Zusammenfassung

Syndecan-1 (CD138) ist ein Transmembran-Proteoglycan, von dem bekannt ist, dass es in verschiedenen normalen und malignen Geweben exprimiert wird. Es ist von Interesse wegen einer möglichen prognostischen Rolle der Differentialexpression in Tumoren und seiner Rolle als Ziel für Indatuximab, einen monoklonalen Antikörper, der mit einem zytotoxischen Mittel gekoppelt ist. Zur umfassenden Analyse von CD138 in normalen und neoplastischen Geweben verwendeten wir Tissue Microarrays (TMAs) zur Analyse der immunhistochemisch nachweisbaren CD138-Expression in 2.518 Gewebeproben von 85 verschiedenen Tumorentitäten und 76 verschiedenen normalen Gewebetypen. Die Daten zeigten, dass die CD138-Expression in Tumoren reichlich vorhanden ist. Zumindest eine gelegentlich schwache CD138-Immunfärbung konnte bei 71 von 82 (87%) verschiedenen Tumortypen nachgewiesen werden, und 58 Entitäten (71%) hatten mindestens einen Tumor mit einer starken Positivität. In normalen Geweben wurde eine besonders starke Expression in normalem Plattenepithel verschiedener Organe, Becher- und Säulenzellen des Gastrointestinaltrakts und in Hepatozyten gefunden. Die hoch standardisierte Analyse der meisten menschlichen Krebsarten führte zu einer Rangfolge der Tumoren nach Häufigkeit und Grad der CD138-Expression. Die CD138-Immunfärbung war am höchsten bei Plattenepithelkarzinomen wie der Speiseröhre (100%), dem Gebärmutterhals (79,5%), der Lunge (85,7%), der Vagina (89,7%) oder der Vulva (73,3%) und bei invasivem Urothelkrebs (76,2%). Bei Adenokarzinomen war CD138 auch bei Lungen- (82,9%) und Darmkrebs (85,3%) hoch, bei Pankreas- (73,3%), Magen- (54,2%) oder Prostatakarzinomen (16,3%) jedoch häufig niedriger. Die CD138-Expression war bei Keimzelltumoren, Sarkomen, endokrinen Tumoren einschließlich Schilddrüsenkrebs und neuroendokrinen Tumoren normalerweise gering oder nicht vorhanden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die bevorzugte Expression in Plattenepithelkarzinomen verschiedener Stellen diese Krebsarten zu Hauptzielen für Anti-CD138-Behandlungen macht, sobald diese verfügbar sind. Eine reichliche Expression in vielen verschiedenen normalen Geweben könnte jedoch Hindernisse für die Nutzung von CD138 als therapeutisches Ziel darstellen.

1. Einführung

Syndecan-1 (CD138) ist eines von vier Mitgliedern der Syndecan-Familie. Es ist ein Zelloberflächenprotein, das aus drei strukturellen Domänen besteht, von denen eine extrazellulär ist und Heparinsulfate und Chondroitinsulfate bindet . Syndecan-1 hat Relevanz für Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Es ist an der Regulation der Zellproliferation, Migration und Organisation des Zytoskeletts beteiligt . In normalen Geweben ist bekannt, dass CD138 auf Plasmazellen und verschiedenen Epithelzelltypen exprimiert wird.Die CD138-Expression bei Krebs ist von potenziellem klinischem Interesse, da spezifische Medikamente, die auf CD138 abzielen, derzeit in klinischen Studien evaluiert werden. In einer Phase-II-Studie zum Plasmozytom wurden klinische Wirksamkeit und geringe Nebenwirkungen berichtet . In präklinischen Studien zeigten diese Antikörper auch Wirksamkeit gegen dreifach negativen Brustkrebs und Melanom . Wenn sich Anti-CD138-Therapien als erfolgreich erweisen sollten, könnten auch andere CD138-positive Krebsarten von solchen Behandlungen profitieren.

Eine veränderte CD138-Expression wurde in verschiedenen malignen Tumoren beschrieben. Zum Beispiel wurde eine Überexpression von CD138 bei Brust-, Harnblasen-, Gallenblasen-, Pankreas-, Eierstock-, Endometrium- und Prostatakrebs berichtet . Bei anderen Krebsarten wie Lungen-, Kopf-Hals-, Magen-, Nieren- und Darmkrebs wurde festgestellt, dass die CD138-Expression im Vergleich zu angrenzendem normalem Epithel reduziert ist . Bei mehreren dieser Tumortypen war eine verminderte oder erhöhte CD138-Expression mit einem ungünstigen Tumorphänotyp und einer schlechten Patientenprognose verbunden . Frühere Studien zu CD138 bei Krebs haben verschiedene Reagenzien und Protokolle für ihre immunhistochemische Färbung angewendet. Es ist wahrscheinlich aus diesem Grund, dass die vorhandene Literatur in Bezug auf die Prävalenz der CD138-Expression in verschiedenen Tumortypen sehr unterschiedlich ist. Beispielsweise reicht der Bereich der gemeldeten CD138-Positivität von 26% bis 100% bei Harnblasenkrebs, von 23% bis 89% bei Plattenepithelkarzinomen der Lunge, von 33% bis 100% bei Brustkrebs, von 50,5% bis 87% bei Plattenepithelkarzinomen der Speiseröhre und von 24,7% bis 89,7% bei Plattenepithelkarzinomen des Gebärmutterhalses.

Angesichts dieser heterogenen Daten erlaubt die vorhandene Literatur nicht ohne Weiteres, diese Krebsarten zu bestimmen, bei denen CD138 eine besonders wichtige Rolle spielt. Um die Prävalenz und Intensität der CD138-Expression zwischen Tumorentitäten zu vergleichen und diese Krebsarten zu identifizieren, die optimale Kandidaten für Anti-CD138-Medikamente sein könnten, analysierten wir daher mehr als 2500 Krebsarten und 76 normale Gewebe unter Verwendung eines Standardprotokolls. Dazu wurde ein Multitumor Tissue Microarray (TMA) verwendet, das bis zu 50 verschiedene Tumore aus 85 verschiedenen Tumorarten und -subtypen enthielt. Die Ergebnisse unserer Studie identifizieren eine breite Palette von hoch CD138-exprimierenden Tumorentitäten.

2. Materialien und Methoden

2.1. Tissue Microarrays (TMAs)

Wir verwendeten zwei verschiedene Sätze von bereits existierenden TMAs, um die CD138-Expression in normalen menschlichen und krebsartigen menschlichen Geweben zu untersuchen. Die erste TMA bestand aus einer Probe von 76 verschiedenen normalen Gewebetypen (608 Proben auf einem Objektträger). Die zweite TMA enthielt insgesamt 3.642 Primärtumoren aus 85 Tumorarten und -subtypen. Die Proben wurden auf 7 verschiedene TMA-Blöcke verteilt (die zwischen 414 und 522 Proben enthielten). Die Zusammensetzung des TMA ist in Tabelle 1 unter Ergebnisse beschrieben. Alle Proben wurden aus dem Archiv des Instituts für Pathologie des Universitätsklinikums Hamburg (Hamburg, Deutschland) entnommen. Jeder TMA-Block enthält einen identischen Standardkontrollabschnitt mit 40 Normal- und Tumorgewebespots, um eine mögliche Slide-to-Slide-Variabilität der Immunfärbung zu kontrollieren. Gewebe wurden in 4% gepuffertem Formalin fixiert und dann in Paraffin eingebettet. Der Durchmesser des TMA-Gewebespots betrug 0,6 mm. Alle Arbeiten entsprachen der Helsinki-Erklärung. Eine Einverständniserklärung war nicht erforderlich.

2.2. Immunhistochemie

Frisch geschnittene TMA-Schnitte wurden an einem Tag und in einem Experiment immunisiert. Die Objektträger wurden entparaffiniert und 5 Minuten lang in einem Autoklaven bei 121 ° C in pH 9 Dako Target Retrieval Solution Buffer einer hitzeinduzierten Antigenentnahme ausgesetzt. Primärer Antikörper spezifisch für total Syndecan-1 (mouse monoclonal antibody, clone JASY1, Dianova, Hamburg, Deutschland, Verdünnung 1 : 200) wurde 60 Minuten bei 37°C appliziert. Gebundener Antikörper wurde dann unter Verwendung des EnVision-Kits (Dako, Glostrup, Dänemark) gemäß den Anweisungen des Herstellers visualisiert. Für Tumorgewebe wurde der Prozentsatz positiver Epithelzellen geschätzt und die Färbungsintensität semiquantitativ aufgezeichnet (0, 1 +, 2 + und 3+). Für statistische Analysen wurden die Färbeergebnisse in vier Gruppen eingeteilt. Tumore ohne Färbung wurden als negativ angesehen. Tumore mit 1+ Färbungsintensität in ≤70% der Zellen und 2+ Intensität in ≤30% der Zellen wurden als schwach positiv angesehen. Tumore mit 1+ Färbungsintensität in >70% der Zellen, 2+ Intensität in 30% bis 70% oder 3+ Intensität in ≤30% wurden als mäßig positiv angesehen. Tumore mit 2+ Intensität in >70% oder 3+ Intensität in >30% der Zellen wurden als stark positiv angesehen. Diese Kategorien stellen Standard-Cutoffs dar, die andere und wir in zahlreichen IHC-Studien verwendet haben .

3. Ergebnisse

3.1. Technische Probleme

Insgesamt 2.518 (69%) der 3.642 Tumorgewebeproben waren in unserer TMA-Analyse interpretierbar. Gründe für das Versagen der Analyse waren ein Bruchteil fehlender Proben oder Proben ohne eindeutige Tumorzellen. Für alle 76 Normalgewebetypen war eine ausreichende Anzahl von Proben analysierbar, die eine vollständige Normalgewebebewertung ermöglichten.

3.2. Syndecan-1 in Normalgeweben

Alle positiven CD138-Immunstainings in Normalgeweben sind in Tabelle 2 zusammengefasst. CD138 wurde reichlich exprimiert, meist in verschiedenen Epithelzelltypen. Eine besonders starke Expression von CD138 wurde in Plattenepithelzellen verschiedener Organe (Abbildung 1(a)), Becherzellen des Gastrointestinaltrakts (Abbildung 1(b)), Säulenzellen in der Gallenblase (Abbildung 1 (c)) und Hepatozyten (Abbildung 1 (d)) beobachtet. In folgenden Geweben wurde keine CD138-Färbung nachgewiesen: Aorta / Intima, Aorta / Media, Herz (linker Ventrikel), Skelettmuskel, Skelettmuskel / Zunge, Myometrium, Muskelwandanhang, Speiseröhre, Magen, Ileum, Colon descendens, Nierenbecken und Harnblase, Penis (Eichel / Corpus spongiosum), Eierstock (Stroma), Fettgewebe (weiß), Milz, Thymus, Eierstock (Corpus luteum), Eierstock (Follikelzyste), Schilddrüse, Kleinhirn, Großhirn, Hypophyse (posterior) Hypophyse (Vorderlappen) und Knochenmark.

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Abbildung 1

Repräsentative Bilder der CD138-Immunfärbung in normalen und tumorösen Geweben: (a) normale Leber, (b) hepatozelluläres Karzinom, (c) normale Speiseröhre, (d) Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre, (e) Dickdarmadenom und (f) Dickdarmkarzinom.

3.3. CD138 in tumorösen Geweben

Die Immunfärbung war überwiegend membranös, manchmal aber auch im Zytoplasma. Gelegentliche Stromafärbungen traten ebenfalls auf, wurden jedoch für diese Analyse außer Acht gelassen. CD138-Positivität wurde in 1.118 von 2.518 analysierbaren Tumoren beobachtet (Tabelle 1). Die CD138-Immunfärbung wurde bei 330 (13%) als schwach, bei 226 (9%) als mäßig und bei 562 Tumoren (22%) als stark angesehen. Repräsentative Tumorgewebespots mit CD138-Expression sind in den Abbildungen 1 (e) und 1 (h) dargestellt. Mindestens eine CD138-Expression konnte in 75 von 85 (88%) unserer Tumorkategorien nachgewiesen werden, einschließlich 60 (71%) Kategorien, in denen mindestens ein Tumor eine starke Positivität zeigte (Tabelle 1). Zu den Tumortypen, bei denen in allen analysierten Fällen CD138 beobachtet wurde, gehörten Basalzelladenom, Kolonadenom, Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre, Granulatzelltumor und Ovarialbrennertumor. Eine besonders signifikante CD138-Expression wurde auch bei Analkarzinomen (90,9%), Plattenepithelkarzinomen der Haut (92,9%), hepatozellulären Karzinomen (97,7%), Phyllodenkarzinomen der Brust (94,4%) und Warthin-Tumoren der Parotis (92,7%) nachgewiesen. Tumortypen mit einer besonders niedrigen oder fehlenden CD138-Immunfärbung umfassten Hodenkeimzelltumoren, mehrere Sarkome, Melanome, malignes Mesotheliom und kleinzelliges Harnblasenkarzinom.

4. Diskussion

Die Ergebnisse dieser Studie geben einen umfassenden Überblick über die Syndecan-1-Expression in humanen Tumoren. Die Daten zeigen, dass Plattenepithelkarzinome (und Urothelkarzinome) in allen Herkunftsorganen besonders anfällig für die Expression von Syndecan—1 sind, häufig in hohen Konzentrationen. Obwohl Adenokarzinome aus dem Dickdarm und der Lunge ebenfalls hohe Expressoren sind, scheint die CD138-Immunfärbung bei Adenokarzinomen im Allgemeinen weniger intensiv und weniger häufig zu sein. Dies ist am besten in Organen sichtbar, in denen sowohl Adenokarzinome als auch Plattenepithelkarzinome auftreten, wie im Gebärmutterhals und in der Speiseröhre. Die Plattenepithelkarzinom-Dominanz der CD138-Expression zeigt sich sogar bei Krebsarten mit identischer Pathogenese wie Gebärmutterhalskrebs, Mundkrebs oder Plattenepithelkarzinom des Anus, die häufig mit dem humanen Papillomavirus assoziiert sind. Klinisch wichtige Krebsarten mit niedrigen bis mittleren Frequenzen und Niveaus der CD138-Expression umfassen Krebserkrankungen der Niere und des Endometriums, während niedrige Frequenzen der Positivität bei Prostatakrebs, endokrinen Tumoren einschließlich Schilddrüsenkrebs und neuroendokrinen Tumoren sowie Keimzellkrebs gefunden wurden. Trotz einiger Ausreißer stimmen unsere Daten weitgehend mit der Literatur überein. Mehrere andere Forscher hatten zuvor besonders hohe CD138-Expression bei Plattenepithelkarzinomen beschrieben .

Die standardisierte Bewertung von 85 verschiedenen Tumortypen und Subtypen ermöglichte es uns, eine Rangfolge in Bezug auf den Grad der CD138-Expression bei Krebs zu definieren. Wir glauben, dass diese Daten besonders hilfreich für diese Tumortypen sind, für die frühere Daten teilweise nicht übereinstimmten. Die Studie lieferte auch Informationen zu einer Reihe relevanter Tumortypen, für die bisher CD138-Daten fehlten. Dazu gehören beispielsweise Plattenepithelkarzinome der Vulva und des Analkanals, Adenokarzinome der Speiseröhre, Seminome, embryonale Karzinome und Dottersacktumore der Hoden, kleinzelliger Blasenkrebs, neuroendokrine Tumoren der Bauchspeicheldrüse, Phäochromozytome, Thymome, gastrointestinale Stromatumore (GIST), Angiosarkome und Leiomyosarkome. Darüber hinaus wurden subtypspezifische Daten für mehrere Tumortypen erhalten, für die frühere Analysen an Tumorkohorten mit weniger detaillierten Informationen zur Tumormorphologie wie Urothelkarzinom, Brust-, Endometrium- und Eierstockkrebs durchgeführt wurden. Diese Daten stellen somit ein weiteres Beispiel für die Eignung von TMAs dar, die aus Proben vieler verschiedener Tumortypen und normaler Gewebe bestehen, um einen Biomarker oder Antikörper umfassend zu charakterisieren (eine Demonstration unserer Daten im Vergleich zu früheren Studien ist in Abbildung 2 dargestellt) .

Abbildung 2

Übersicht der CD138-Expression in Tumorgewebe aus verschiedenen Studien, die gemäß der vorliegenden Studie eingestuft wurden (rotes Kreuz), Punkte für Studien mit subtypspezifischen Daten, Quadrate für Studien ohne subtypspezifische Daten und Farbcode gibt die Anzahl der in früheren Studien enthaltenen Tumoren an: rot: <10, gelb: 10-25 und schwarz: >25.

Verschiedene frühere Studien haben einen Zusammenhang mit einem schlechten Patientenergebnis für entweder erhöhte oder verringerte Syndecan-1-Spiegel vorgeschlagen . CD138-Protein kann Tumorsuppressor- und tumorfördernde Funktionen haben, die vom Tumor abhängen . Unsere Tumor-Kohorte war frei von Tumorstadium oder klinische Ergebnisse Informationen. Indirekte Hinweise auf eine variable Rolle der differentiellen CD138-Expression für die Tumorprogression ergeben sich jedoch aus dem Vergleich verwandter Tumorsubtypen. Zum Beispiel sprechen die niedrigeren Expressionsniveaus von CD138 im kolorektalen Adenokarzinom und im invasiven Urothelkarzinom (pT2-4) im Vergleich zu Kolonadenomen und nichtinvasiven Blasentumoren (pTa) für einen Verlust von CD138 parallel zur Tumorprogression in diesen Tumoren. Die geringere Expression von CD138 im chromophoben Nierenkarzinom im Vergleich zu seinem benignen Gegenstück Onkozytom kann auch als Argument dafür angesehen werden, dass die CD138-Herunterregulation mit der Tumoraggressivität bei diesen Nierenkrebsarten verbunden ist, die aus dem distalen Nephrontubulus stammen. Höhere CD138-Expression im kortikalen Nebennierenkarzinom als im Nebennierenadenom deuten jedoch darauf hin, dass erhöhte CD138-Spiegel das Fortschreiten dieser Tumoren begleiten können.

CD138 ist ein Membranprotein und als solches ein potenzielles Ziel für Antikörpertherapeutika. Es gibt Bemühungen, eine geeignete Therapie für CD138-positive Krebsarten zu entwickeln. Es wurde gezeigt, dass CD138 auf der Oberfläche multipler Myelomzellen überexprimiert ist, was in einer präklinischen Studie für eine antitumorale Therapie mit Indatuximab verwendet wird, einem monoklonalen Antikörper, der mit einem zytotoxischen Mittel gekoppelt ist und derzeit in präklinischen Studien an Plasmazytomen und dreifach negativen Brustkrebserkrankungen in Kombination mit anderen Arzneimitteln untersucht wird . Basierend auf unseren Daten ergeben sich Plattenepithelkarzinome, unabhängig von ihrem Entstehungsort, als weitere mögliche Kandidaten für eine Anti-CD138-Therapie, sobald sich eine solche Behandlung als effizient erweisen und verfügbar sein sollte. Die reichliche Expression von CD138 in verschiedenen normalen Geweben einschließlich Plattenepithel aus verschiedenen Organen identifiziert verschiedene Stellen, an denen mögliche Nebenwirkungen dieser Therapien auftreten könnten.Die CD138-Expressionsanalyse wird derzeit in der routinemäßigen diagnostischen Pathologie zur Unterscheidung und Quantifizierung von Plasmazellen verwendet, beispielsweise im Knochenmark und in Endometriumbiopsien, bei denen das Vorhandensein von Plasmazellen auf eine chronische Endometritis hinweist. Abgesehen von zwei möglichen Ausnahmen liefern unsere Daten wenig Beweise für die Syndecan-1-Expressionsanalyse, die diagnostische Hinweise in schwierigen diagnostischen Situationen liefert. Die geringe Expression bei Mesotheliomen im Vergleich zur hohen Prävalenz einer starken Expression bei Lungenadenokarzinomen legt nahe, dass Syndecan-1 möglicherweise zu der langen Liste von Antikörpern hinzugefügt werden könnte, die zur Unterscheidung dieser Tumorentitäten beitragen. Eine niedrige Häufigkeit der Syndecan-1-Expression (10%) wurde kürzlich auch für das Peritonealmesotheliom beschrieben . Darüber hinaus war CD138 beim hepatozellulären Karzinom im Vergleich zum cholangiozellulären Karzinom der Leber deutlich höher. Andere Antikörper wie beispielsweise Arginase oder BSEP sind jedoch bessere Separatoren dieser Tumorentitäten .

Es ist eine Einschränkung dieser Studie, dass immunhistochemische Ansätze, insbesondere bei Verwendung der Hellfeldvisualisierung, für die Proteinquantifizierung nicht optimal sind. Wichtig ist, dass das Fehlen einer Immunfärbung eine biologisch relevante CD138-Expression in „negativen“ normalen oder neoplastischen Zellen nicht ausschließt. Jedes Protokoll definiert eine Nachweisschwelle, unterhalb derer Gewebe als negativ gelten. Oberhalb dieser Nachweisgrenze ermöglicht die Färbungsintensität eine gewisse Quantifizierung von Proteinen, die jedoch durch eine maximale Intensitätsfärbung begrenzt ist, die bei noch höheren Proteinexpressionsniveaus nicht merklich stärker werden kann. Darüber hinaus wurden gelegentliche Stromafärbungen in unserer Studie außer Acht gelassen, obwohl andere und wir gezeigt haben, dass es Hinweise auf eine klinisch relevante Rolle der CD138-Expression im tumorassoziierten Stroma gibt . Die Stromafärbung ist jedoch selten und würde für eine aussagekräftige Analyse größere Probenzahlen pro Krebstyp erfordern.Zusammenfassend bietet diese Studie einen umfassenden Überblick über die CD138-Expression in menschlichen Tumoren. Die bevorzugte Expression in Plattenepithelkarzinomen verschiedener Stellen macht diese Krebsarten zu Hauptzielen für Anti-CD138-Behandlungen, sobald diese verfügbar sind. Eine reichliche Expression in vielen verschiedenen normalen Geweben könnte jedoch Hindernisse für die Nutzung von CD138 als therapeutisches Ziel darstellen.

Datenverfügbarkeit

Die immunhistochemischen Daten, die zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind im Artikel enthalten.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels besteht.

Beiträge der Autoren

JI, DP, C H-M, GS, RS, CM und C M-K konzipierten und entwarfen die Studie, analysierten die Daten und entwarfen das Manuskript. SW, CF und SK führten die meisten wichtigen immunhistochemischen Analysen durch. GS, SK und RS waren an der ursprünglichen Konzeption der Studie beteiligt. TC, FB, FJ und C H-M lieferten die Daten. WW, VC, AL, AH, DH, GS, SK und KM nahmen an der Gewebeverarbeitung, der pathologischen Diagnose und der immunhistochemischen Analyse teil. DD, AB, CG, AM, GS und RS stellten die Materialien, klinischen Follow-up-Daten und technische Unterstützung zur Verfügung. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und genehmigt.