Ergebnisse und Diskussion

HANCs stammen aus der Kopfepidermis und erfordern eine lb-Genfunktion. Frühere Studien (5, 11, 17, 19) haben die Rolle von lb-Genen bei Prozessen zur Bestimmung des Zellschicksals beschrieben. In Drosophila, Gewinn und Verlust von Funktionsexperimenten haben gezeigt, dass lb-Gene die Identität einer Teilmenge von Herz- und Muskelzellen spezifizieren und dass diese Funktion aus der stark eingeschränkten resultiert, abstammungsspezifische mesodermale Expression von lb. Darüber hinaus ist eine genaue Analyse der lbe (Abb. 1) und lbl (Daten nicht gezeigt) Expressionsmuster zu Beginn der Herzfusion zeigten einen dreieckigen Cluster von lb-positiven Zellen, die sich nur anterior zur Herzspitze befanden (Abb. 1A, Pfeilspitze). Um eine genauere Beschreibung der Position dieser Zellen in Bezug auf die Herz-assoziierten Lymphdrüsen und Ringdrüsen zu erhalten, haben wir Embryonen für lb und spezifische Drüsenmarker doppelt markiert (Abb. 1 B und C). Die Lymphdrüsenvorläufer, die mit Anti-Serpent-Antikörper nachgewiesen wurden, flankieren beide Seiten der Herzspitze (Abb. 1B), jedoch nicht mit der mit lb bezeichneten Fläche überlappen. In ähnlicher Weise zeigt die Doppelfärbung der l(2)1857 Enhancer trap Line, die lacZ spezifisch in den embryonalen Primordien der Ringdrüse (15) exprimiert, dass lb-positive Zellen unmittelbar vor der Ringdrüse liegen (Abb. 1C).

Um den Ursprung von herz-assoziierten lb-positiven Zellen zu bestimmen, verfolgten wir die lb-Expression im vorderen Teil der Embryonen vom frühen Stadium an. In den embryonalen Stadien, die der Herzfusion vorausgehen, konnten wir keine lb-Expression nachweisen, die mit dem vorderen Teil zweier Herzprimordien assoziiert ist. Dieser Befund legt nahe, dass die lb-positiven Zellen ursprünglich nicht im Herzbereich spezifiziert sind und Zellen unterschiedlichen Ursprungs darstellen können, die in späteren Stadien mit den Herzzellen assoziiert werden. In der Tat, im späten Stadium 11, eine Gruppe von lb-positiven Zellen in der dorsalen Kopfepidermis (Abb. 2A) erkannt werden kann. Diese Zellen beginnen etwas später zu invaginieren und bilden den führenden Teil der Epidermis (Abb. 2B). Die Position und der Zeitpunkt dieser Invagination ähneln einer Faltung der Epidermis, wodurch der hintere Teil des Rückenbeutels entsteht, der als Frontalsack bezeichnet wird (20). Um zu überprüfen, ob lb-exprimierende Zellen der Spitze des Frontalsacks entsprechen, verwendeten wir die Escargot-lacZ-Linie N516, die lacZ in dorsalen beutelbildenden Zellen exprimiert (20). Doppelfärbungen der Stufe 14 (Fig. 2B) und Stufe 16 (Fig. 2C) N516-Embryonen mit Anti-Lbe- und Anti-β-Galactosidase-Antikörpern zeigen deutlich, dass lb und esg in der Spitze des invaginierenden Frontalsacks koexprimiert werden. Eine dorsale Ansicht der embryonalen Kopfregion (Abb. 2D) bestätigt, dass diese Zellen die gleiche dreieckige Anordnung aufweisen wie die zuvor gezeigten herz-assoziierten lb-positiven Zellen (vgl. 2D und 1).

Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die unmittelbar vor dem Herzen liegenden lb-exprimierenden Zellen aus der Kopfepidermis stammen und während der Frontalsackinvagination zur Herzspitze wandern. Diese Beobachtung wirft eine zusätzliche Frage bezüglich der Rolle von lb-Genen bei der Spezifikation dieser Zellgruppe auf. Wir haben bereits gezeigt, dass lb-Gene eine wichtige Rolle bei der Spezifikation einer Teilmenge von Herz- und Muskelvorläufern spielen (11, 19). Die funktionelle Analyse des Maus-Gens lb ortholog Lbx1 (21, 22) hat auch seine Bedeutung für die Kontrolle der Spezifikation und der gerichteten Migration von appendikulären Muskelvorläufern gezeigt. Darüber hinaus deuten die jüngsten Daten darauf hin, dass Lbx1 bei Mäusen eine Subpopulation von Herzneuralkammzellen spezifiziert, die für eine normale Herzentwicklung notwendig sind (23).

Um zu testen, ob Drosophila lb für die Spezifikation von Herz-assoziierten Zellen benötigt werden, haben wir die dorsale Beutelbildung bei Embryonen analysiert, denen beide lb-Gene fehlen (siehe Materialien und Methoden). Mit der esg-RNA-Sonde als Marker konnten wir zeigen, dass bei lbdef-Embryonen die esg-Expression im distalen Teil des Frontalsacks, der die herz-assoziierten Zellen trägt, fehlt (vgl. 2 E und G mit F und H). Wie die dorsolateralen Ansichten der Embryonen im Stadium 14 (Fig. 2 G und H) ist der Abstand zwischen dem Dottersack und den distal esg-positiven Zellen bei lb-defizienten Embryonen signifikant vergrößert. Dieser Befund, der durch die Beobachtung von Nomarski Optics gestützt wurde, die ergab, dass der hintere Teil des Frontalsacks eine veränderte Morphologie aufweist (Daten nicht gezeigt), deutete darauf hin, dass die HANCs in lbdef-Embryonen nicht spezifiziert sind oder nicht richtig migrieren. Da der analysierte Mangel auch benachbarte bap- und C15-Gene abdeckt, haben wir die Frontalsackbildung in bap-mutierten Embryonen und Arm-GAL4>UAS-RNAiC15-Embryonen getestet. Sowohl bei bap208- als auch bei RNAiC15-Embryonen hatte der esg-gefärbte Frontalsack eine normale Form (Daten nicht gezeigt), wodurch der Einfluss von bap- und C15-Genen auf die Differenzierung oder Migration von herzassoziierten Zellen ausgeschlossen wurde. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass das abnormale Muster der distalen esg-positiven Frontalsackzellen in lbdef-Embryonen aus dem Verlust der lb-Funktion resultiert.

Mesodermale und nichtmesodermale Komponenten, die an der Strukturierung der kardialen Abflussregion beteiligt sind. Unsere Immunfärbeexperimente zeigten, dass die herzverankernden lb-positiven Zellen sehr nahe an den lb-exprimierenden Kardioblasten liegen (Abb. 1). Da die meisten anterioren Kardioblasten tin (5) exprimieren, haben wir Embryonen mit Anti-Tin- und Anti-Lbe-Antikörpern doppelt markiert, um die jeweiligen Positionen der Herzspitze und des distalsten Teils des Frontalsacks sichtbar zu machen. Überraschenderweise überlappen sich diese beiden Strukturen von der dorsalen Seite aus betrachtet um etwa drei Zelllängen (Fig. 3A). Darüber hinaus ist die laterale konfokale Ansicht der vorderen Herzregion (Fig. 3B) zeigt deutlich, dass die Spitze des Frontalsacks, der aus nicht-mesodermalen lb-exprimierenden Zellen besteht, direkt am Herzen befestigt ist. Genauer gesagt beobachteten wir, dass sich der vordere Teil der Aorta (der teilweise die herzassoziierten lb-Zellen überlappt) ventral biegt und einen morphologisch unterschiedlichen Bereich bildet, der der Herzausflussregion entspricht. Diese Morphologie legt nahe, dass es eine zusätzliche zelluläre Komponente geben könnte, die die ventrale Biegung des Herzens begünstigt. Wir beschlossen, nach einem ventral gelegenen Muskel zu suchen, der an der Spitze der Aorta befestigt ist. Die Seitenansicht des Embryos, doppelt gefärbt für Myosin schwere Kette (Myo) und Lbe (Abb. 3C) zeigt deutlich, dass der Herzausfluss tatsächlich an einem Kopfmuskel befestigt ist, den wir als COM bezeichnen möchten. Eine genauere Analyse der konfokalen Schnitte ergab, dass das Herzprimordium tatsächlich durch zwei eng anliegende COMs verbunden ist, die sich von der Speiseröhre erstrecken und zu beiden Seiten der Herzausflussregion anhaften (offene Pfeilspitzen in Abb. DREIDIMENSIONAL). Überraschenderweise wurden diese embryonalen Kopfmuskeln bisher nach unserem Wissen nicht beschrieben. Das Fehlen einer veröffentlichten Dokumentation für COMs ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die Morphologie und der Ursprung der somatischen Kopfmuskeln im Drosophila-Embryo nicht systematisch analysiert wurden. Mit der einzigen verfügbaren Beschreibung der adulten Kopfmuskulatur von Miller (24) konnten wir keine adulten Kopfmuskeln identifizieren, die den hier vorgestellten embryonalen COMs entsprechen könnten.

Interessanterweise ergab die Myo/Lbe-Doppelfärbung auch, dass die nicht-mesodermalen HANCs an beide Herzzellen gebunden sind (Abb. 3E) und die COMs (Fig. DREIDIMENSIONAL). Da die HANCs lb exprimieren und selektiv mit dem vordersten lb-positiven Paar von Herzzellen assoziieren (Abb. 3E und 4D-F) spekulieren wir, dass die Herstellung dieses Kontakts Zellinteraktionen vom homophilen Typ beinhalten kann. Das Testen der Zelladhäsionsmoleküle, die an der interzellulären Signalübertragung zwischen homotypischen Zellen beteiligt sind (25, 26), wird dazu beitragen, Mechanismen zu definieren, die der Herstellung der Konnektivität zwischen den lb-exprimierenden HANCs und Herzzellen zugrunde liegen.

Um die räumliche Anordnung der Aortenspitze, der COMs und der lb-exprimierenden HANCs zu visualisieren, verwendeten wir eine computergestützte 3D-Analyse und Rekonstruktion konfokaler Scans. Dieser Ansatz bestätigte unsere Beobachtungen, die zeigten, dass die Herzausflussregion zusätzlich zu HANCs fest mit einem Paar COMs verbunden ist (Abb. 3F). Diese Muskeln überlappen die Herzspitze von beiden Seiten und tragen zu ihrer ventralen Biegung bei.

Um zu verstehen, wie der Kontakt zwischen Herz, COMs und HANCs während der Entwicklung hergestellt wird, überwachten wir diese Strukturen in frühen und späten Stadium 14 Embryonen (Abb. 3 G und H). Unsere Daten zeigen, dass sowohl die lb-positiven Herzzellen als auch die lb-exprimierenden HANCs verlängerte COMS anziehen.

Der Kontakt zwischen COMs und HANCs scheint der Befestigung von COM an der Spitze der Aorta etwas vorauszugehen und ist zu Beginn von Stadium 14 zu sehen (Abb. 3G). Zu diesem Zeitpunkt erstrecken sich COMS Fillopodien in Richtung lb-positiver Herzzellen (Abb. 3G) und werden im späten Stadium 14 zu Beginn der Herzfusion endgültig an diese Zellen gebunden (Fig. 3H). Da die COMs mit Herzzellen und HANCs in Kontakt kommen, bevor die HANCs am Herzen haften, spekulieren wir, dass COMs zusätzlich zum Biegen der Herzspitze den Kontakt mit HANCs erleichtern. Die Herstellung des Kontakts zwischen somatischen Muskeln und ihren epidermalen Bindungsstellen (Sehnenzellen) wurde ausführlich untersucht (27), was die Schlüsselrolle des Zinkfinger-Transkriptionsfaktorstreifens (28) und eines RNA-bindenden Proteinstreifens (29) aufdeckt. Wir haben diese beiden Marker verwendet, um zu testen, ob die HANCs und Herzzellen, an die die COMs anhaften, Eigenschaften von sehnenartigen Zellen aufweisen. Doppelmarkierungen an WT-Embryonen mit Anti-Lbe / Anti-Streifen und an Anti-lacZ-Embryonen mit Anti-Lbe / Anti-lacZ-Antikörpern zeigten, dass die HANCs und die COM-kontaktierenden Herzzellen keine Sehnenzellmarker exprimieren (Daten nicht gezeigt). Dieser Befund zeigt, dass lb-positive Zellen COMS anziehen, indem sie einen Mechanismus verwenden, der sich von dem unterscheidet, der von Sehnenzellen verwendet wird. Die interessantesten Kandidaten für die Führung der COMs sind der sekretierte Proteinspalt mit den multiplen Proteinbindungsmotiven und seine Rezeptoren Robo und Robo2 (30). Slit und Robo tauchten kürzlich als zentrale Komponenten auf, die Anziehungs- und Abstoßungsprozesse während der Morphogenese somatischer Muskeln steuern (31), was darauf hindeutet, dass sie auch an der sexuellen Anziehung beteiligt sein könnten.

Die vordersten lb-exprimierenden Herzzellen spielen eine zentrale Rolle bei der Strukturierung der kardialen Abflussregion. Die Beobachtung, dass sowohl COMs als auch HANCs sich entschieden, sich an die vordersten lb-positiven Herzzellen anzuheften, veranlasste uns zu testen, ob die Deregulation der lb-Expression im Herzen die Strukturierung der Herzausflussregion beeinflussen könnte. Um diesen Test durchzuführen, verwendeten wir das Gal4 / UAS-targeted Expression System (16). Zwei verschiedene GAL4-Effektorlinien, 24B-GAL4 und Tin-GAL4, wurden verwendet (Fig. 4 A und C). Die 24B-GAL4-Linie ermöglicht eine gezielte Expression in allen Herz- und Muskelzellen (Abb. 4A) mit gleichmäßiger und hoher Expression in den vordersten Herzzellen (Pfeil in Fig. 4A). Die Tin-GAL4 Linie (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von R. Bodmer) induziert die UAS-Transgenexpression selektiv in vier Kardioblasten in jedem Hemisegment (dazu gehören die lb-positiven Zellen), aber das Induktionsniveau in den vordersten Herzzellen ist niedriger (Pfeil in Abb. 4C) als die von 24B-GAL4 linie. Um die kardiale lb-Expression zu erweitern, wurden beide GAL4-Effektorlinien mit der UAS-lbe-Linie gekreuzt. Die ektopische lb-Herzexpression, die durch die Tin-GAL4-Linie gesteuert wurde, war schwächer als die endogene lb-Expression innerhalb des Herzens, und es wurden keine offensichtlichen Funktionsgewinn-induzierten Veränderungen in der Strukturierung der kardialen Abflussregion beobachtet (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu zeigten die 24B-GAL4>UAS-lbe-Embryonen eine deutliche Ausdehnung der lb-Expression innerhalb des Herzens (Abb. 4G), was zu einem abnormalen Kontakt des COMs mit der Herzspitze führt. Am genauesten fanden wir heraus, dass COMs direkt an die vordersten Herzzellen anhaften, die den Herzausfluss bilden (Sternchen in Abb. 4G) und nicht an das zweite Herzzellenpaar wie im WT (Fig. 4D). Die veränderte Verbindung von COMs resultiert höchstwahrscheinlich aus den ektopischen attraktiven Signalen, die durch die vergrößerte Herzexpression von lb erzeugt werden. Infolgedessen war die ventrale Biegung des vordersten Teils des Herzens ausgeprägter (vergleiche Abb. 4 D und G). Wir haben auch eine veränderte Morphologie von COMs bemerkt (offene Pfeilspitze in Abb. 4D und G), die aus der 24B-GAL4-gesteuerten ektopischen Muskelexpression von lb resultieren könnten. Der Kontakt zwischen HANCs und Herzzellen wurde durch die experimentellen Fehlexpressionsbedingungen nicht beeinflusst. Um zu testen, ob die kardiale lb-Expression für die Anziehung von COMs erforderlich ist, nutzten wir den zuvor beschriebenen negativen regulatorischen Einfluss von even-Skipped (eve), der in der Lage ist, lb in Herzzellen spezifisch zu unterdrücken (5). Wiederum wurden die 24B-GAL4- und die Tin-GAL4-Effektorlinien verwendet, um die Eve-Expression im Herzen zu steuern. Wir fanden heraus, dass diese beiden Treiber, die mit der UAS-eve-Linie (Tin-GAL4 mit geringerer Penetranz) gekreuzt wurden, zur Unterdrückung der lb-Aktivität im Herzen führten (Abb. 4 H und I). Trotz der Fehlspezifizierungsdefekte werden Herzprimordien normalerweise in UAS-eve gain of function Embryos gebildet (Ref. 5 und Fig. 4B), so dass wir COMs und HANCs in einem Kontext überwachen können, in dem die kardiale Expression von lb erschöpft ist. Unsere Daten zeigen, dass in solchen lb-abgereicherten Embryonen (siehe das Fehlen einer kardialen lb-Expression in Abb. 4 H und I) die COMs haften nicht an der Herzspitze. Wir beobachteten, dass sich COMs nach vorne ausdehnten und an invaginierenden HANCs befestigten (Abb. 4H und I), die die Herzspitze nicht mehr richtig verankern können. Der Haupt-COM-Zweig, der normalerweise an der Herzausflussregion anhaftet (vergleiche Abb. 4 E und F mit H und I) fehlte oder fusionierte mit dem HANC-befestigenden Ast. Daher glauben wir, dass die abnormale Form von COM und ein vollständiger Verlust seines Kontakts mit der Herzspitze durch Herzmuskelverarmung verursacht werden. Diese Annahme wird durch die Tatsache gestützt, dass die gleichen Phänotypen in Embryonen mit ektopischer kardialer (Tin-GAL4-driven) und kardialer plus muskulöser (24B-GAL4-driven) Expression von eve beobachtet wurden (vgl. 4 H und I). Der veränderte Kontakt und die Positionierung von COMs traten in Embryonen im späten Stadium 14 auf, wenn die schwere Myosin-Kette in Kardioblasten noch nicht nachweisbar ist (Abb. 4 E und H). Die Analyse von Embryonen im Stadium 15 ergab zudem, dass mit dem Verlust der kardialen lb-Expression eine Herunterregulation von β3-Tubulin einhergeht (vgl. 4F und I) in der kardialen Abflussregion, was darauf hinweist, dass die lb-Expression innerhalb des Herzens einen wichtigen Einfluss auf die endgültige kardiale Morphogenese hat. Diese Daten ergänzen die jüngsten Berichte, in denen die morphogenetischen Rollen eines COUP-TF-Rezeptorfamilienmitglieds, Seven–up, beschrieben werden, das im hinteren Kardioblastenpaar in jedem Segment exprimiert wird und für die Bildung von Ostia in den Abdomensegmenten A5-A7 erforderlich ist (32, 33). In diesem Zusammenhang eröffnet der Nachweis der Rolle von lb bei der Strukturierung der kardialen Abflussregion die Möglichkeit, dass lb in abdominalen Segmenten eine ähnliche Rolle bei der Herstellung eines Kontakts zwischen Herzzellen und den herzverankernden Alarmuskeln spielt. Diese Hypothese muss noch untersucht werden.

Darüber hinaus sind die vorgestellten Phänotypen (Abb. 4) deuten darauf hin, dass die im Herzen experimentell abgereicherte lb-Expression die Emission oder den Empfang attraktiver Signale durch Herzzellen beeinflusst und folglich zu einer Störung des Kontakts mit COMs führt. Der gleiche oder ähnliche Muskellockstoff wird wahrscheinlich von lb-positiven HANCs produziert oder aufgenommen, was darauf hindeutet, dass lb die Expression von Genen reguliert, die am Zell–Zell-Kontakt beteiligt sind. Interessanterweise wurde im Maus-lb-Homolog festgestellt, dass das Lbx1-Gen für die gerichtete Migration einer Teilmenge von Muskelvorläufern erforderlich ist (21, 22), was darauf hindeutet, dass die konservierten Zellbewegungsmechanismen existieren könnten, die von lb-Genen gesteuert werden.Zusammengenommen haben wir durch die Analyse von Embryonen, in denen die kardiale lb-Expression expandierte oder experimentell erschöpft war, gezeigt, dass die lb für die korrekte Anheftung von HANCs und COMs und folglich für die korrekte Strukturierung der kardialen Abflussregion erforderlich ist. Dieser Befund liefert Einblicke in die funktionelle Bedeutung der anterior-posterioren Diversifizierung von Herzvorläufern innerhalb jedes Segments des Drosophila-Herzens.

Kann HANCs einen Drosophila-Prototyp von Neuralleistenzellen darstellen? Die Morphogenese des Wirbeltierherzens umfasst zwei verschiedene Zelltypen, die mesodermalen Herzprimordien und eine Subpopulation von Neuralkammzellen, die aus der Kopfregion wandern. In diesem Artikel haben wir gezeigt, dass in Drosophila eine Gruppe von nicht-mesodermalen Zellen, die aus der Kopfepidermis stammen (die wir HANCs genannt haben), zur endgültigen Morphogenese des Herzens beiträgt. Wie bei Neuralkammzellen von Wirbeltieren unterliegen die HANCs gerichteten Bewegungen, treten in Kontakt mit Herzzellen und nehmen an der Strukturierung der Herzausflussregion teil. Wir haben gezeigt, dass die Homeobox-Gene, von denen bekannt ist, dass sie an der Diversifizierung von Herzvorläufern beteiligt sind (5, 11), in HANCs exprimiert werden und für ihre Spezifikation erforderlich sind. In ähnlicher Weise wurde kürzlich festgestellt, dass das Ortholog von lb, das Lbx1-Gen, für die Spezifikation einer Teilmenge von Herzneuralkammzellen in der Maus erforderlich ist (23), was darauf hinweist, dass lb / Lbx1-Gene eine konservierte Rolle bei der Spezifikation von nicht-mesodermalen Komponenten des Herzens spielen. In dieser Ansicht könnten die HANCs tatsächlich mit Neuralkammzellen von Wirbeltieren verglichen werden. Unsere Daten zeigen jedoch auch, dass die HANCs mindestens zwei Merkmale aufweisen, die nur für Drosophila spezifisch sind: (i) Sie bewegen sich als Teil des gefalteten Kopfektoderms und nicht als delaminierte Neuralkammzellen; und (ii) Sie bilden einen funktionellen Komplex mit COMs, die bei Wirbeltieren keine homologen Strukturen aufweisen. Daher sind weitere Analysen erforderlich, um die genaue Rolle von HANCs und ihre potenziellen neuralleistenzellähnlichen Funktionen aufzuklären.