem PUREfrex 2 synthetisiert.0 kit (#PF201, GeneFrontier Corporation, Japan) ohne tRNA-Mischungen in Lösung I (Puffermischung). Wir haben zusätzlich 4 nM PCR-amplifizierte DNA-Template für DHFR mit FLAG-Sequenz an seinem C-Terminus markiert (Ergänzende Daten 3) und eine bestimmte Menge an iVTtRNA-Mischung oder native tRNA-Mischung. Die Reaktionen wurden 12 h bei 30 ° C durchgeführt. Synthetisiertes DHFR wurde mit Anti-FLAG-M2-Magnetperlen (# M8823, Sigma-Aldrich, USA) gereinigt. Aliquots (55 µL) der Reaktionsgemische wurden mit 245 µL des FLAG-Waschpuffers (50 mM Hepes-KOH, pH 7) versetzt.6, 150 mM NaCl, 20 mM Mg(OAc)2) versetzt und 1 h weiter mit 30 µL Beads gemischt. Die Beads wurden mit 210 µL des FLAG-Waschpuffers gewaschen, gefolgt von zweimaligem Waschen mit dem Puffer ohne Mg(OAc)2 (210 µL und 180 µL). Anschließend wurde DHFR mit 50 µL des FLAG-Waschpuffers ohne Mg(OAc)2, jedoch ergänzt mit 100 µg/ml 3xFLAG-Peptid (#F4799, Sigma-aldrich, USA) nach leichtem Mischen für 1 h eluiert. Die Probenvorbereitung für die LC-MS-Analyse erfolgte nach einem Phase Transfer Surfactant (PTS)-gestützten protokoll48. Die 4 µL eines dichten PTS-Puffers (100 mM Natriumdesoxycholat, 100 mM Natrium-N-Lauroylsarcosinat und 500 mM NH4HCO3) wurden zu 40 µl der eluierten Proben gegeben. Sie wurden mit 10 mM TCEP bei 37°C für 30 min reduziert, mit 20 mM Jodacetamid bei 37°C für 30 min alkyliert und mit 20 mM Cys gequencht. Jede Reaktionslösung wurde in zwei Portionen aufgeteilt. Einer wurde mit 10 ng/µl Lys-C (#90051, Thermo Fisher Scientific, USA) und 10 ng/µl Trypsin (#90057, Thermo Fisher Scientific, USA) bei 37°C über Nacht verdaut. Der andere wurde mit 10 ng/µl Asp-N (#90053, Thermo Fisher Scientific, USA) bei 37°C über Nacht verdaut. Nach dem Aufschluss wurde 10% Trifluoressigsäure (TFA) bis zu einer Endkonzentration von 1% zugegeben und die Reaktionslösungen 5 min bei 15.000 ×g zentrifugiert, um die Detergenzien auszufällen. Überstände wurden mit selbst hergestellter Stufe tips49 entsalzt und mit SpeedVac getrocknet. Die LC-MS-Analyse wurde unter Verwendung eines Orbitrap-Massenspektrometers (LTQ Orbitrap Velos Pro, Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt, das mit einer Nanospray-Ionenquelle (Nanospray Flex, Thermo Fisher Scientific, USA) und einem Nano-LC-System (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific, USA) ausgestattet war. Die getrockneten Peptidmischungen wurden in einer Lösung gelöst, die 5% Acetonitril und 0,1% TFA enthielt, und jede Probe wurde auf das Nano-LC-System aufgebracht. Peptide wurden mit einer Fallensäule (#164535, 0.075 × 20 mm, 3 µm, Acclaim PepMap 100 C18, Thermo Fisher Scientific, USA) und anschließend mittels einer Nanokapillarsäule (#NTCC) getrennt-360/100-3-153, 0.1 × 150 mm, 3 µm, C18, Nikkyo Technos, Japan) unter Verwendung zweier Laufmittel A (0,1% Ameisensäure) und B (Acetonitril und 0,1% Ameisensäure) mit einem Gradienten (5% B für 5 min, 5-45% B in 45 min, 45-90% B in 1 min und 90% B in 4 min) bei einer Flussrate von 500 nL/min. Die Elution wurde direkt elektrosprayed (2,2 kV) in die MS (positiver Modus, Scanbereich von 200-1500 m/z, 60.000 FWHM Auflösung)50.