Zusammenfassung
Die HIV-1-Transkription wird durch CDK9 / Cyclin T1 reguliert, das im Gegensatz zu einer typischen zellzyklusabhängigen Kinase durch Assoziation mit dem 7SK Small Nuclear Ribonuclear Protein Complex (snRNP) reguliert wird. Während die Proteinkomponenten dieses Komplexes gut untersucht sind, ist der Mechanismus der Komplexbildung noch nicht vollständig verstanden. Die Assoziation von CDK9/Cyclin T1 mit 7SK snRNP wird teilweise durch eine reversible CDK9-Phosphorylierung reguliert. Hier präsentieren wir einen umfassenden Überblick über die Kinasen und Phosphatasen, die an der CDK9-Phosphorylierung beteiligt sind, und diskutieren ihre Rolle bei der Regulation der HIV-1-Replikation und das Potenzial, für die Arzneimittelentwicklung ins Visier genommen zu werden. Wir schlagen einen neuartigen Weg der HIV-1-Transkriptionsregulation über CDK9 Ser-90-Phosphorylierung durch CDK2 und CDK9 Ser-175-Dephosphorylierung durch Proteinphosphatase-1 vor.
1. Einleitung
Die vollständige Ausrottung der HIV-1-Infektion erfordert neuartige Ansätze zur Induzierung eines integrierten HIV-1-Provirus, das von den vorhandenen antiretroviralen Arzneimitteln nicht betroffen ist und nach Beendigung der antiretroviralen Therapie wiederhergestellt wird . Die HIV-1-Latenz kann auf mehrere Faktoren zurückzuführen sein, z. B. einen Mangel an HIV-1-Transkriptionsaktivatorprotein (Tat) oder zellulären Transkriptionsaktivatoren, transkriptionelle Interferenz mit zellulären Promotoren, ungünstige Integrationsstelle, Epigenetik und wahrscheinlich andere Faktoren . Daher ist ein besseres Verständnis der Mechanismen der HIV-1-Transkriptionsaktivierung wichtig für das Design neuartiger Therapeutika, die sowohl auf die Induktion als auch auf die Hemmung der HIV-1-Transkription abzielen. Hier untersuchen wir die Kinasen und Phosphatasen, die an der Aktivierung von CDK9 / Cyclin T1 beteiligt sind, und diskutieren, wie diese Enzyme potenziell zur Hemmung oder Aktivierung von HIV-1 für die Entwicklung zukünftiger therapeutischer Interventionen zur Behandlung von HIV-1-Infektionen eingesetzt werden können.
2. Aktivierung der HIV-1-Transkription durch P-TEFb
Die HIV-1-Transkription wird durch das HIV-1-Tat-Protein aktiviert, das an die Ausbuchtung der TAR-RNA bindet, eine Haarnadelschleifenstruktur, die sich am 5′-Ende aller entstehenden HIV-1-Transkripte befindet, und rekrutiert CDK9 / Cyclin T1, eine Komponente des positiven Transkriptionsverlängerungsfaktors b (P-TEFb), an den HIV-1-Promotor (siehe auch Abbildung in Abbildung 1). Während der Transkriptionsinitiation phosphoryliert TFIIH-assoziiertes CDK7 / Cyclin H Ser-5 innerhalb einer 1YSPTSPS7-Heptapeptidsequenz, die 52-mal in der C-terminalen Domäne (CTD) von RNAPII wiederholt wird . Das Ser-5 phosphorylierte RNAPII akkumuliert an 20-40 Nukleotiden (nt) stromabwärts der Transkriptionsstartstelle, teilweise aufgrund der Wirkungen des negativ wirkenden Elongationsfaktorkomplexes NELF und des DRB-sensitivitätsinduzierenden Komplexes DSIF . Kürzlich wurde gezeigt, dass TFIIH-assoziiertes CDK7 auch CTD-Ser-7-Reste phosphoryliert , was die Ser-2-Phosphorylierung durch P-TEFb auslösen kann . Die Rekrutierung von P-TEFb an den HIV-1-Promotor, der sich in der U3-R-U5-Region des 5′-LTR befindet, wird durch Tat erleichtert, das auf CDK9 / Cyclin T1 auf TAR-RNA abzielt, wobei Cyclin T1 an die G-reiche Schleife von TAR-RNA bindet. Die Rekrutierung von CDK9 / Cyclin T1 fördert die Transkriptionsverlängerung durch die RNA-Polymerase II (RNAPII), die ansonsten nach der Synthese der TAR-RNA angehalten wird . Die Freisetzung von RNAPII aus der Pause durch den P-TEFb-Komplex wird von mRNA-Capping und Verlust von NELF begleitet . P-TEFb löst die Elongation der RNA-Polymerase II (RNAPII) -Transkription durch Phosphorylierung des negativen Elongationsfaktors (NELF) und des DRB-sensitivitätsinduzierenden Komplexes (DSIF / Spt4 / Spt5) aus und fördert so die Freisetzung von NELF und phosphoryliert auch Ser-2-Reste in RNAPII CTD (überprüft in ). Bei der Dissoziation von NELF wird DSIF zu einem positiven Dehnungsfaktor und erhöht die Prozessivität RNAPII . Obwohl P-TEFb mit dem Dehnungskomplex reist, ist seine CTD-Kinaseaktivität nicht mehr erforderlich, sobald der Komplex aus der Pause freigesetzt wird .
Schematische Darstellung der HIV-1 Transkriptionsregulation durch CDK9 Phosphorylierung und Dephosphorylierung. Die Abbildung zeigt ein Netzwerk von Tat-interagierenden Wirtszellenfaktoren, die die CDK9-Phosphorylierung beeinflussen. Pfeile zeigen Phosphorylierung (violett), Dephosphorylierung (orange) und Übergang von komplexen P-TEF- und Transkriptionskomplexen (schwarz) an. CDK2 phosphoryliert CDK9 Ser-90. Eisenchelatoren reduzieren die zelluläre Aktivität von CDK2 / Cyclin E und hemmen die HIV-1-Transkription (angezeigt durch rote Linie). CDK7 phosphoryliert CDK9 Thr-186. Die Dephosphorylierung von Thr-186 durch PPM1A oder PP1 erleichtert die Dissoziation von CDK9 / Cyclin T1 aus dem großen P-TEFb-Komplex und die Rekrutierung von CDK9 / Cyclin T1 durch Tat oder BRD4. BRD4 bindet bevorzugt Ser-175-phosphoryliertes CDK9. Die Dephosphorylierung von Ser-175 durch PP1 aktiviert die CDK9-Kinaseaktivität und aktiviert die HIV-1-Transkription. Die Rekrutierung von CDK9 / Cyclin T1 durch Tat zu TAR-RNA führt zur Phosphorylierung von NELF, das dissoziiert, sowie zur Phosphorylierung von DSIF- und RNAPII-CTD-Ser-2-Resten, was durch die CTD-Ser-7-Phosphorylierung erleichtert wird. CDK7 als Teil von TFIIH phosphoryliert CTD Ser-5 und möglicherweise Ser-7-Reste. CDK7 phosphoryliert auch CDK9 Thr-186 und unterhält CDK9 Thr-186 Phosphorylierung während der Verlängerung der Transkription.
Aufgrund der Bedeutung von P-TEFb muss die Regulierung beibehalten werden, um eine ordnungsgemäße Funktion zu gewährleisten. Die Phosphorylierung und Dephosphorylierung spezifischer Stellen auf CDK9 muss während des gesamten Transkriptionsprozesses erfolgen und muss streng kontrolliert werden. Diese Übersicht konzentriert sich auf die Regulation von CDK9 durch Phosphorylierungsmodifikationen.
3. Zusammensetzung von P-TEFb und seine Rolle bei der Aktivierung der HIV-1-Transkription
P-TEFb ist ein Heterodimer, das aus der Cyclin-abhängigen Kinase 9 (CDK9) und einem der C-Typ-Cycline T1, T2a oder T2b besteht, von denen Cyclin T1 der am häufigsten vorkommende Partner ist . Cyclin K, das ursprünglich als untergeordnetes Cyclin von CDK9 angesehen wurde, ist jetzt als Cyclinpartner für CDK12 und CDK13 anerkannt . Nur das Cyclin-T1-Protein bildet effizient einen Komplex mit HIV-1-Tat, das an TAR-RNA gebunden ist . Dies ist auf das Vorhandensein eines Cysteinrestes in Cyclin T1 an Position 261 und nicht auf ein Asparagin zurückzuführen, das in Cyclin T2a- und T2b-Proteinen gefunden wird. Cyclin T1 mit mutiertem Cys-261 bindet an Tat, kann Tat jedoch nicht an TAR-RNA rekrutieren. Die Wechselwirkung von Tat mit TAR-RNA und Cyclin T1 ist abhängig von Zinkionen, was wiederum die Anwesenheit von Cys-261 erfordert.Es gibt zwei funktionelle Isoformen von CDK9: eine 42-kDa-Form, die vorwiegend in Milz, Thymus und Hoden exprimiert wird, und eine 55-kDa-Form, die in verschiedenen Geweben exprimiert wird, jedoch auf signifikant niedrigeren Ebenen, nämlich der 42-Kd-Isoform . Alle Cycline assoziieren mit beiden Isoformen von CDK9 und zeigen Kinaseaktivität gegenüber CTD in RNAPII . Etwa die Hälfte von P-TEFb befindet sich in einem inaktiven großen Komplex, der durch 7SK snRNA und mehrere zusätzliche Proteine gebunden ist, einschließlich Hexamethylenbisacetamid-induzierbares Protein 1 (HEXIM1) , La-verwandtes LARP7-Protein und Methylphosphatase-Capping-Enzym MePCE . Die niedermolekulare Form von P-TEFb besteht aus CDK9 und Cyclin T1 und ist enzymatisch aktiv. Das hochmolekulare P-TEFb ist wegen des HEXIM1 inaktiv, das seine inhibitorische PYNT-Sequenz in das aktive Zentrum von CDK9 einführt.
Der hochmolekulare P-TEFb-Komplex dient als Quelle von CDK9/Cyclin T1 für die Rekrutierung durch HIV-1 Tat. In stressinduzierten Zellen dissoziiert der CDK9 / Cyclin T1-Komplex vom 7-RNA / HEXIM1-Protein und bindet dann BRD4 und bildet einen transkriptionell aktiven kleinen Komplex, der an verschiedene zelluläre Promotoren rekrutiert wird . Trotz der Inaktivität des großen P-TEFb-Komplexes in vitro ist der große Komplex und nicht der kleine Komplex für die Aktivierung der HIV-1-Transkription als HIV-1 wichtig. Tat konkurriert mit HEXIM1 um die Bindung an Cyclin T1, was die Dissoziation von P-TEFb aus dem großen Komplex fördert. Es wurde auch gezeigt, dass HIV-1 Tat-Protein einen großen P-TEFb-Komplex für den HIV-1-Promotor rekrutiert, wobei TAR-RNA in der Lage war, 7 SK-RNA zu verdrängen und P-TEFb zu aktivieren.
Tat erleichtert auch die Bildung von Super Elongation Complex (SEC), der aktives P-TEFb und zusätzliche Elongationsfaktoren und Transkriptions-Coaktivatoren enthält . Zu diesen Faktoren gehören AFF4, ENL, AF9 und der Dehnungsfaktor ELL2 . Das AFF4-Protein entsteht als zentrales Gerüst, das andere Faktoren durch direkte Wechselwirkungen rekrutiert. AFF4 bindet Cyclin T1, ELL2 und ENL oder AF9 als Brücke, die diesen Komplex mit P-TEFb verbindet . Durch die Brückenfunktionen von Tat und AFF4 verbinden sich P-TEFb und ELL2 zu einem bifunktionellen Dehnungskomplex, der die HIV-1-Transkription stark aktiviert . Ohne Tat kann AFF4 die ELL2-P-TEFb-Interaktion vermitteln, wenn auch ineffizient. Tat überwindet diese Einschränkung, indem es mehr ELL2 zu P-TEFb bringt und ELL2 in einem Prozess stabilisiert, der aktives P-TEFb erfordert .
4. CDK9-Phosphorylierung
Die Aktivität von P-TEFb hängt von der Phosphorylierung mehrerer Serin- und Threoninreste ab, und wir werden dies unten diskutieren und die im CDK9 / Cyclin T1 / Tat-Modell in Abbildung 2 gezeigt sind.
Struktur des CDK9/Cyclin T1/Tat-Komplexes (Modell basierend auf PDB 3MIA). Die Darstellung von CDK9-Resten, die in der ursprünglichen PDB-Struktur vorhanden sind, ist in grüner Farbe, Cyclin T1—in Violett und Tat—in Rot dargestellt. Die Position des Thr-29-, Ser-175-, Thr-186- und C-terminalen Ser / Thr-Clusters wird angezeigt. Ebenfalls gezeigt sind ATP-Bindungsstelle und Zn-Ionen, die die Tat-Cyclin-T1-Interaktion erleichtern.
4.1. C-terminale CDK9-Phosphorylierung
Ein Cluster der C-terminalen Reste von CDK9 (Ser-347, Ser-353 und Ser-357; Thr-350 und Thr-354) ist autophosphoryliert und diese Phosphorylierung ist wichtig für die Bindung von CDK9 / Cyclin T1 an TAR-RNA . Dies wurde durch die Unfähigkeit von enzymatisch aktivem C-terminal verkürztem CDK9 belegt, an RNA zu binden . Rekombinantes CDK9 / Cyclin T1, das in vitro autophosphoryliert wurde, wurde effizient durch Proteinphosphatase 2A (PP2A) dephoshoryliert, nicht jedoch durch Proteinphosphatase-1 (PP1) . Auch die Behandlung mit PP2A verhinderte in vitro die Bindung von CDK9 / Cyclin T1 an Tat- und TAR-RNA . Diese Beobachtungen deuteten darauf hin, dass PP2A auf den C-Terminus von CDK9 abzielen und möglicherweise die Wechselwirkung von P-TEFb mit TAR-RNA kontrollieren kann. Die Autophosphorylierung von CDK9 im Zusammenhang mit dem Präinitiationskomplex in vitro wurde durch TFIIH inhibiert. PP2A erwies sich später in vitro als essentiell für die basale HIV-1-Transkription, da die PP2A-Depletion die basale HIV-1-Transkription hemmte und die Rückführung von PP2A zu den abgereicherten Extrakten die Transkription wiederherstellte . Es wurde angenommen, dass das PP2A-Ziel Thr-29 ist (siehe unten), aber dies wurde nicht mit Sicherheit bewiesen und der Effekt wurde in vivo nicht reproduziert. In einer frühen Studie beobachteten wir eine milde Induktion der basalen, aber nicht Tat-induzierten HIV-1-Transkription durch PP2A-inhibitorische niedrige Konzentrationen von Okadasäure . Wir beobachteten auch die Induktion der basalen und nicht der Tat-aktivierten HIV-1-Transkription mit der Überexpression des LIS1-Proteins, das PP2A in vitro bindet und hemmt und mit dem HIV-1-Tat-Protein interagiert . Zusammenfassend weisen diese Studien darauf hin, dass PP2A die basale HIV-1-Transkription regulieren und auch die Interaktion von P-TEFb mit TAR-RNA durch Dephosphorylierung des C-Terminus von CDK9 steuern kann.
4.2. N-terminale Thr-29-Phosphorylierung
Es wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung von CDK9S Thr-29 durch das HTLV-1-Steuerprotein induziert wird . CDK9 / Cyclin T1 wird durch BRD4 an chromatinisierte HIV-1 LTR und andere Promotoren rekrutiert. Diese BRD4-Rekrutierung war mit der Phosphorylierung von CDK9 Thr-29 und der Notwendigkeit einer PP2A-Dephosphorylierung durch John Bradys Gruppe verbunden. Qiang Zhous Gruppe berichtete jedoch, dass CDK9 auf Ser-175 phosphoryliert werden muss, um an BRD4 zu binden , was kürzlich von Jonathan Karns Gruppe bestätigt wurde (siehe detaillierte Diskussion unten). CDK9S Thr-29 ist homolog zu Thr-15 auf CDK2, bei dem die Phosphorylierung die CDK2-Aktivität hemmt. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung von Thr-29 die CDK9-Aktivität und die HIV-1-Transkription hemmt . Es gelang uns jedoch nicht, die CDK9-Thr-29-Phosphorylierung in Zellen nachzuweisen, die mit Okadasäure behandelt wurden, die sowohl PP2A als auch PP1 inhibierte, wobei eine Kombination aus Hunter 2D-Dünnschichtelektrophorese und hochauflösender Massenspektrometrie verwendet wurde, die nur die Phosphorylierung des C-terminalen Ser / Thr-Clusters zeigte und Ser-175, von dem nur die Ser-175-Phosphorylierung durch Okadasäure induziert wurde. Daher kann die CDK9-Thr-29-Phosphorylierung nicht durch PP2A kontrolliert werden und muss weiter validiert werden, um ihre Rolle bei der HIV-1-Transkription zu klären.
4.3. CDK9S T-Loop Thr-186 Phosphorylierung
CDK9 T loop enthält mehrere Phosphorylierungsstellen, einschließlich Ser-175 und Thr-186 (Abbildung 2). Die Phosphorylierung des konservierten Thr-186 ist für die enzymatische Aktivität von CDK9 notwendig. Auch die Assoziation von CDK9 / Cyclin T1 mit 7SK RNA snRNP erfordert CDK9S Thr-186 Phosphorylierung . In CDKs löst die Phosphorylierung der T-Schleife große Konformationsänderungen aus, die die ATP-Bindungstasche und eine Substratbindungsstelle öffnen, wodurch CDKs als Kinase voll aktiv werden .Kürzlich hat eine chemisch-genetische Analyse unter Verwendung einer selektiven chemischen Hemmung von CDK7 gezeigt, dass es allein für die CDK9-Thr-186-Phosphorylierung und für die P-TEFb-abhängige CTD-Ser-2-Phosphorylierung und die Histon-H2B-Ubiquitylierung in vivo verantwortlich ist . Somit fungiert CDK7 / Cyclin H, das zuvor als CDK-aktivierende Kinase (CAK) für die am Zellzyklus beteiligten CDKs wie CDK1, 2 und 4 identifiziert wurde, auch als CAK für CDKs, die an der Regulation der Transkription beteiligt sind, einschließlich CDK8, 9, 12 und 13 (überprüft in ). Globale Analyse von Kinasen, die CDK9-T-Schleife phosphorylieren können siRNA identifizierte Ca (2 +) / Calmodulin-abhängige Kinase 1D (CaMK1D) Knock down durch siRNA verringerte Thr-186-Phosphorylierung . Dementsprechend verringerte die niedermolekulare Hemmung des Ca (2 +) -Signalwegs die Thr-186-Phosphorylierung und hemmte die Tat-induzierte HIV-1-Transkription, nicht jedoch die Tax-vermittelte HTLV-1-Transkription . Da die Tax-vermittelte Transkription durch P-TEFb gesteuert wird, bleibt weiter zu untersuchen, warum nur die HIV-1-Transkription betroffen war.
CDK9 Thr-186 Phosphorylierung kann auch durch zelluläre Phosphatasen gesteuert werden. Unsere Studien in den letzten zehn Jahren konzentrierten sich auf PP1, von dem wir zunächst beobachteten, dass es die Tat-abhängige HIV-1-Transkription in vitro stimuliert . Als wir eine der wichtigsten nuklearen regulatorischen Untereinheiten von PP1, NIPP1 (nuklearer Inhibitor von PP1), überexprimierten, beobachteten wir eine PP1-spezifische Hemmung der HIV-1-Transkription und der Virusreplikation . Wir stellten fest, dass Tat eine Sequenz enthält, die einem konservierten PP1-bindenden RVxF-Motiv ähnelt, und zeigten, dass dieses Motiv die Tat-Bindung an PP1 in vitro und in vivo vermittelt und dass die Mutation von Resten im PP1-Bindungsmotiv (V36A und F38A) die Tat daran hinderte, die HIV-1-Transkription zu induzieren . CDK9, das in kultivierten Zellen phosphoryliert wurde, die mit (32P) Orthophosphat versetzt und mit Okadainsäure behandelt wurden, wurde in vitro durch PP1, aber nicht durch PP2A im Gegensatz zu dem in vitro autophosphorylierten CDK9, das durch PP2A und nicht durch PP1 dephosphoryliert wurde, effizient dephophosphoryliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PP1 die CDK9-Phosphorylierung während der HIV-1-Transkription kontrollieren kann. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die Alpha-katalytische Untereinheit von PP1, PP1a, kooperativ und sequentiell mit (Ca2 +) -Calmodulin-Protein-Phosphatase 2B (PP2B) in UV-bestrahlten oder Hexamethylenbisacetamid (HMBA) -behandelten Zellen wirkt, in denen P-TEFb aus dem 7SK snRNP-Komplex freigesetzt wird . Während PP2B eine Konformationsänderung in 7SK snRNP induziert, dephosphoryliert PP1a CDK9 Thr-186 und erleichtert die Freisetzung von P-TEFb aus 7SK snRNP . CDK9 blieb dephosphoryliert, während es mit BRD4 assoziiert war und in den Präinitiationskomplex rekrutiert wurde, wo es durch TFIIH-assoziiertes CDK7 reaktiviert werden kann. In Übereinstimmung mit dieser Studie beobachteten wir eine erhöhte CDK9-Thr-186-Phosphorylierung in den Zellen, die stabil ein PP1-inhibitorisches Peptid, die zentrale Domäne von NIPP1, exprimierten, und beobachteten auch eine erhöhte Assoziation von CDK9 / Cyclin T1 mit 7SK-RNA . Die stabile Expression von cdNIPP1 unterbrach die Wechselwirkung zwischen Tat und PP1 und hemmte die HIV-1-Transkription , was darauf hindeutet, dass ein Gleichgewicht zwischen Phosphorylierung und Dephosphorylierung von CDK9 Thr-186 aufrechterhalten werden muss und dass die Verlagerung dieses Gleichgewichts in Richtung Phosphorylierung die HIV-1-Transkription hemmt. Die Expression von cdNIPP1 in physiologisch relevanter Weise als Teil des HIV-1-Genoms anstelle von nef hemmte die HIV-1-Replikation stark, was darauf hindeutet, dass PP1-gezielte Inhibitoren als potenzielle Anti-HIV-1-Therapeutika von Nutzen sein können. Während PP1 ein Kandidat für die Thr-186-Dephosphorylierung ist, fanden wir auch, dass es CDK9 Ser-175 dephosphoryliert (siehe unten). Eine zusätzliche CDK9 Thr-186 Phosphatase, Magnesium-abhängiges Protein Phosphatase 1A (früher 2C) (PPM1A) wurde unter Verwendung einer Phosphatase-Expressionsbibliothek und Thr-186-phosphospezifischen Antikörpern identifiziert. Die PPM1A-Überexpression verringerte die Thr-186-Phosphorylierung und die siRNA-vermittelte Depletion erhöhte sie, und P-TEFb und PPM1A fielen ebenfalls zusammen, was darauf hindeutet, dass CDK9 ein physiologisches Substrat für PPM1A sein kann . Eine neuere Studie zeigte, dass die Thr-186-Phosphorylierung von CDK9 in ruhenden CD4 (+) T-Zellen, die für die HIV-1-Replikation nicht permissiv sind, verringert ist und dass diese Abnahme mit der Häufigkeit von PPM1A und der begrenzten Rekrutierung von CDK9 für den großen P-TEFb-Komplex korreliert . Dieser Befund unterstützt weiter die Notwendigkeit des großen Komplexes für die HIV-1-Transkription und die kritische Rolle von PPM1A bei der HIV-1-Unterdrückung in ruhenden T-Zellen. Da die PPM1A-Expression bei Aktivierung der T-Zellen nicht verändert wurde , können noch unbekannte regulatorische Faktoren an der Regulation der PPM1A-Aktivität beteiligt sein.
4.4. CDK9S T-Loop-Ser-175-Phosphorylierung
Sobald CDK9 / Cyclin T1 vom großen P-TEFb-Komplex dissoziiert, kann CDK9 auf Ser-175 phosphoryliert werden. Während die Thr-186-Dephosphorylierung die CDK9 / Cyclin-T1-Kinaseaktivität vollständig hemmte, wurde von David Price und Kollegen kein Unterschied in den Kinaseaktivitäten von CDK9 S175A- und CDK9 S175D-Mutanten festgestellt . Im Gegensatz dazu zeigten Qiang Zhou und seine Gruppe, dass die CDK9 S175A-Mutante inaktiv war, während die CDK9 S175D-Mutante als Kinase aktiv war . Sie zeigten auch, dass die Ser-175-Phosphorylierung die Bindung von CDK9 / Cyclin T1 an Brd4 fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die Phosphorylierung von Ser-175 eine Konformationsänderung in CDK9 verursachen kann, wodurch BRD4 an Cyclin T1 binden kann . In unserer aktuellen Studie fanden wir heraus, dass die dynamische Hemmung von PP1 zu einer exklusiven Phosphorylierung von CDK9 Ser-175 führte, wie durch eine Kombination von Hunter 2D-Peptid-Mapping und LC-MS-Analyse in vivo bestimmt . Die Hemmung von PP1 führte zur Hemmung der CDK9-Aktivität und zur Verringerung der RNAPII-Phosphorylierung in vitro und in vivo . Wir fanden heraus, dass die CDK9-S175A-Mutante enzymatisch aktiv war und die HIV-1-Transkription induzierte . Interessanterweise war die CDK9-S175D-Mutante als Kinase weniger aktiv, bildete jedoch leichter einen kleinen P-TEFb-Komplex, insbesondere wenn PP1 gehemmt wurde. So schlossen wir, dass PP1 HIV-1 Transkription durch Dephosphorylierung CDK9 Ser-175 Rest aktiviert. Wir stellten auch fest, dass die Phosphorylierungsaktivität von Ser-175 in Zellextrakten viel häufiger vorkam als die Thr-186-Aktivität, was darauf hindeutet, dass die CDK9-Aktivität durch die Überphosphorylierung von Ser-175 auf natürliche Weise unterdrückt werden kann. Eine aktuelle Studie von Jonathan Karns Gruppe zeigte, dass die Aktivierung von T-Zellen durch T-Zell-Rezeptor (TCR) oder Phorbolester (PMA) Signalisierung stark induzierte Phosphorylierung des CDK9 Ser-175 . Basierend auf der molekularen Modellierung schlugen sie vor, dass phosphoryliertes Ser-175 eine Wasserstoffbindung mit Tat Lys-14 bildet, die die Bindung von Tat an CDK9 / Cyclin T1 verstärkt und die HIV-1-Transkriptionsaktivierung fördert . Auch in Übereinstimmung mit den frühen Beobachtungen wurde CDK9 S175A Mutation gefunden, um die Bindung an BRD4 aufzuheben . In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen wurde auch festgestellt, dass die CDK9 S175A-Mutante eine Tat-abhängige latente HIV-1-Reaktivierung stark induziert, was Jonathan Karn und seine Mitarbeiter der Unfähigkeit dieser Mutante zuschrieben, BRD4 zu binden, während sie in der Lage war, an Tat zu binden . Sie fanden auch heraus, dass CDK9 phosphoryliert bei Ser-175 ist ausgeschlossen von der 7SK RNP-Komplex , die Parallelen unserer früheren Beobachtung, dass CDK9 S175D phosphomimetische Mutante gefunden wurde, in kleinen P-TEFb-Komplex . Daher weist diese neueste Studie auf Ser-175 als wichtiges Ziel für die HIV-1-Reaktivierung und die potenzielle Entwicklung von niedermolekularen Therapeutika hin.
Wir haben kürzlich PP1-gezielte kleine Moleküle entwickelt, die so modelliert wurden, dass sie in den RVxF-aufnehmenden Hohlraum auf PP1 passen. Wir untersuchten praktisch etwa 300.000 Verbindungen und dann physikalisch etwa 1000 Verbindungen und identifizierten eine Hit-Verbindung, 1H4, die die HIV-1-Transkription und -replikation bei nicht zytotoxischen Konzentrationen hemmte . 1H4 verhinderte die PP1-vermittelte Dephosphorylierung eines Substratpeptids, das eine RVxF-Sequenz in vitro enthielt, störte die Assoziation von PP1 mit Tat in kultivierten Zellen und verhinderte die Translokation von PP1 in den Zellkern . Wir sind derzeit dabei, die Hit-Verbindung zu verfeinern und auch PP1-gezielte Verbindungen zur Aktivierung von latentem Provirus zu entwickeln.
4.5. CDK9S Ser-90-Phosphorylierung
Wir und andere haben früher gezeigt, dass die HIV-1-Transkription durch Tat in der G1-Phase aktiviert wird, nicht jedoch in der G2-Phase . Daher stellten wir die Hypothese auf, dass Tat eine regulatorische Kinase des Zellzyklus aktivieren könnte, von der wir zeigten, dass sie CDK2 / Cyclin E ist . HIV-1 wird in den CDK2-Knockdown-Zellen und auch in der Differenzierung von Makrophagen von induzierten pluripotenten Stammzellen mit CDK2-Knockdown gehemmt , was darauf hindeutet, dass CDK2 für die Transkription und Replikation von HIV-1 wichtig ist. Die funktionelle Verbindung zwischen CDK2 und CDK9 wurde gefunden, als wir die Hemmung von HIV-1 durch Eisenchelatoren analysierten. Die HIV-1-Transkription wurde in T-Zellen gehemmt, die mit den Eisenchelatoren 311 und ICL670 behandelt wurden, die auch die zelluläre Aktivität von CDK2 und CDK9 hemmten . Stärkere Di-2-Pyridylketon-Thiosemicarbazon-basierte Tridentat-Eisenchelatoren hemmten die HIV-1-Transkription und Virusreplikation bei viel niedrigeren Konzentrationen als 311 oder ILC670 und hemmten auch die CDK2- und CDK9-Aktivität . Während der Mechanismus der CDK2-Hemmung noch nicht geklärt ist, ist es wahrscheinlich, Induktion von p21 durch die Hochregulierung von Hypoxie-induzierten Faktor 1 (HIF-1) als Eisenmangel entfernt Eisen aus Prolylhydroxylase und erhöht HIF-1 und HIF-2 Proteinspiegel imitiert die Wirkung von Hypoxie . Wir analysierten die CDK9-Phosphorylierung durch CDK2 in vitro und identifizierten ein Motiv (90SPYNR94), das eine Konsensus-CDK2-Phosphorylierungsstelle darstellte und effizient phosphoryliert war . Die Phosphorylierung von CDK9 auf Ser-90 wurde mit phosphospezifischen Antikörpern nachgewiesen und nach dem Knockdown von CDK2 reduziert. Die Assoziation der CDK9-S90A-Mutante mit dem großen P-TEFb-Komplex war reduziert und ihre Überexpression hemmte die HIV-1-Transkription. Im Gegensatz dazu zeigte die CDK9-S90D-Mutante eine unveränderte Assoziation mit großen und kleinen P-TEFb-Komplexen und induzierte Tat-abhängige HIV-1-Transkription. Das Phosphomimetikum S90 zeigte jedoch eine allgemeine Abnahme der CDK9-Expression, was darauf hindeutet, dass ein Phosphorylierungs- / Dephosphorylierungsgleichgewicht aufrechterhalten werden muss, um die großen und kleinen P-TEFb-Komplexe zu bilden. Die molekulare Modellierung zeigte, dass sich Ser-90 von CDK9 auf einer flexiblen Schleife befand, die einem Lösungsmittel ausgesetzt war, was darauf hindeutet, dass es einer Phosphorylierung unterzogen werden könnte (siehe auch Abbildung 2). So identifizierten unsere jüngsten Studien eine neuartige regulatorische Phosphorylierungsstelle auf CDK9, die zur Aktivierung oder Hemmung der HIV-1-Transkription eingesetzt werden kann.
5. Schlussfolgerung
Die Phosphorylierung und Dephosphorylierung spezifischer Stellen auf CDK9 erfolgt während des gesamten Transkriptionsprozesses und muss streng kontrolliert werden. Modifikationen an bestimmten Threonin / Serin-Resten bestimmen, ob CDK9 mit dem großen P-TEFb-Komplex assoziiert ist, um für die Rekrutierung verfügbar zu werden, und ob die Dissoziation des großen Komplexes effizient erfolgt. Die Phosphorylierung von Thr-186 in der T-Schleife von CDK9 und Ser-90, die außerhalb der T-Schleife liegt, bestimmt, ob CDK9 im inaktiven großen Komplex sequestriert bleibt und auch, ob die Kinase enzymatisch aktiv ist, sobald sie von 7SK snRNP dissoziiert ist. Die Dephosphorylierung an einer dieser Stellen führt zur Destabilisierung des großen Komplexes und zur Freisetzung von CDK9 / Cyclin T1, wodurch die Tat-Rekrutierung auf HIV-1 LTR beschränkt wird. Modifikationen im C-Terminus des CDK9 ermöglichen Cyclin T1 : TAR-Bindung und Dephosphorylierung an diesen Stellen verhindern die Bindung an TAR-RNA. Im Gegensatz dazu hemmt die Phosphorylierung an Thr-29- oder Ser-175-Resten CDK9. Daher scheint das sich abzeichnende Bild der CDK9-Regulation durch Phosphorylierung komplex zu sein und ähnelt teilweise dem, was für andere CDKs bekannt ist. Die kürzlich identifizierten CDK9-Zielkinasen CDK7, CDK2 und Phosphatasen PP1 und PPM1A werden sich wahrscheinlich als neuartige Ziele für Anti-HIV-1- und Krebstherapeutika herausstellen.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels besteht.
Danksagung
Dieses Projekt wurde vom District of Columbia Developmental Center for AIDS Research (P30AI087714), RCMI-NIH 2G12RR003048 vom Programm Research Centers in Minority Institutions (RCMI) (Abteilung für Forschungsinfrastruktur, Nationales Zentrum für Forschungsressourcen, NIH), der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (Nr. 12-04-91444-NIZ) und dem russischen Ministerium für Bildung und Wissenschaft (Nr. 2012-1.5-12-000-1001-030). Die Autoren möchten sich auch bei den Mitgliedern des Nekhai-Labors für Vorschläge bedanken und entschuldigen sich für diejenigen, deren Arbeit aus Platzmangel nicht zitiert wurde.
