Fallstudie: Entdeckung von Inhibitoren spannungsgesteuerter Natriumkanäle
Um die oben beschriebenen Probleme im Zusammenhang mit der Entdeckung von Ionenkanälen zu veranschaulichen, wird der Rest dieses Artikels eine Fallstudie beschreiben, die sich auf die Identifizierung spannungsgesteuerter Natriumkanalinhibitoren zur Behandlung chronischer neuropathischer Schmerzen konzentriert. Die Behandlung von Schmerzen ist ein ernstes medizinisches Problem, und es gibt große Anstrengungen in der Pharmaindustrie, neue Therapien für diesen Zustand zu entwickeln. Insbesondere die Behandlung von neuropathischen Schmerzen, die von der International Association for the Study of Pain (IASP) als „chronische Schmerzen, die aus einer primären Läsion oder Dysfunktion des peripheren Nervensystems resultieren“ definiert werden, bleibt ein großer ungedeckter medizinischer Bedarf.Es ist klar, dass spannungsgesteuerte Natrium (Nav1) -Kanäle eine Schlüsselrolle bei der Entstehung und Ausbreitung von sensorischen Nervenaktionspotentialen spielen, die für die Schmerzsignalisierung notwendig sind. Lokale Anwendungen von Nichtsubtyp-selektiven Natriumkanalblockern, wie Novocain, bieten eine vollständige Schmerzlinderung durch Leitungsblockade. Dieser Ansatz zur Schmerzlinderung ist jedoch auf sehr wenige Anwendungen wie zahnärztliche Eingriffe beschränkt, da Natriumkanäle auch für die Leitung im Herzen, im ZNS, im Skelettmuskel und in nicht-nozizeptiven sensorischen Neuronen von entscheidender Bedeutung sind. Die Nav1-Superfamilie besteht aus 10 Mitgliedern (Yu und Catterall, 2004). Sieben dieser Subtypen, Nav1.1, Nav1.3, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8 und Nav1.9, sind im peripheren Nervensystem (PNS) vorhanden. Von diesen werden Nav1.7, Nav1.8 und Nav1.9 überwiegend in nozizeptiven Neuronen und Nav1 exprimiert.3 ist überwiegend embryonal, wird aber nach einer Verletzung im adulten PNS hochreguliert. Dieses begrenzte Expressionsmuster macht diese Subtypen zu attraktiven Zielen für die Entwicklung neuer Analgetika. Ihr relativer Beitrag zur Schmerzsignalisierung und insbesondere zur neuropathischen Schmerzsignalisierung ist jedoch unklar und kann mit verschiedenen Ätiologien und sensorischen Qualitäten des Schmerzes variieren.
In Abwesenheit einer molekularen Selektivität für einen Nav1-Subtyp ist es möglich, Nav1-Kanäle in einem gegebenen Konformationszustand spezifisch anzuvisieren, während die natriumkanalabhängige Impulsleitung erhalten bleibt. Diese Art der zustandsabhängigen Hemmung ist die Grundlage für das therapeutische Fenster, das bei natriumkanalblockierenden Antikonvulsiva und Antiarrhythmika wie Lamotrigin und Lidocain beobachtet wird. Diese Medikamente haben eine höhere Affinität für Kanäle in den offenen und / oder inaktivierten Zuständen als für ruhende, geschlossene Kanäle. Dieser Mechanismus der Hemmung begünstigt die Bindung in schnell feuernden oder teilweise depolarisierten Geweben. Neuropathische Schmerzen sollten empfindlich auf diesen Hemmmechanismus reagieren, da angenommen wird, dass sie aus verletzungsinduzierten Depolarisationsbereichen entstehen, eine Hypothese, die durch die klinische Wirksamkeit von Lidocain gestützt wird, das systemisch in subanästhetischen Dosen verabreicht wird. Darüber hinaus kann ein nichtsubtypselektiver, zustandsabhängiger Block die größte Wirksamkeit bieten, da einzelne Knockouts von Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 oder Nav1.9 lieferte keine überzeugenden Beweise für eine dominante Rolle eines dieser Kanäle bei der neuropathischen Schmerzsignalisierung.Basierend auf dieser Begründung wurde die Entscheidung getroffen, zunächst Nichtsubtyp-selektive, zustandsabhängige Nav1-Inhibitoren zu verfolgen und gleichzeitig die molekulare Selektivität zu überwachen, indem Verbindungen von Interesse auf Nav1.7, Nav1.5 (dem primären kardialen Natriumkanal) und Nav1.8 parallel getestet wurden.
Ein membranpotentialbasierter Assay wurde verwendet, um ∼200.000 Verbindungen auf Nav1.8 zu screenen, die stabil in einer rekombinanten Zelllinie exprimiert wurden. Dieser HTS-Assay basierte auf dem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Mitgliedern eines membranpotentialempfindlichen Farbstoffpaares, das von Aurora Biosciences (Priest et al., 2004). Nav1.8-Kanäle wurden mit Testverbindung und dem chemischen Agonisten Deltamethrine in Abwesenheit von extrazellulärem Natrium vorinkubiert. Die anschließende Zugabe von Natrium führte zu einer Membrandepolarisation und der Nav1-Block wurde als Interferenz mit diesem zellulären Depolarisationsprozess quantifiziert.
Obwohl der Startbildschirm auf Nav1.8 ergab eine Vielzahl von Treffern, Nur eine einzige Verbindung wurde als brauchbares Blei für die Bemühungen der medizinischen Chemie angesehen. Bevor Ressourcen auf diese Leitung übertragen wurden, wurde die Verbindung, ein disubstituiertes Succinimid, das als BPBTS (N-{methyl } -N‘- (2,2′-bithien-5-yl-methyl) -succinimid) bezeichnet wird, durch manuelle Ganzzellenspannungsklemmen im Detail untersucht. Es wurde festgestellt, dass BPBTS alle Nav1-Subtypen mit ähnlicher Potenz hemmt, und die Hemmung war abhängig vom Membranpotential und der Stimulationsfrequenz. Dieser inhibitorische Mechanismus war konsistent mit einer höheren Affinität der Verbindung für Kanäle im offenen und inaktivierten Zustand im Vergleich zu Kanälen im Ruhezustand. Darüber hinaus war BPBTS um zwei Größenordnungen wirksamer als die klinisch verwendeten antikonvulsiven und antiarrhythmischen Nav1-Blocker und hemmte den inaktivierten Zustand von Nav1.8, Nav1.7, Nav1.5 und Nav1.2 mit Ki-Werten von 0,09, 0,15, 0,08 und 0,14 µM und den Ruhezustand mit Kr-Werten von 1,5, 1,3, 0,3 bzw. 1,2 µM (Priest et al., 2004).
Als solches war BPBTS ein attraktiver Vorsprung für die medizinische Chemie; seine Hauptverbindlichkeiten sind ein schlechtes pharmakokinetisches Profil. Im Verlauf der Profilerstellung von Analoga von BPBTS sowie von Nav1-Inhibitoren unter Verwendung des membranpotentialbasierten Fluoreszenz-Screening-Assays wurden für einige Verbindungen strukturbasierte Diskrepanzen zwischen den im Fluoreszenz-Assay und durch Elektrophysiologie bestimmten Potenzen festgestellt. Diese Diskrepanzen wurden auf eine Wechselwirkung zwischen diesen Verbindungen und dem Agonisten Veratridin zurückgeführt, der zum Öffnen von Nav1.7-Kanälen verwendet wurde. Anschließend wurde der Fluoreszenzassay so modifiziert, dass Nav1-Kanäle mit Testverbindung in physiologischen extrazellulären Natriumkonzentrationen vorinkubiert wurden und die Nav1-abhängige Depolarisation durch Agonistenzugabe initiiert wurde (Fig. 1). Die in diesem modifizierten Assay gemessenen kanalinhibitorischen Potenzen korrelierten sehr gut mit der elektrophysiologisch bestimmten inaktivierten Zustandshemmung über viele Strukturklassen von Nav1-Inhibitoren hinweg (Felix et al., 2004; Liu et al., 2006).
Ein funktioneller, Membranpotential-FRET-basierter Assay für Nav1.7-Kanäle. In Abwesenheit anderer ionischer Leitfähigkeiten, die die Zelle hyperpolarisieren können, stellt die heterologe Expression von Nav1.7-Kanälen ein System bereit, bei dem sich die meisten Kanäle auf dem Zellruhemembranpotential im nicht leitenden inaktivierten Zustand befinden. Die Entfernung der schnellen Inaktivierung durch die Zugabe von Veratridin verschiebt das Gleichgewicht des Kanals in den leitfähigen, offenen Zustand, der den Natriumeintritt ermöglicht, was zu einer Zelldepolarisation führt. Die Spannungsänderungen können mit einem Paar von FRET-Spannungsmessfarbstoffen, Cumarin und Oxonol, überwacht werden. Die Zelldepolarisation verändert die Verteilung von Oxonol über die Membran und verursacht eine Änderung des FRET-Signals. In Gegenwart eines Nav1.7-Inhibitors verschiebt sich das Kanalgleichgewicht in Richtung der inaktivierten, arzneimittelgebundenen Konformation, wodurch die Anzahl der Kanäle verringert wird, die für die Veratridinmodifikation verfügbar sind, und das agonisteninduzierte FRET-Signal verhindert wird. Die Dosis-Wirkungs-Kurve für die Veratridin-induzierte Änderung des FRET-Signals ist steil, was darauf hindeutet, dass die Modifikation einer kleinen Anzahl von Nav1.7-Kanälen ausreicht, um eine Zelldepolarisation zu verursachen.
Obwohl Analoga von BPBTS den anfänglichen Vorsprung in der Potenz nicht übertreffen konnten, gelang es der medizinischen Chemie, das pharmakokinetische Profil zu verbessern und schließlich trans-N- {methyl} -N-methyl-N‘-cyclopentan-1,2-dicarboxamid (CDA54) mit 44% oraler Bioverfügbarkeit, einer Halbwertszeit von einer Stunde und einer Clearance-Rate von 14 ml / min / kg zu erzeugen, die ausführlich in vivo profiliert wurde (Brochu et al., 2006). In zwei Rattenmodellen für neuropathische Schmerzen reduzierte CDA54 (10 mg / kg, oral verabreicht) die durch Nervenverletzungen verursachte Verhaltensüberempfindlichkeit signifikant um 44-67%. Die gleiche Dosis / Plasmakonzentration von CDA54 beeinflusste nicht die akute Nozizeption (Ratten-Hot-Plate-Assay), die motorische Koordination (Ratten-Rotorod-Assay) oder die Herzleitung (elektrophysiologische Parameter, gemessen am kardiovaskulären Hund). Diese Eigenschaften stehen im Gegensatz zu denen der derzeit in der Klinik verwendeten Natriumkanalblocker, die bei allen wirksamen Dosen eine gestörte motorische Koordination bei Ratten und ZNS-Nebenwirkungen beim Menschen verursachen. Interessanterweise betrug das Verhältnis von Gehirn zu Plasma für CDA54 bei oraler Dosierung 0,03. Im Gegensatz dazu reichern sich klinisch verwendete Nav1-Blocker im ZNS an, mit einem Gehirn-Plasma-Verhältnis von mehr als 10 für Mexiletin. Diese mit CDA54 erhaltenen Daten deuteten stark darauf hin, dass die Hemmung der PNS-Natriumkanäle allein in Tiermodellen für neuropathische Schmerzen wirksam ist und dass die Begrenzung der ZNS-Exposition von Nav1-Inhibitoren ein praktikabler Ansatz zur Entwicklung von Nav1-Inhibitoren mit einem verbesserten therapeutischen Index ist.
Eine UHTS-Kampagne, die den beschriebenen membranpotentialbasierten Assay zum Screening auf Inhibitoren von Nav1.7 verwendete, entdeckte die neuartigen 1–Benzazepin-2-Ein-Kanal-Inhibitoren (Hoyt et al., 2007; Williams et al., 2007). Diese Klasse von Inhibitoren zeigte eine definierte Struktur-Aktivitäts-Beziehung und, wenn in vivo ausgewertet, Mitglieder dieser Serie waren oral wirksam in Nagetier neuropathische Schmerzen und Epilepsie-Modelle. Wichtig ist, dass einige Mitglieder dieser Klasse molekulare Selektivität für Nav1.7-Kanäle zeigten (Williams et al., 2007). Beispielsweise ist die Verbindung 2 der Fig. 2 war stark zustandsabhängig und ∼10-fach selektiv für Nav1.7 über Nav1.8 und Nav1.5. Das stärkste, wenn auch nicht subtypselektive Mitglied dieser Klasse von Nav1.7-Inhibitoren (Verbindung 1, BNZA; Abb. 2) wurde tritiiert. BNZA bindet mit hoher Affinität (Kd von 1,6 nM) an rekombinante Nav1.7-Kanäle. Dies ist die erste Demonstration der hochaffinen Ligandenbindung an Nav1.7 und bietet ein wertvolles Screening-Tool zur Suche nach Nav1.7-selektiven Verbindungen. Daten, die mit der 1-Benzazepin-2-on-Strukturreihe erhalten wurden, legen nahe, dass Nav1.7-selektive Analoga können identifiziert werden, und mit den entsprechenden pharmakokinetischen und arzneimittelmetabolischen Eigenschaften könnten solche Verbindungen als Analgetika entwickelt werden, die möglicherweise eine verbesserte Verträglichkeit gegenüber bestehenden Arzneimitteln zur Behandlung neuropathischer Schmerzen aufweisen. Unterstützung für die Machbarkeit der Entwicklung von subtypselektiven Natriumkanalinhibitoren als neuartige Analgetika kommt aus dem jüngsten Bericht eines hochaffinen Nav1.8-Selektivmittels, das intraperitoneal in einer Vielzahl von Nagetierschmerzmodellen wirksam war (Jarvis et al., 2007).
1-Benzazepin-2-on-Nav1-Inhibitoren. Die Strukturen von zwei 1-Benzazepin-2-on-Nav1-Inhibitoren sind zusammen mit ihren Potenzen für HNAV1.5-, hNav1.7- und hNav1.8-Kanäle dargestellt, wie sie in FRET-basierten Assays mit funktionellem Membranpotential bestimmt wurden. Die geschätzten Potenzen dieser Verbindungen für den inaktivierten Zustand von hNav1.5- und hNav1.7-Kanälen, wie sie aus elektrophysiologischen Aufzeichnungen bestimmt wurden, werden ebenfalls vorgestellt. Beachten Sie, dass nur Verbindung 2 die Selektivität für den hNav1.7-Kanal anzeigt. Beide Verbindungen sind schwächere Inhibitoren des hNav1.8-Kanals.
Ein möglicher alternativer Ansatz zur Suche nach subtypselektiven Natriumkanalinhibitoren wäre das Screening auf Verbindungen, die auf Kanal-Gating-Mechanismen abzielen. Es wurde bereits gezeigt, dass mehrere Peptide das Gating von Natriumkanälen modifizieren, aber es wurde beschrieben, dass nur wenige kleine Moleküle, insbesondere Inhibitoren, auf diese Weise funktionieren. Ein solches Mittel ist ProTx-II, ein aus Vogelspinnengift gereinigtes 30-Aminosäurepeptid; Dieses Peptid blockiert Natriumkanäle und zeigt Selektivität für Nav1.7 (Smith et al., 2007). ProTx-II bindet an den Ruhezustand von Natriumkanälen und verschiebt die Spannungsabhängigkeit der Kanalaktivierung auf mehr depolarisierte Potentiale. Starke Depolarisationen überwinden die Kanalhemmung, was ein Markenzeichen dieser Art von Gating-Modifikator-Peptid ist. Eine mögliche Strategie zur Identifizierung von niedermolekularen Mimetika eines Gating-Modifikator-Peptids besteht darin, ProTx-II in biologisch aktiver Form radioaktiv zu markieren und einen Bindungsassay mit Nav1.7-Kanälen zu entwickeln, die heterolog in einer Zelllinie exprimiert werden. Das Screening auf kleine Moleküle, die die ProTx-II-Bindung modulieren, könnte neue Klassen von Kanalinhibitoren aufdecken, die sich in die Membran verteilen und die Bewegung des Angusspaddels stören, wodurch die Kanalöffnung verhindert wird. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Art von UHTS besteht darin, dass hohe Konzentrationen von Testverbindungen eingesetzt werden können, was beim farbstoffbasierten Screening aufgrund von Fluoreszenzinterferenzen, die typischerweise bei hohen Konzentrationen vieler kleiner organischer Moleküle auftreten, ausgeschlossen ist. Angesichts der Tatsache, dass einige Gating-Modifikator-Peptide an Regionen binden, die für bestimmte Kanäle innerhalb einer Superfamilie einzigartig sind, könnten subtypselektive Inhibitoren unter Verwendung einer solchen Strategie identifiziert werden.
