In den letzten zehn Jahren wurden bemerkenswerte Fortschritte auf den Gebieten der Proteomik und der Genomik erzielt. Neben grundlegenden technischen Fortschritten, die zu einem erhöhten Volumen an qualitativ hochwertigen Daten geführt haben, bietet diese „Omics“ -Revolution auch einige interessante Einblicke in die Vielfalt der Prozesse, die die Tumorentstehung bei vielen verschiedenen Krebsarten beim Menschen regulieren. Die großen Roadmaps der Gen- und Proteinexpression, die durch diese Methoden erzeugt werden, können oft verwendet werden, um Krebserkrankungen zu klassifizieren oder die Reaktion auf bestimmte Arten von Behandlungen vorherzusagen. Sie können jedoch häufig keine spezifischen Regulatoren identifizieren, die als vielversprechende Ziele für die nächste Generation von Krebsmedikamenten dienen können, vor allem, weil viele der wichtigsten „arzneimittelfähigen“ Proteinklassen Enzyme sind, die sowohl auf der Ebene der Transkription und Translation als auch auf der Ebene der Enzymaktivität streng reguliert sind. Daher liefern viele heute übliche „omic“ -Methoden keine Informationen über die dynamische Regulation eines bestimmten Enzyms oder einer bestimmten Enzymfamilie während der vielen Stadien der Krebsentstehung. In dieser Ausgabe von PNAS, Shields et al. (1) verwenden Sie eine relativ neue Methode, die als „aktivitätsbasierte Proteomik“ bezeichnet wird, um ein Protein mit Serinhydrolaseaktivität zu identifizieren, das ein wesentlicher Regulator des Tumorzellwachstums ist. Mit diesem funktionellen Ansatz konnten die Autoren ein spezifisches Enzymziel identifizieren, das als wertvolles Ziel für die Entwicklung von Krebsmedikamenten dienen kann.
Das Gebiet der aktivitätsbasierten Proteomik oder chemischen Proteomik hat sich als Alternative zu Standard-Proteommethoden herauskristallisiert, die in erster Linie Informationen über die Gesamthäufigkeit von Proteinen liefern (für Reviews siehe Refs. 2–4). Der aktivitätsbasierte proteomische Ansatz nutzt kleinmolekulare Sonden, die aktivitätsabhängig an Enzyme binden und so sowohl die Quantifizierung der Dynamik der Enzymregulation als auch die direkte Isolierung und Identifizierung der interessierenden Ziele ermöglichen (Abb. 1). Mit der Entwicklung vieler neuer Klassen von Sonden (2) sowie neuer Klassen von Affinitäts- und Fluoreszenzmarkierungen (5) hat die aktivitätsbasierte Proteinprofilierung (ABPP) zunehmend Verwendung bei der Identifizierung von Schlüsselregulatoren menschlicher Krankheiten gefunden. Insbesondere eine Reihe neuerer wissenschaftlicher Beispiele zeigen den Wert von ABPP bei der Identifizierung interessanter Regulatoren der Krebsprogression (4, 6-8).
Aktivitätsbasierte Proteomik oder aktivitätsbasiertes Proteinprofiling (ABPP). In diesem Beispiel werden Tumorgewebeproben mit einer aktivitätsbasierten Sonde (ABP) markiert, die eine reaktive Fluorophosphonatgruppe enthält. Nach der Markierung von Zielenzymen (in diesem Fall Serinhydrolasen) werden markierte Proteine durch SDS / PAGE getrennt, und die relativen Aktivitätsniveaus werden durch die Intensität der Sondenmarkierung bestimmt. Potenziell interessante Ziele werden als mit erhöhten oder reduzierten Aktivitätsniveaus in Tumorproben identifiziert. Markierte Targets werden durch Affinitätsreinigung über den Sonden-Tag isoliert und massenspektrometrisch identifiziert.
In der Studie von Shields et al. (1) in dieser Ausgabe verwendeten die Autoren eine Breitband-Serinhydrolase-Sonde, um menschliches Pankreaskrebsgewebe zu profilieren. Diese Bemühungen führten zur Identifizierung eines Proteins, das als Retinoblastom-bindendes Protein 9 (RBBP9) bezeichnet wird und in 40% der analysierten Tumorgewebe eine erhöhte Hydrolaseaktivität aufwies. Interessanterweise war dieses Protein zuvor als Retinoblastom (Rb) -bindendes Protein identifiziert worden und hatte keine bekannte Enzymaktivität (9). Frühere Studien zur Funktion dieses Proteins deuteten darauf hin, dass seine Überexpression den Wirkungen von TGFß bei der Unterdrückung des Zellwachstums eine Resistenz verleiht. Es wurde jedoch angenommen, dass diese Effekte auf die TGFß-Signalisierung das direkte Ergebnis der Bindung von RBBP9 an Rb sind, was zur Freisetzung des Transkriptionsfaktors eukaryotic Translation Initiation Factor 1 (EIF-1) führt. In ihrer aktuellen Studie haben Shields et al. zeigen Sie, dass RBBP9 Serinhydrolaseaktivität aufweist und, was noch wichtiger ist, dass diese Enzymaktivität für die transformierenden Wirkungen dieses Proteins in Krebszellen erforderlich ist. Der Verlust der Hydrolaseaktivität durch Mutation des aktiven Zentrums Serin (identifiziert durch Homologie zu anderen Serinhydrolasen) oder RNAi-vermittelten Knock-down des Proteins führt zu einer Erhöhung der Smad 2/3 Phosphorylierung, eine Abnahme der Expression von Adhäsionsmolekülen wie E-Cadherin, und eine anschließende Verringerung des Tumorwachstums. Darüber hinaus stellen die Autoren fest, dass die RBPP9-Aktivität bei einer Reihe anderer menschlicher Krebsarten erhöht ist, was darauf hindeutet, dass die Hemmung dieser Hydrolaseaktivität breite tumorsuppressive Wirkungen haben kann, was sie zu einem potenziell wertvollen Ziel für die Entwicklung von Krebsmedikamenten macht.
Die Studie von Shields et al. demonstriert die Leistungsfähigkeit des ABPP-Ansatzes. Erstens ermöglichte dieser Ansatz die Identifizierung einer Enzymaktivität in einem Protein, von dem gezeigt wurde, dass es bei der Regulation der Zellwachstumssignale funktioniert. Mit dem ABPP-Ansatz war es möglich, die Dynamik der Regulation dieser Enzymaktivität zu überwachen, ohne ein natives Substrat identifizieren und einen In-vitro-Assay erstellen zu müssen. Zweitens waren die Expressionsniveaus von RBBP9 sowohl in normalen als auch in Krebsgeweben äquivalent, was darauf hindeutet, dass die Enzymaktivität den funktionellen Beitrag dieses Proteins zum Tumorzellwachstum antreibt. Daher wäre keine der derzeitigen genomischen oder proteomischen Methoden in der Lage, dieses Ziel als Schlüsselregulator für Krankheiten zu identifizieren.
Natürlich bleiben viele Fragen über die genaue mechanistische Rolle von RBBP9 bestehen. Am wichtigsten ist, was sind die nativen Substrate dieses Enzyms? Hydrolysiert das Enzym tatsächlich seine Substrate? Was ist die Folge der Substrathydrolyse? Wie führt die Substratverarbeitung zur Regulierung der Smad2 / 3-Signalisierung? Es wird interessant sein zu sehen, ob RBBP9 leicht durch kleine Moleküle gehemmt werden kann, so dass es als potenziell lebensfähiges Wirkstoffziel mit fortgeschritteneren Mausmodellen von menschlichem Krebs validiert werden kann. Die Antworten auf diese Fragen werden sicherlich dank der Verfügbarkeit von aktivitätsbasierten Sonden kommen.
