Ergebnisse

ALDH1-Expression im embryonalen und adulten Pankreas.

Basierend auf früheren Studien, die eine hohe ALDH1-Enzymaktivität in neuralen, hämatopoetischen und mammapithelialen Vorläufern (17-19) dokumentierten, charakterisierten wir zeitliche und räumliche Muster der ALDH1-Proteinexpression in embryonaler und adulter Maus-Bauchspeicheldrüse (Abb. 1). Unter Verwendung von E-Cadherin als Marker für Pankreasepithelzellen fanden wir heraus, dass das ALDH1-Protein zuerst im sich entwickelnden Pankreasepithel auf E12.5 nachweisbar ist (Abb. 1A). An dieser Stelle ist die Expression auf die Spitzen der Verzweigungsröhrchen beschränkt, die kürzlich vorgeschlagen wurden, um eine multipotentielle Vorläuferdomäne darzustellen (20). Ein ähnliches Expressionsmuster wurde bereits für Aldh1a1-Transkripte berichtet (21). Die Expression in den röhrenförmigen Spitzen (und nicht in den zentralen Stämmen) bleibt bis E14.5 bestehen (Abb. 1B und B‘) und wird anschließend in differenzierenden Azinuszellen herunterreguliert. Im adulten Pankreas wird die epitheliale ALDH1-Expression am häufigsten in centroacinaren und terminalen duktalen Epithelzellen beobachtet (Abb. 1 C-E). Mesenchymale (E-Cadherin-negative) ALDH1-exprimierende Zellen wurden auch in der Umgebung von endokrinen Inseln und exokrinen Azini nachgewiesen (Abb. S1).

Um die ALDH1-Expression und die ALDH1-Enzymaktivität in adulten terminalen Ductus /Centroacinar-Zellen weiter zu charakterisieren, verwendeten wir Präparate von peripheren acinar-ductalen Einheiten, die frisch aus dem Kollagenase-verdauten exokrinen Pankreas der Maus isoliert wurden (22). Wichtig ist, dass diese isolierten peripheren azinar-duktalen Einheiten deutlich von großen Kanal- und endokrinen Elementen abgereichert sind. Im Vergleich zum gesamten Pankreas zeigten periphere azinar-duktale Einheiten eine >400-fache Depletion in Insulin-Transkripten, wie durch RT-PCR (Abb. S2A). Wenn die FACS-Analyse an peripheren azinar-duktalen Einheiten durchgeführt wurde, die aus transgenen Ins1: DsRed-Mäusen gewonnen wurden, die rot fluoreszierendes Protein in β-Zellen exprimierten, waren nur 3 von 10.000 Zellen (0,03%) aus dieser Präparation positiv für DsRed.

Eine zusätzliche dreidimensionale Charakterisierung der ALDH1-Proteinexpression wurde mittels Whole-Mount-Fluoreszenzmarkierung isolierter peripherer acinar-duktaler Einheiten durchgeführt. Das ALDH1-Protein wurde in Kombination mit E-Cadherin als Marker von Epithelzellen und entweder mit FITC-konjugiertem Dolichos biflorus Agglutinin (DBA) oder FITC-konjugiertem Erdnussagglutinin (PNA), Markern von duktalen bzw. Die Mehrkanalbildgebung bestätigte eine überwiegend zentroacinare / terminale duktale Lokalisation von ALDH1-exprimierenden Epithelzellen im adulten Pankreas (Abb. S3). ALDH1-exprimierende Zellen wurden am häufigsten zwischen terminalem Duktalepithel und peripheren Azinuszellen angeordnet. Darüber hinaus wurden auch einzelne epitheliale ALDH1-exprimierende Zellen unmittelbar neben dem terminalen duktalen Epithel beobachtet (Abb. S3 A und B). Es wurden sowohl DBA-positive als auch DBA-negative ALDH1-positive Zellen identifiziert, wohingegen ALDH1-positive PNA-positive Zellen nur selten identifiziert wurden.

Isolierung von ALDH1-exprimierenden centroacinaren und terminalen duktalen Zellen.

In der Hoffnung, ALDH1-exprimierende Zellen aus adultem Maus-Pankreas zu isolieren, nutzten wir ein fluorogenes Substrat, das als „Aldefluor“ (StemCell Technologies) bekannt ist und zuvor bei der FACS-basierten Isolierung von hämatopoetischen, neuronalen und mammapithelialen Stammzellen verwendet wurde (17-19). Bevor wir die FACS-basierte Isolierung von ALDH1-exprimierenden Pankreasepithelzellen versuchten, wendeten wir dieses Reagenz zunächst an, um lebende ALDH1-exprimierende Zellen in peripheren acinar-duktalen Einheiten zu visualisieren (Abb. 2). Wie in Fig. 2 E und F bestätigten diese Studien die zentroacinare / terminale duktale Lokalisation von Aldefluor-positiven Zellen mit geringer Häufigkeit im adulten Maus-Pankreas. Aldefluor-positive centroacinar / terminale Duktalzellen wurden aufgrund ihrer geringen Größe und des Fehlens von Zymogengranulat leicht von benachbarten Acinarzellen unterschieden. Weitere Beispiele für die Lebendzellbildgebung unter Verwendung des Aldefluor-Reagenzes sind in Fig. S4. Diese Ergebnisse implizierten, dass Anti-ALDH1-Immunfluoreszenz und Aldefluor-basierte Cytofluoreszenz eine ähnliche zentroacinare / terminale duktale Population markierten, und deuteten weiter darauf hin, dass diese Zellen erfolgreich durch FACS isoliert werden könnten.

Als nächstes verfolgten wir die FACS-basierte Charakterisierung und Sortierung von Einzelzellen, die von peripheren azinar-duktalen Einheiten dissoziiert wurden. Als erstes Mittel, um ein spezifisches Gating von ALDH1-exprimierenden Zellen zu etablieren, verwendeten wir einen pharmakologischen Inhibitor der ALDH1-Enzymaktivität (DEAB). Wie in Fig. 2A-D gezeigt, ermöglichte diese Strategie die Isolierung einer Zellpopulation mit geringer Häufigkeit, die durch eine hohe DEAB-sensitive ALDH1-Enzymaktivität mit 0,9% ± 0 gekennzeichnet ist.2% aller sortierten Zellen im adulten Maus-Pankreas. Unter Verwendung eines E-Cadherin-Antikörpers zur gleichzeitigen Identifizierung von Epithelzellen wurde festgestellt, dass Aldefluor (+) E-Cadherin (+) -Zellen 0,5% ± 0,13% aller sortierten Zellen im adulten Maus-Pankreas darstellen (Abb. 2D).

Unter Verwendung quantitativer RT-PCR zum Vergleich der Aldefluor-positiven, E-Cadherin-positiven (A + E+), Aldefluor-negativen, E-Cadherin-positiven (A−E+), Aldefluor-positiven, E-Cadherin-negativen (A+ E−) und Aldefluor-negativen, E-Cadherin-negativen (A−E−) Populationen, die aus adultem Maus-Pankreas isoliert wurden, fanden wir die A + E + Population signifikant angereichert für Transkripte, die Aldh1a1 und Aldh1a7 und abgereichert an Transkripten für zwei andere ALDH1-Isoformen, Aldh1a2 und Aldh1a3 (Fig. 3G). Aldh8a1 wurde in keiner der Proben nachgewiesen. Verglichen mit der A−E + -Population waren A + E + -Zellen bescheiden an Transkripten für Pdx1 (P < 0,09), Amylase (P < 0,001) und Cytokeratin-19 (P < 0,01) (Marker, die in differenzierten β-Zellen, Azinuszellen bzw. Im Gegensatz dazu waren A + E + -Zellen durch eine hohe Expression von Ptf1a gekennzeichnet, obwohl sie sowohl an Amylasetranskripten als auch an Amylaseprotein abgereichert waren (Abb. 3G und Fig. S5). Darüber hinaus wurden diese Zellen für Transkripte angereichert, die für Sca-1, SDF1, c-Met, Nestin, Sox9, Hey1 und Hey2 kodieren, Marker, die zuvor mit Vorläuferpopulationen in Pankreas und anderen Geweben assoziiert waren. Unter Verwendung der Immunfluoreszenzmarkierung auf Cytospin-Preps von FACS-sortierten Zellen bestätigten wir eine deutliche Anreicherung von ALDH1- und Sox9-Protein und eine Depletion von Amylase in A + E + -Zellen (Abb. S5). Darüber hinaus führten wir auch eine FACS-Analyse durch, um die Häufigkeit zu bestimmen, mit der Aldefluor (+) -Zellen auch positiv für Stammzellmarker wie CD133 und Sca-1-Protein waren, und beobachteten, dass über 90% der Aldefluor (+) -Zellen zusätzlich beide Stammzellmarker coexprimierten. Im Gegensatz dazu waren nur 0,11% der Aldefluor (+) -Zellen auch positiv für den vaskulären endothelialen Marker PECAM, während 0,08% positiv für den hämatopoetischen Marker CD45 waren. Wenn die FACS-Analyse an peripheren azinar-duktalen Einheiten durchgeführt wurde, die von transgenen Ins1-DsRed-Mäusen geerntet wurden, die rot fluoreszierendes Protein in β-Zellen exprimierten, wurden alle Aldefluor (+) -Zellen als negativ für dsRed befunden.

Pankreatosphären-Assay der endokrinen und exokrinen Vorläuferfunktion.

Als Ausgangsbildschirm für progenitorähnliche Aktivität untersuchten wir Aldefluor (+) – und Aldefluor (–) -Zellen auf ihre Fähigkeit, Pankreatosphären zu bilden (Abb. 3), ähnlich dem Neurosphere-Assay, der üblicherweise zur Identifizierung neuronaler Vorläuferzellen verwendet wird (23). In diesen Assays waren A + E + centroacinar / terminale duktale Zellen einzigartig in der Lage, Kugeln in Suspensionskultur zu bilden. A + E+ -Zellen zeigten eine Kugelbildungseffizienz >, die 100-mal höher war als die ihrer A−E+ -Gegenstücke (Abb. 3A und B und Tabelle S1). Mit niedrigeren Wirkungsgraden konnten einzelne A + E + -Zellen sogar Kugeln bilden, wenn sie mit klonaler Dichte (eine Zelle pro Well) in 96-Well-Platten plattiert wurden (Tabelle S1). Keine der E-Cadherin-negativen Populationen zeigte eine signifikante Kugelbildungskapazität. Bei einer Kultivierung über einen Zeitraum von 5 bis 7 Tagen zeigten Pankreatosphären, die aus A + E + -Zellen stammten, eine starke Expression von E-Cadherin (Abb. 3C), die ihre epitheliale Identität bestätigten, und einzelne Zellen innerhalb der Kugeln begannen, beträchtliche Mengen an Amylase oder Insulin und Insulin-C-Peptid anzusammeln (Abb. 3D und E). Nach 5 Tagen zeigten ≈50% der Pankreatosphären eine Expression von Amylase, während etwa 30% eine Immunreaktivität gegenüber Insulin-C-Peptid zeigten. Einzelne Kugeln waren im Allgemeinen positiv für Insulin oder Amylase, aber nicht für beide. Kleine Untergruppen von Zellen innerhalb der Sphären behielten die ALDH1-Expression während der Kulturperiode bei und zeigten auch die nukleare Expression des Sox9-Proteins (Abb. 3 F und G), was auf die mögliche Aufrechterhaltung eines sich selbst erneuernden Progenitorpools hindeutet. Diese scheinbare Fähigkeit zur Selbsterneuerung wurde weiter durch die Tatsache gestützt, dass Pankreatosphären, die durch Aldefluor (+) centroacinar / terminale Duktalzellen erzeugt wurden, einer seriellen enzymatischen Dissoziation unterzogen werden konnten, wobei ihre Kugelbildungskapazität über mindestens drei aufeinanderfolgende Passagen in Intervallen von 7 Tagen erhalten blieb. Darüber hinaus waren Zellen innerhalb von Sphären stark proliferativ, wie durch den Einbau von EdU über Nacht entweder zu Beginn oder am Ende der Kulturperiode beurteilt wurde (Abb. 3H).

Basierend auf den ausgeprägten Progenitorkapazitäten von A + E + -Zellen untersuchten wir weiter sortierte Zellpopulationen auf Expression von Ngn3, einem Marker für endokrine Progenitorzellen (Abb. S2B). In Übereinstimmung mit früheren Studien (7) konnten wir weder in der gesamten adulten Bauchspeicheldrüse noch in einer der frisch sortierten Zellpopulationen eine signifikante Expression von Ngn3 nachweisen. Sobald die A + E + -Zellen jedoch in Kultur gebracht wurden, begannen sie, unmittelbar vor dem Einsetzen der Insulinexpression eine nachweisbare Expression von Ngn3 zu erzeugen, was die endokrine Vorläuferkapazität von ALDH1-exprimierenden centroacinaren und terminalen duktalen Epithelzellen weiter bestätigte.

Pankreatosphären, die von Aldefluor (+) terminalen duktalen / centroacinaren Zellen abgeleitet sind, zeigen eine Glucose-responsive Insulinsekretion.

Der Nachweis von Zellen, die Insulin und Insulin-C-Peptid in kultivierten Pankreatosphären exprimieren, veranlasste die Beurteilung, ob diese Zellen zur Glucose-responsiven Insulinsekretion in der Lage waren, was für funktionelle β-Zellen charakteristisch ist. Als Positivkontrolle verwendeten wir Ins-1-Zellen (Klon 832/13), eine immortalisierte β-Zelllinie, die üblicherweise für Studien der Insulinsekretion als Reaktion auf physiologische Glukosekonzentrationen verwendet wird. Nach nächtlicher Inkubation von Pankreatosphären oder Ins-1-Zellen in 0, 5 und 11 mM Glucose wurden sowohl Kulturmedienüberstände als auch Zelllysate geerntet und unter Verwendung eines ELISA-basierten Assays auf sekretiertes und zelluläres Insulin-C-Peptid untersucht. Pankreatosphären, die von Aldefluor (+) centroacinar / terminalen Duktalzellen abgeleitet sind, sezernierten C-Peptid in einer glucoseabhängigen Weise mit einer Glucoseempfindlichkeit ähnlich der von Ins-1-Zellen (Abb. 3I).

Aldefluor (+) Adulte terminale duktale/centroacinare Zellen können zu embryonalen endokrinen und exokrinen Linien beitragen.

Als noch strengerer Test für die pankreatische Vorläuferaktivität injizierten wir isolierte Aldefluor (+) – und Aldefluor (-) -Zellen in mikrodissektierte dorsale Pankreasknospen, die aus E12.5-Mausembryonen isoliert wurden, und untersuchten sie auf ihre Fähigkeit, produktiv zu den sich entwickelnden endokrinen und exokrinen Linien beizutragen (Abb. 4). Dieser Ansatz wurde kürzlich verwendet, um die Vorläuferaktivität für Ngn3-exprimierende Zellen zu dokumentieren, die nach der Pankreasgangligatur entstehen (7). Um die Abstammung adulter Spenderzellen zu verfolgen und sie von ihren embryonalen Gegenstücken zu unterscheiden, isolierten wir Aldefluor (+) – und Aldefluor (–) -Zellen aus der Bauchspeicheldrüse von Mäusen, die ein ubiquitär exprimiertes pCAG: mCherry-Transgen tragen, wie schematisch in Abb. 4A (pCAG:mCherry Mäuse wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Michael Wolfgang, Johns Hopkins University). Im Vergleich zu Aldefluor (–) -Zellen hatten Aldefluor (+) -Zellen ein dramatisch erhöhtes Potenzial, zu aufstrebenden endokrinen Linien innerhalb der reifenden Rückenknospen beizutragen, wie durch Koexpression von mCherry mit entweder C-Peptid (Abb. 4B-E) oder Glucagon (Fig. 4 F-I). Unter Verwendung der überlagerten E-Cadherin-Markierung, um das Zählen einzelner mCherry-positiver Zellen zu ermöglichen, bewerteten wir quantitativ die Fähigkeit adulter Aldefluor (+) − und Aldefluor (-) -Zellen, in embryonale Linien einzutreten. Sieben Tage nach der Mikroinjektion von Aldefluor (+)-Zellen in E12.5 dorsalen Knospen wurde die Expression von Glucagon in 11,7% der verbleibenden mCherry-positiven Zellen beobachtet, wobei die Insulin-C-Peptid-Expression in weiteren 11,6% beobachtet wurde (Abb. 5N). Im Gegensatz dazu exprimierten 2,4% der verbleibenden mCherry-positiven Aldefluor (-) -Zellen Glucagon und nur 0,2% Insulin-C-Peptid. Interessanterweise zeigten die Aldefluor (+) – und Aldefluor (–) -Populationen gleichwertige Fähigkeiten, in nichtendokrine epitheliale Linien einzutreten, was möglicherweise die Tatsache widerspiegelt, dass der größte Teil der Aldefluor (-) -Population aus bereits differenzierten Azinuszellen bestand. Ähnliche Häufigkeiten von E-Cadherin-, Amylase– und PNA-Positivität wurden in verbleibenden mCherry-positiven Zellen beobachtet, die entweder aus der Aldefluor (+) – oder der Aldefluor (-) -Population stammten (Abb. 4 J-N).

Expansion of ALDH1-Expressing Centroacinar and Terminal Duct Cells Following Chronic Epithelial Injury.

Um das In-vivo-Verhalten von ALDH1-exprimierenden centroacinaren und terminalen Kanalzellen zu bewerten, untersuchten wir Muster der ALDH1-Expression im Rahmen chronischer Entzündungen und regenerativer Metaplasie, die durch sequentielle Verabreichung von niedrig dosiertem Caerulein induziert wurden. Wie bereits berichtet (15), induzierte die Behandlung von erwachsenen Mäusen mit drei Injektionen von Caerulein (50 µg / kg) pro Woche über 3 aufeinanderfolgende Wochen einen Zustand chronischer Pankreatitis, gefolgt von einer nahezu vollständigen Regeneration und Reparatur. Dieser Prozess ist gekennzeichnet durch entzündliche Infiltrate, Stromaexpansion und die Bildung regenerativer metaplastischer tubulärer Komplexe, zu denen Typ-1-tubuläre Komplexe gehören, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie von Azinuszellen stammen, und Typ-2-tubuläre Komplexe (TC2), von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie nicht von Azinuszellen stammen und vermutlich aus proliferierenden terminalen Kanalzellen stammen (15). Im Gegensatz zu der relativ geringen Häufigkeit von ALDH1-exprimierenden terminalen Ductus- und Centroacinarzellen, die im normalen adulten Pankreas beobachtet wurden (Abb. 5A und B), ALDH1-exprimierender Endkanal (Fig. 5C und D) und centroacinar (Fig. 5E und F) Zellen waren im Setting der Caerulein-induzierten chronischen Pankreatitis deutlich expandierbar. Bemerkenswert ist, dass Typ-2-tubuläre Komplexe überwiegend aus ALDH1-exprimierenden Zellen bestanden (Abb. 5H), während Typ-1-Röhrenkomplexe keine Hinweise auf eine ALDH1-Expression zeigten (Abb. 5G).