Zusammenfassung

Spannungsgesteuerte Cav1.2-Calciumkanäle vom L-Typ koppeln die Membrandepolarisation mit einem vorübergehenden Anstieg der cytoplasmatischen freien Ca2 + -Konzentration, der eine Reihe essentieller zellulärer Funktionen auslöst, darunter Herz- und Gefäßmuskelkontraktion, Genexpression, neuronale Plastizität und Exozytose. Die Inaktivierung oder spontane Beendigung des Calciumstroms durch Cav1.2 ist ein kritischer Schritt bei der Regulierung dieser Prozesse. Die pathophysiologische Bedeutung dieses Prozesses manifestiert sich in Bluthochdruck, Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen und einer Reihe anderer Krankheiten, bei denen die Beschleunigung des Calciumstromzerfalls eine Nutzenfunktion darstellen sollte. Das zentrale Thema dieses Papiers ist die Inaktivierung des Cav1.2-Calciumkanals, die durch mehrere Determinanten vermittelt wird.

1. Einleitung

Der spannungsgesteuerte freie Ca2 + -Strom () ist ein üblicher Mechanismus für einen vorübergehenden Anstieg der zytoplasmatischen freien Ca2+ -Konzentration, der durch Zelldepolarisation ausgelöst wird. Diese Form der Ca2 + -Signalisierung aktiviert essentielle zelluläre Prozesse, einschließlich Herzkontraktion , Regulation eines glatten Muskeltonus , Genexpression, synaptische Plastizität und Exozytose . Die vollständige und schnelle Beendigung des Ca2 + -Zustroms wird durch einen komplizierten Mechanismus der spontanen Calciumkanalinaktivierung vermittelt, der entscheidend ist, um eine Ca2 + -Überlastung der Zelle während Aktionspotentialen zu verhindern und die zytoplasmatische freie Ca2 + -Konzentration im Ruhezustand unter µM wiederherzustellen . Dieses Papier konzentriert sich auf die molekularen Grundlagen und mehrere Determinanten der Cav1.2 Calciumkanal-Inaktivierung.

2. Cav1.2: Herausforderungen und Lösungen

2.1. Molekulare Komplexität

Der Cav1.2-Calciumkanal ist ein oligomerer Komplex, der aus den Untereinheiten a1C, α2δ und β besteht . Die Ionenkanalpore wird durch das A1C-Peptid (Abbildung 1) gebildet, das vom CACNA1C-Gen codiert wird. Die zusätzlichen β- und α2δ-Untereinheiten sind für die funktionelle Expression und das Plasmamembran-Targeting (PM) des Kanals essentiell . Sie existieren in mehreren genomischen Isoformen, die von vier CACNB–Genen (CACNB1–4) und drei CACNA2D-Genen (CACNA2D1-3) erzeugt werden. Alle drei Untereinheiten unterliegen einem alternativen Spleißen. Zusätzlich zur Komplexität der molekularen Organisation von Cav1.2 neigen β-Untereinheiten zur Oligomerisierung . Insgesamt erzeugen genomische Variabilität, alternatives Spleißen und Hetero-Oligomerisierung eine Fülle von Cav1.2-Spleißvarianten, die in Zellen in spezies-, gewebe- und entwicklungsabhängiger Weise exprimiert werden, während die Änderung ihres Feingleichgewichts signifikante pathophysiologische Konsequenzen haben kann .

Abbildung 1

Transmembrantopologie der α 1C-Untereinheit. Um die Stellen der molekularen Diversität zu veranschaulichen, ist die Polypeptidsequenz schematisch gemäß der CACNA1C-Genomkarte segmentiert und die entsprechenden invarianten (schwarz) und alternativen (blau) Exons sind durch schwarze Balken umrandet und nummeriert (1-50). Es wird angenommen, dass vier Homologieregionen (I–IV), die jeweils aus 6 Transmembransegmenten (nummeriert) bestehen, um die zentrale Pore gefaltet sind. die α-Interaktionsdomäne (AID) einer konstitutiven β-Bindungsstelle ist grün dargestellt. LA- und IQ-Motive (rot) bilden die Calmodulin-bindende Domäne (CBD).

2.2. Herausforderungen bei der Auswahl der Wirtszelle

Die natürlich vorkommende Diversität von Cav1.2 erschwert die Interpretation von Daten aus nativen Zellen, ganz zu schweigen von den Einzelkanaldaten. Dies liegt der Bedeutung der Cav1.2-Forschung in rekombinanten Expressionssystemen zugrunde, in denen die molekulare Zusammensetzung des Kanals und die Struktur seiner Bestandteile vordefiniert sind. Dieser experimentelle Ansatz stieß jedoch auf das Hauptproblem der Auswahl einer geeigneten Wirtszelle.

Die meisten Studien zu Calciumkanälen wurden mit HEK293-Zellen durchgeführt. Diese Zellen bieten eine hohe Expressionseffizienz rekombinanter Ca2 + -kanäle, enthalten jedoch leider endogene Calciumkanäle, die Ca2 + -Ströme von bis zu 3 pA / pF aufweisen . Somit ermöglichen HEK293-Zellen die adäquate Untersuchung rekombinanter Ca2 + -Kanäle nur dann, wenn die Amplitude des Stroms groß genug ist, um den Beitrag der endogenen Kanäle zu ignorieren. Eine korrekte Beurteilung der funktionellen Determinanten von Ca2+ -Kanälen erfordert jedoch die Verwendung von Wirtszellen, die völlig frei von endogenen Ca2+ -Kanal-Untereinheiten sind. COS1- oder COS7-Zellen passen gut zu dieser Anforderung, da sie keinen nennenswerten Calciumstrom erzeugen, keine endogenen Ca2 + -Kanaluntereinheiten oder deren Vorläufer enthalten und keine Induktion endogener Cav1.2-Untereinheiten als Reaktion auf die Expression der rekombinanten zeigen. Kinetikparameter und Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und Inaktivierung der Cav1.2-Kanalströme, die in COS1-Zellen gemessen wurden, stimmen mit Daten überein, die in anderen Expressionssystemen erhalten wurden . Ein wichtiger Vorteil von COS-Zellen ist ihre relativ langsame Teilungsrate, die eine bessere Kontrolle über die Effizienz der Expression und Montage der Cav1.2-Kanal-Untereinheiten unterschiedlicher Größe ermöglicht.

2.3. Probleme der Fluoreszenzmarkierung und Messung

Die Fusion von GFP-ähnlichen Fluorophoren mit den N- und / oder C-Termini des rekombinanten a1C oder mit dem N-Terminus von β verändert die elektrophysiologischen Eigenschaften der exprimierten Kanäle nicht merklich und ermöglicht die Anwendung der Fluoreszenz- und FRET-Mikroskopie (Fluorescent Resonance Energy Transfer) zur Untersuchung der subzellulären Verteilung und des Zusammenbaus von Cav1.2 sowie komplizierter Aspekte der molekularen Architektur und Dynamik des Kanals. Der Kanal behält die wichtigsten elektrophysiologischen Eigenschaften unverändert bei, wenn die a1C C-terminale Sequenz, die von distalen Exons 46-50 codiert wird (Abbildung 1, Reste 1833-2138 in a1C, 77), durch ECFP ersetzt wird. a1C, das durch seine N- oder / und C-Termini an EYFP fusioniert wird, ist jedoch sehr empfindlich gegenüber Photobleichung, die es irreversibel inaktiviert. Diese interessante Eigenschaft, die als fluorophorunterstützte Lichtinaktivierung (FALI) bekannt ist, begrenzt die Anwendbarkeit des Akzeptorph-Photobleichens für die Messungen von FRET in Cav1.2 aufgrund der Unsicherheit im Funktionszustand des Kanals . Die ratiometrische Analyse des korrigierten FRETS zwischen den Fluorophoren, die an die Schwänze der A1C- und / oder β-Untereinheiten fusioniert sind, spiegelt jedoch die reversiblen zustandsabhängigen strukturellen Umlagerungen des Kanals wider, die durch die Änderungen der Transmembranspannung unter Patch-Clamp induziert werden .

2.4. Rekombinantes Cav1.2: Was braucht es für die funktionelle Expression und wie erscheint es?

Typische Eigenschaften einer „Wildtyp“-rekombinanten Cav1.2 sind in Abbildung 2(A) am Beispiel der ubiquitären humanen A1C,77-Isoform (GenBank-Nr. z34815). Wenn das EYFP-markierte a1C allein in COS1-Zellen exprimiert wurde, war das fluoreszenzmarkierte Kanalprotein diffus über das Zytoplasma verteilt und erzeugte keinen messbaren Calciumstrom (Abbildung 2 (A), Tafel a). Die quantitative Analyse der Verteilung von a1C zwischen PM und dem Zytoplasma (Abbildung 2 (B)) bestätigte das Fehlen eines signifikanten PM-Targetings durch a1C unabhängig von der Anwesenheit von α2δ (Balken a und b). Die Expression von Cavß in Abwesenheit von α2δ stimulierte das PM-Targeting von a1C, aber der Kanal blieb stumm (Abbildung 2 (A), Panel c), es sei denn, α2δ wurde coexprimiert (Panel d). Somit sind β- und α2δ-Untereinheiten für den Funktionskanal ausreichend; Unter diesen experimentellen Bedingungen stimulieren β-Untereinheiten das PM-Targeting des Kanalkomplexes und erleichtern in Gegenwart von α2δ das Spannungsgating des Cav1.2-Kanals.

Abbildung 2

Rolle der Cav1.2-Hilfsuntereinheiten. (A) Epifluoreszenzbilder der exprimierenden COS1-Zellen, die die Verteilung von EYFPN-α 1C zeigen, erhalten mit dem YFP-Filter (Skalierungsbalken, 4 µm) und Spuren des maximalen Calciumstroms, aufgezeichnet in Reaktion auf 600 ms-Schritte bis +30 mV vom Haltepotential mV (links). (B) Relative Verteilung von EYFPN-α 1C in der Plasmamembran (PM) über das Zytoplasma in Abwesenheit (a) oder Anwesenheit von α 2δ (b), β 2d (c) oder α 2δ + β 2d (d). Das Verhältnis der Fluoreszenzintensität in PM über die Fläche unter PM wurde nach Hintergrundsubtraktion in jeder Zelle gemittelt. Das Verhältnis kleiner als 1.0 zeigt das Fehlen eines signifikanten PM-Targetings durch α 1C an. * .

Die Form und das Aussehen des Peak-Calcium-Stroms in Abbildung 2(A) (Panel d) ist ziemlich typisch für die β2-modulierte Cav1.2 . Zu seinen Hauptmerkmalen gehören die relativ langsame Zerfallsrate und ein großer Teil der Energie, die am Ende des Depolarisierungsimpulses verbleibt . Es ist klar, dass solche Eigenschaften bei lang anhaltenden Aktionspotentialen zu einer pathogenen Calciumüberladung der Zelle führen können, wenn sie nicht durch robuste Kompensationsmechanismen ausgeglichen wird. Es war die ultimative Rolle von Cav1.2 bei der Definition der Dauer des Aktionspotentials in Herzzellen, das die Forschung und Entwicklung von Kalziumkanalblockern auslöste, einer Medikamentenklasse, die inzwischen einen Milliardenmarkt hat. Es ist diese Rolle von Cav1.2, die das aktuelle Interesse an der Identifizierung molekularer Determinanten der Cav1.2-Inaktivierung anregt, in der Hoffnung, spezifischere und wirksamere Medikamente zu finden.

2.5. Last but Not Least eine Komplikation: Cav1.2-Clustering

Ein einzelner ventrikulärer Myozyt enthält ~ 300.000 Cav1.2-Kanäle, aber nur ~ 3% der Kanäle sind zu Spitzenzeiten offen . Entgegen der landläufigen Meinung sind Cav1.2-Kanäle nicht gleichmäßig über die Plasmamembran verteilt. In nativen neuronalen und Herzmuskelzellen bilden sie große Cluster. Die Einzelmolekülbildgebung der funktionellen rekombinanten EYFPN-a1C / ß2a / α2δ-Kanäle, die in HEK293-Zellen exprimiert wurden, ergab Cluster aus ~ 40 Kanälen, die in der Plasmamembran mobil waren . Sowohl die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie als auch die Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleaching-Experimenten ergaben eine laterale Diffusionskonstante von µm2 / s. Die funktionelle Bedeutung der Mobilität der Cav1.2-Cluster ist nicht klar. Es wird angenommen, dass in Herzmuskelzellen eine solche Mobilität durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, beispielsweise Ryanodinrezeptoren, eingeschränkt werden kann . Die Größe von Cav1.2-Clustern und ihre spezifische Dichte in der Plasmamembran hängen von der Art der exprimierten β-Untereinheit ab . Der Abstand zwischen den Termini benachbarter a1C-Untereinheiten variiert von 67 Å mit neuronalem / kardialem ß1b bis 79 Å mit vaskulärem β3. Die höchste Dichte von Cav1.2-Clustern in der Plasmamembran und die kleinste Clustergröße wurden bei Anwesenheit von ß1b beobachtet. Einblicke in molekulare Mechanismen, die die Architektur und Eigenschaften von Cav1.2-Clustern definieren, sind wichtig für ein besseres Verständnis der Pathophysiologie der Kopplung zwischen der Cav1.2-Aktivität und den induzierten Reaktionen bei der Ca2+ -Signaltransduktion.

3. Spannungs- und Ca2+-abhängige Inaktivierung des Cav1.2-Calciumkanals

Bei Cav1.2-Calciumkanälen steuern zwei verschiedene Mechanismen die Ca2+-Strominaktivierung. Ein Mechanismus wird durch Ca2 + -Ionen auf der zytoplasmatischen Seite der Plasmamembran angetrieben, während der andere von der Transmembranspannung abhängt. Experimentell eliminiert der Ersatz von Ca2 + für Ba2 + als Ladungsträger die Ca2 + -abhängige Inaktivierung (CDI), so dass die Ba2 + -leitenden Calciumkanäle spannungsabhängig durch schnelle (FI) und langsame (SI) Mechanismen inaktivieren. Diese drei Mechanismen der Inaktivierung, FI, SI und CDI, und ihre wichtigsten Determinanten sind in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 3

Molekulare Determinanten der Cav1.2-Inaktivierung. Vergleich des Wildtyps Cav1.2 (A) mit dem gleichen Kanal beraubt von CDI (B) und SI (C) Determinanten. Die fünf horizontalen Tafeln zeigen (a) die Anordnung kritischer Determinanten der Inaktivierung. ADSI besteht aus konservierten hydrophoben Aminosäuren in einer -2-Position von S6-Segmenten in den Wiederholungen II, III und IV (gelbe Kreise: Ala, Val und Ile bzw.) sowie Ser-Rückstand in -1-Position von IS6 (Cyan-Kreis). Die CaM-Bindungsdomäne (CBD) des α 1C-C-Schwanzes ist durch ein rotes abgerundetes Rechteck dargestellt. Eine β-Untereinheit (grün) bindet an die α-Interaktionsdomäne im Linker zwischen den Wiederholungen I und II und Ca2+-abhängig an die IQ-Region der α 1C-Untereinheit C-Tail (nicht gezeigt). Die distale Struktur von β 2 (β 2CED, blaue Kugel) bindet an das CBD . b) Nachweis der Koimmunpräzipitation der angegebenen Untereinheiten. (c) Normalisierte Spuren von (schwarz) und (rot) und (d) Spannungsabhängigkeit von (rot) und Zeitkonstante von FI (, schwarz) werden dargestellt, um CDI in (A) und Mangel an CDI in (B) und (C) zu veranschaulichen. e) Zusammenhang zwischen CDI und differentieller β-Untereinheitenmodulation (DßM) von Cav1.2. (A) Differentielle Modulation der Inaktivierung durch β 1a (schwarze Spur) und β 2a (grüne Spur) im WT Cav1.2. Die Störung von CBD (α 1C,86) eliminiert CDI und SI, auf die CDI und DßM (B) abzielen. Die Mutation von ADSI (α 1C, IS-IV) entfernte CDI und hemmte SI vollständig, so dass der Kanal für die Dauer des Depolarisationsstimulus (C) leitend bleibt.

3.1. Ca2 + -abhängige Inaktivierung und Calmodulin-Bindungsdomäne von a1C

Es gibt verschiedene Determinanten von CDI, aber erst 1997 wurde die Ca2 + -Sensorstelle von CDI auf eine Strecke der 80-Aminosäure-C-Terminalsequenz von A1C eingegrenzt, die von den Exons 40-42 codiert wurde (Abbildung 2), markiert durch roten Block in Abbildung 3 (A) (Tafel a). Eine natürlich vorkommende Spleißvariation in diesem Bereich in a1C,86 (Abbildung 3 (B)) hemmte CDI vollständig, wie aus der fehlenden Verzögerung des Stroms mit Ba2 + als Ladungsträger (Tafel c, schwarze Spur) im Vergleich zu (rote Spur) ersichtlich ist. Ein weiteres charakteristisches Merkmal des inhibierten CDI war das Fehlen der aktuellen Größenabhängigkeit von Spannung (Abbildung 3 (B), Panel d, offene Symbole), die im Gegensatz zur U-förmigen Abhängigkeit der Zeitkonstante der schnellen Inaktivierung () vom Membranpotential im Wildtyp-Cav1.2 (siehe Abbildung 3 (A), Panel d). Zwei verschiedene Sequenzen, L und K, wurden innerhalb dieser 80-Aminosäure-Strecke identifiziert, deren a1C,86-ähnliche Mutationen im Wildtyp a1C den gleichen charakteristischen Merkmalen entsprechen , was auf die Existenz von zwei benachbarten CDI-Sensoren hindeutet. Eines davon wurde in der K-Region als Calmodulin- (CaM-) bindendes IQ-Motiv skizziert und später wurde die Verknüpfung des IQ-Motivs mit CDI als funktionelle Ca2+-CaM-Bindungsstelle in drei unabhängigen Studien durch die Verwendung von CaM-Mutanten ohne Affinität zu Ca2 + bestätigt. Entsprechend wurde das LA-Motiv durch den Ruhezustand des Kanals mit CDI als apo-CaM-Bindungsstelle verknüpft. Ein einzelnes CaM-Molekül, das an diese Ca2 + -abhängige CaM-Bindungsdomäne (CBD) von A1C gebunden ist, ist der Haupt-Ca2 + -Sensor des Kanals .

Die Spleißvariation von a1C im Bereich von a1C,86 hemmt nicht nur CDI vollständig, sondern entfernt auch SI (Abbildung 3 (B), Tafel c) und beraubt den Kanal der differentiellen Empfindlichkeit gegenüber β-Untereinheitsmodulation (Abbildung 3 (B), Tafel e) trotz der Tatsache, dass β mit A1C,86 assoziiert bleibt (Abbildung 3 (B), Tafel b). Dies zeigt an, dass alle drei Eigenschaften des Kanals — CDI-, SI— und β-Untereinheitsmodulation – miteinander verknüpft sind .

3.2. Langsame Inaktivierung

Es wurde eine Reihe von Beweisen vorgelegt, dass Aminosäuren, die auf den distalen Teil von S6-Segmenten in A1C beschränkt sind, eine wichtige Rolle bei SI spielen . Eine systematische Untersuchung dieser Region skizzierte die „jährliche Determinante der langsamen Inaktivierung“ (ADSI) als eine Struktur, die aus vier hochkonservierten Aminosäuren von vier Transmembransegmenten S6 besteht und das zytoplasmatische Ende der Pore bildet (Abbildung 3 (A), Tafel a). Ihre gleichzeitige Mutation (S405I in IS6, A752T in IIS6, V1165T in IIIS6 und I1475T in IVS6) erzeugt den a1C, IS-IV-Kanal. Die Analyse der aktuellen Kinetik des a1C,IS-IV-Kanals zeigte eine enorme Beschleunigung der schnell inaktivierenden Komponente (≤ 10 ms), die etwa 50% der gesamten (oder) Amplitude ausmacht. Langsame spannungsabhängige Inaktivierung von a1C,IS-IV wird vollständig inhibiert und der Kanal bleibt für die Dauer der Depolarisation leitend. Der Ersatz von Ca2+ für Ba2+ als Ladungsträger (Panel c) änderte dieses Inaktivierungsmuster nicht signifikant, während die Analyse der Spannungsabhängigkeit von für die inaktivierende Komponente von durch den a1C,IS-IV-Kanal (Panel d) bestätigte Mangel an CDI. Der Ersatz von ß1a durch ß2a (Panel e) änderte nichts an der Inaktivierung des A1C-, IS-IV-Kanalstroms, was auf einen Mangel an differentieller β-Untereinheitsmodulation hindeutet, während die Co-Immunpräzipitationsanalyse (Panel b) lieferte direkte Hinweise auf eine Assoziation zwischen a1C, IS-IV und β.

Zusammengenommen deuten die in Abbildung 3 dargestellten Ergebnisse darauf hin, dass es ein Übersprechen zwischen ADSI, CBD und β gibt, unterstützt durch direkte Wechselwirkungen zwischen ihnen und / oder spezifische Konformationsfaltung der Bestandteile des Polypeptidbündels, das der Pore zugrunde liegt. Tatsächlich wurden sowohl die Wechselwirkung von β mit CBD als auch die Bedeutung der funktionellen Konformation direkt in lebenden Zellen nachgewiesen, die rekombinantes Cav1.2 exprimieren.

3.3. Rolle der A1C-C-Schwanzfaltung

Quantitative spannungsabhängige FRET-Mikroskopie in Kombination mit Patch-Clamp in der lebenden Zelle zeigte, dass der a1C-Untereinheit-C-Terminal-Schwanz reversiblen spannungsgesteuerten Konformationsumlagerungen unterliegt . Die Verankerung des a1C-C-Schwanzes am inneren Faltblatt der Plasmamembran über die Pleckstrin-Homologie (PH) -Domäne, die mit dem C-Terminus von A1C (a1C-) fusioniert ist, hob diese Konformationsumlagerung auf und inhibierte sowohl SI als auch CDI (Abbildung 4 (A)) auf eine Weise, die der bei A1C, IS-IV, beobachteten sehr ähnlich ist (Abbildung 3 (C)). Diese Modifikation, die die Beweglichkeit des A1C-Carboxylterminus einschränkt, hatte eine große Auswirkung auf die Ca2 + -Signaltransduktion. Die mit der Aktivität von Cav1.2 verbundene CREB-abhängige Transkriptionsaktivierung wurde trotz der durch den „C-verankerten“ Kanal als Reaktion auf die Depolarisation erzeugten Signale vollständig unterdrückt. Die Freisetzung des a1C-C-Schwanzes durch Aktivierung der PIP2-Hydrolyse bei Aktivierung der Phospholipase C stellt alle diese Mangelfunktionen, einschließlich SI, CDI, und die effektive Kopplung von an die CREB-abhängige Transkription vollständig wieder her. Somit ist eine spezifische funktionelle Faltung des a1C C-terminalen Schwanzes entscheidend für die Inaktivierung. Es ist entscheidend für die Signaltransduktion, da es das permeierende Ca2 + in Zellen, die an CBD gebunden sind, käfigt und dieses Ca2 + effektiv zu nachgeschalteten Signalzielen bewegt, die mit CREB-abhängiger Transkription oder Herzmuskelkontraktion verbunden sind . Diese Funktion tritt vor allem in enger Abstimmung mit extrazellulären Stimuli auf, die den Kanal aktivieren. In Bezug auf die Signaltransduktion ist SI eine Verriegelung an der Innenseite des Kanals, die durch das durchdringende Ca2 + gelöst wird, um seinen Verschluss zu beschleunigen und die Bewegung des C-terminalen Schwanzes einzuleiten .

Abbildung 4

Differentielle Rolle der Carboxyl- und aminoterminalen Schwänze von α 1C bei der Cav1.2-Inaktivierung. Gezeigt sind (a) Epifluoreszenzbilder, die das Plasmamembran-Targeting des EYFP-markierten α 1C veranschaulichen (Skalierungsbalken, 4 µm) und (b) überlagerte Spuren des Maximums (schwarz) und (rot) skaliert auf die gleiche Amplitude für α 1C- / β 1a / α 2δ, (A) PHN-α 1C / α 2δ (B) und ΔN-α 1C / α 2δ (C).

3.4. Rolle des a1C N-Terminus

Alle oben genannten Funktionen hängen auch von der Integrität des a1C N-Terminus ab. Inaktivierungseigenschaften des rekombinanten a1c / β /α2δ-Kanals werden durch strukturelle Veränderungen des proximalen Teils des a1C-N-Schwanzes nicht stark verändert, beispielsweise durch die Fusion eines fluoreszierenden Proteins, durch PH-Domäne oder durch alternatives Spleißen von Exons 1 / 1A, die die lange Isoform von A1C erzeugen. Die allererste funktionelle Analyse der Wirkung der partiellen Deletion des a1C-N-Terminus zeigte, dass er an der Inaktivierung beteiligt ist, während β die Hemmung des Kanals durch den N-Schwanz verhindert. Mit Hilfe der FRET-Mikroskopie in Kombination mit Patch-Clamp fanden wir, dass die Inaktivierung eine starke gegenseitige Neuorientierung der a1C- und ß1a-NH2-Termini bewirkt, ihr Abstand vis-à-vis zur Plasmamembran jedoch nicht nennenswert verändert wird . Dieser relative Mangel an Mobilität wird durch β in einer Weise verliehen, die die Kanalantwort auf Spannungs-Gating erleichtert. Versuche zur Entkopplung der a1C-Untereinheit N-terminal tail von der Regulierung des Kanals wurden in Abwesenheit von β durchgeführt. Die Verankerung des a1C-N-Schwanzes im inneren Faltblatt der Plasmamembran über die angehängte PH-Domäne schuf Bedingungen, unter denen PHN-a1C und α2δ ausreichten, um einen robusten Einwärtsstrom zu erzeugen (Abbildung 4 (B)). Dieser Kanal ist jedoch von CDI und jeglicher spannungsabhängiger Inaktivierung befreit. In der Tat hat weder der Ba2 + – noch der Ca2 + -Strom einen nennenswerten Zerfall gezeigt (siehe überlappende Spuren). Die Freisetzung des a1C-N-Schwanzes bei der PIP2-Hydrolyse durch Aktivierung der Phospholipase C hemmte den β-defizienten Kanal vollständig. Ähnliche Eigenschaften, außer einer viel langsameren Aktivierung des Stroms, wurden bei Deletion des gesamten (aber 4 Aminosäuren) N-terminalen Schwanzes von A1C beobachtet (Abbildung 4 (C)). Bei beiden Arten der Entkopplung des a1C-N-terminalen Schwanzes — sei es durch eine Deletion oder durch PM-Verankerung – scheint eine Verzögerung der Aktivierung des Ganzzellstroms mit einer Verlängerung der ersten Latenz verbunden zu sein. Einzelkanalaufnahmen zeigten, dass die Deletion des N-Schwanzes im Wesentlichen den offenen Zustand des ΔN-a1c / α2δ-Kanals stabilisierte, der längere Öffnungen während einer lang anhaltenden Depolarisation zeigte.

Somit wird CDI durch die Determinanten des a1C-C-Schwanzes, durch die ADSI in der cytoplasmatischen Porenregion und durch die Faltung der a1C-C- und N-Termini vermittelt. Calmodulin integriert diese Determinanten und stellt einen Ca2 + -abhängigen Schalter bereit, der die langsame Inaktivierung beendet, den a1C-C-Schwanz freisetzt und das zugehörige Ca2 + / Calmodulin, das als aktivierender Stimulus der Ca2 + -Signaltransduktion wirkt, pendelt .

3.5. Expression und Inaktivierung von Cav1.2 in Abwesenheit von β und α2δ

Sind die β- und α2δ-Untereinheiten essentiell für die funktionelle Expression des Cav1.2-Kanals? Die Analyse der Auswirkungen von exogenem CaM (CaMex) auf die Expression und Eigenschaften von Cav1.2 in Abwesenheit von β oder α2δ hat eindeutig gezeigt, dass weder β noch α2δ essentiell sind. Die Überexpression von CaMex verändert das Spannungsgating des a1C / ß2d / α2δ-Kanals nur geringfügig, indem die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und Inaktivierung in Richtung negativerer Potentiale verschoben wird, was die Inaktivierung erleichtert (aber nicht beschleunigt) und die Dichte von ungefähr erhöht 2-fach . CDI bleibt erhalten, wie aus dem Effekt des Ersatzes von Ca2+ für Ba2+ als Ladungsträger hervorgeht, der den zeitlichen Verlauf der Inaktivierung des Stroms signifikant erhöhte (Abbildung 5(A)). Neues Verständnis der Rollen von β und α2δ kommt mit dem Befund, dass CaMex die Expression und Aktivität des A1C-Kanals in Abwesenheit von β (Abbildung 5 (B)) oder α2δ (Abbildung 5 (C)), aber nicht beide dieser Hilfsuntereinheiten. Obwohl CaMex strukturell nicht mit β und α2δ verwandt ist, unterstützt es Trafficking, CDI und Channel Gating. Die quantitative Analyse zeigte, dass CaMex die Umverteilung von A1C in PM über das Zytoplasma nicht stimulierte, aber das Plasmamembran-Targeting von a1C / α2δ-Kanälen signifikant verbesserte. Andererseits verbesserte CaMex die relative Verteilung der a1c / ß2d- und a1C / ß2d / α2δ-Kanäle in der Plasmamembran über das Zytoplasma nicht. Somit wird abhängig von der vorhandenen Hilfsuntereinheit die CaMex-unterstützte Kanalaktivität von a1C /ß2d und a1C / α2δ durch verschiedene Mechanismen gesteuert. Trotzdem weisen die CaMex-erleichterten Einzel-Hilfs-Untereinheitskanäle recht ähnliche Eigenschaften auf, einschließlich einer signifikant langsameren Inaktivierungskinetik des Calciumstroms und einer starken Verschiebung der Spannungsabhängigkeit von Aktivierung und Inaktivierung in Richtung negativerer Potentiale. Ähnlich wie die herkömmlichen a1c / ß2d / α2δ-Kanäle behalten diese Kanäle CDI und eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Dihydropyridin-Calciumkanalblockern bei . Allerdings zeigt nur der a1C/β/CaMex-Kanal eine Erleichterung des Calciumstroms durch starken Depolarisationsvorpuls (Daten nicht dargestellt).

Abbildung 5

Aktivität von Cav1.2 ausgedrückt in Abwesenheit von β- oder α 2δ-Untereinheiten. Gezeigt sind (a) Epifluoreszenzbilder, die die vorherrschende PM-Lokalisierung von EYFPN-α 1C (Skalierungsbalken, 4 µm) in COS1-Zellen veranschaulichen, und (b) überlagerte Spuren des Maximums (schwarz) und (rot) skaliert auf die gleiche Amplitude für α 1C / β 2d / α 2δ / CaMex (A), β-freier α 1C / α 2δ / CaMex (B) und α 2δ-freier α 1C / β 2d / CaMex-Kanal (C).

Da CaM in Verbindung mit CBD an CDI beteiligt ist, ist es klar, dass die Wirkung von CaMex durch verschiedene CaM-Bindungsstellen vermittelt wird. Einer der potenziellen Kandidaten für eine solche Stelle befindet sich im distalen Teil des N-terminalen A1C-Schwanzes . Es bleibt abzuwarten, ob diese Stelle tatsächlich eine integrierende Rolle im regulatorischen Bündel mehrerer molekularer Determinanten spielt, die die Cav1.2-Inaktivierung unterstützen. Eine andere Möglichkeit beschränkt die Rolle von CaMex auf die Aktivierung von Silent Cav1.2 innerhalb der großen Cluster, wo eine begrenzte lokale Verfügbarkeit von CaM der Grund für die in Abschnitt 2.5 beschriebene geringe fraktionierte Aktivität sein kann. Was auch immer die Mechanismen sind, die mit der Regulierung von Cav1.2 durch CaM verbunden sind, sie scheinen zu diesem Zeitpunkt wenig praktische Bedeutung für die Verwendung in der Medizin zu haben, genau weil CaM ein allgegenwärtiges und multifunktionales Peptid ist, das viele andere zelluläre Funktionen reguliert, während seine Anwesenheit in Cav1.2 für CDI lebenswichtig ist.

4. β-Untereinheit Modulation von Cav1.2

Die bemerkenswerte molekulare Variabilität der β-Untereinheiten, die sich in veränderten Inaktivierungseigenschaften des differentiell modulierten Cav1.2 widerspiegelt, wie in Abbildung 3(A) (Panel e) veranschaulicht, bietet eine neue Chance für die Entwicklung innovativer Ansätze zur Behandlung der mit Ca2 + -Misshandlung verbundenen Krankheiten. Mehrere neuere Beobachtungen liefern eine Grundlage für eine solche optimistische Sichtweise. Erstens zeigen β-Untereinheiten eine Tendenz zur Bildung von Homo- und Heterooligomeren, die durch eine Vielzahl biochemischer Techniken sowohl in nativen Zellen als auch in rekombinanten Expressionssystemen direkt nachgewiesen wurde. Während eine Verstärkung der β-Homooligomerisierung die Dichte von signifikant erhöht, kann die Hetero-Oligomerisierung von β2-Spleißvarianten mit anderen β-Untereinheiten auch die Spannungsabhängigkeit und Inaktivierungskinetik von Cav1.2 verändern. Die β-Oligomerisierung wird durch mehrere molekulare Determinanten vermittelt und benötigt daher mehrere Eingriffe, um beispielsweise im Falle einer pathogenen Überexpression von β2 verwaltet zu werden. Es scheint jedoch machbarer zu sein, β2 selbst anzuvisieren; Die molekulare Determinante der β2-spezifischen langsamen und unvollständigen Inaktivierung (siehe Abbildung 2 (A), Panel d) wurde als die 40-Aminosäure-C-terminale Determinante (ß2CED) identifiziert, die in allen 7 bekannten natürlich vorkommenden β2-Spleißvarianten vorhanden ist. Die Entkopplung seiner Ca2 + – und CaM-unabhängigen Wechselwirkung mit CBD (Abbildung 3 (A), Panel a) stellt die Inaktivierungseigenschaften wieder her, die für ß1b / β3-moduliertes Cav1.2 charakteristisch sind, das eine schnelle und vollständige Inaktivierung von aufweist, wie es in Deletionsexperimenten gezeigt wurde. Aus meiner Sicht ist eine solche selektive Entkopplung von ß2 + von der Bindung an seinen Rezeptor in CBD eine neue attraktive Strategie zur Bewältigung der Ca2 + -Überlastung, da andere β-Untereinheiten nicht betroffen sein sollen. Darüber hinaus wird ein Übersprechen zwischen Cav1.2 und dem nächsten Ziel Ca2 + / CaM-abhängige Proteinkinase II wird erhalten bleiben.

5. Schlussfolgerungen

Diese Arbeit hat gezeigt, dass wir wissen, wie man die Inaktivierung von Cav1.2 auf weniger als 10 ms beschleunigt (Abbildung 3(C)), es vollständig der Inaktivierung entzieht (Abbildungen 4(B) und 4(C)) oder die Abhängigkeit seiner Expression von β oder α2δ ohne signifikante Konsequenzen für die Inaktivierung beseitigt. Wir skizzierten die ultimative Rolle der A1C Termini und CaM für die Inaktivierung, und doch keine dieser Studien haben uns näher an das ultimative Ziel der Verwaltung von Kalzium Misshandlung im Zusammenhang mit Cav1 gebracht.2 außer alten und leider nicht zu selektiven Kalziumkanalblockern. Das einzige neue mögliche Ziel ist die pathogene β2-Modulation von Cav1.2, bei der eine Effektor-Rezeptor-Interaktion hergestellt wird.

In Bezug auf die Molekularbiologie gehört Cav1.2 sicherlich zu den kompliziertesten bekannten Regulationssystemen. Bemerkenswerte molekulare Vielfalt jedes der Cav1.2) führt zu mehreren genetischen / Spleißvarianten des Kanals, die einer Segregation in große und vielfältige Cluster und einer kontinuierlichen funktionellen Veränderung durch Homo- und Heterooligomerisierung von β und anderen Signalkomponenten unterliegen, ganz zu schweigen von Spezies, Gewebe und Entwicklungsvariabilität. Wir sind überrascht von der Redundanz der Eigenschaften mehrerer Cav1.2-Isoformen und noch mehr überrascht, wenn sich herausstellt, dass einige von ihnen, die nur „konventionelle“ elektrophysiologische Eigenschaften aufweisen, mit einer Krankheit assoziiert sind . Bei der Suche nach einer Erklärung sollte sich unsere Einsicht nicht intuitiv nur auf die Eigenschaften der Calciumstrom-Spannungsabhängigkeit, Amplitude und Dauer konzentrieren. Die Endreaktion, wie die räumliche und zeitliche Organisation von CREB-Signalereignissen, die mit einer spezifischen Cav1.2-Isoform assoziiert sind , und ihre Konkurrenz mit anderen (z. B. cAMP-abhängigen) Signalmechanismen oder anderen vorhandenen Cav1.2-Isoformen, kann neue Ideen liefern und neue Grenzen für die Untersuchung der Rollen einzelner Cav1.2-Spleißvarianten in normalen und erkrankten Zellen und Geweben eröffnen.

Abbreviations