Einleitung

Das hepatozelluläre Karzinom (HCC), das den wichtigsten histologischen Subtyp des primären Leberkrebses darstellt, ist die fünfthäufigste Krebsart weltweit und die dritthäufigste Ursache für Krebssterblichkeit (1,2). Die höchsten Leberkrebsraten sind in Entwicklungsländern zu finden, insbesondere in Ost-/ Südostasien und Mittel-/ Westafrika, während die Raten in Süd-Zentral-, Westasien, Nord- und Osteuropa niedrig sind (3). Genetische Veränderung und epigenetische Hochrisikofaktoren wie chronische Infektion mit HBV oder HCV, Leberzirrhose, alkoholische Lebererkrankung und Aflatoxine erklären die hohe Morbidität von HCC (4-6).Der molekulare Mechanismus begleitet Vonhepatokarzinogenese und Progression ist noch weitgehend unklar.Daher ist es für uns von entscheidender Bedeutung, die Ätiologie zu klären und die lebenswichtige molekulare Veränderung zu untersuchen, die der Initiierung und dem Fortschreiten des hepatozellulären Karzinoms zugrunde liegt, und letztendlich unsere aktuellen Konzepte für die Diagnose, das Screening und die Behandlung dieser Krankheit zu verbessern.

Während des Prozesses der Hepatokarzinogenese ist theabrogation von Zellzyklus-Checkpoints ein wichtiges Kennzeichen, das die Krebsbildung fördern kann (2).Als einer der Regulatoren des Zellzyklus-Checkpoints scheint celldivision Cycle 20 (CDC20) als regulatorisches Protein zu fungieren, das mit dem Anaphase-fördernden Komplex / Cyclosom (APC / C)im Zellzyklus interagiert, der für die Anaphase-Initiierung und den latenten Mitose-Ausgang erforderlich ist (7,8). Zwei regulatorische Faktoren, CDC20 und CDH1, binden direkt an APC und aktivieren seine Cyclin-Ubiquitinierungsaktivität während der Mitose- und G1-Phase (9,10).Es wurde berichtet, dass das Rezeptor-assoziierte Protein 80 (RAP80), das BRCA1 an DNA-Schädigungsstellen im durch DNA-Schädigung induzierten Ubiquitinsignalweg rekrutiert, durch den Anaphase-fördernden Komplex (APC / C-Cdc20) oder (APC / C-Cdh1) durch Polyubiquitinierung während der Mitose zur G1-Phase abgebaut werden kann (11). Die Depletion von RAP80 zeigte eine mangelhafte Kontrolle des G2-M-Phasen-Checkpoints und förderte das Fortschreiten des mitotischen Zellzyklus.

Die CDC20-Expression kann bemerkenswert durch p53-Protein unterdrückt werden, das die maligne Transformation durch Regulation des Zellzyklus, zelluläre Seneszenz und Apoptose-verwandte Gene hemmt(12). Eine hohe Expression von cdc20 wurde bei verschiedenen malignen Tumoren berichtet, einschließlich pankreasduktalem Adenokarzinom (13), oralem Plattenepithelkarzinom, Magenkrebs (14), Gebärmutterhalskrebs (15) und verschiedenen Krebszellen (14,16).Das Expressionsmuster von CDC20 und seine klinische Bedeutung beim humanen hepatozellulären Karzinom sind jedoch nicht geklärt.

In dieser Studie wurde durch Analyse des Microarray-Datensatzes(accession No. GSE14520) aus der Gene Expression Omnibus (GEO) -Datenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) fanden wir, dass cdc20 der Hauptknoten in molekularen HCC-Interaktionsnetzwerken war. Wir untersuchten das Expressionsniveau von CDC20 in primärem HCC und angrenzenden Nichttumorgeweben und bewerteten seine klinisch-pathologische Signifikanzin 132 archivierten HCC-Proben. Die Wirkung des Knockdowns von CDC20 durch siRNA auf das Wachstum und den Zellzyklus von Leberkrebszellen wurde ebenfalls untersucht. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass CDC20 eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von HCC spielen kann.

Materialien und Methoden

Bioinformatikanalyse

Der Microarray-Datensatz GSE14520 (17) wurde von GEO heruntergeladen. Insgesamt 183 HCC- und 179 entsprechende Para-Karzinomgewebe, die mit Affymetrix U133A-Genchips von chinesischen Patienten der Kohorte 2 untersucht wurden, wurden in dieser Studie verwendet. Die Daten zur Genexpressionsprofilierung wurden unter Verwendung der RMA-Methode (18) und der Entrez-genzentrierten CDF-Dateien (19) (anstelle der originalAffymetrix-CDF-Dateien) neu zusammengefasst, wobei unspezifische Sonden auf den Genchips gefiltert und mehrere Sondensätze, die dasselbe Entrez-Gen repräsentieren, zu einem Sondensatz zusammengeführt wurden. Signifikanzanalyse von Microarray (SAM) (20) wurde durchgeführt, um unterschiedlich exprimierte Gene zwischen HCC und korrespondierendem Para-Karzinomgewebe zu identifizieren. Delta wurde auf 2,25 und der Schwellenwert ofFDR auf 0,001 gesetzt. In HCC überexprimierte Gene, die in mehr als 50 HCC-Geweben, aber weniger als 10 entsprechenden Para-Karzinom-Geweben exprimiert wurden, wurden untersucht. Die Gene wurden weiter mit der GenCLiP-Software (21) (http://ci.smu.edu.cn) analysiert, um Genfunktionen zu kommentieren und molekulare Interaktionsnetzwerke aufzubauen.

Ethikerklärung

Die klinischen Proben wurden nur zu Forschungszwecken verwendet. Die Genehmigung wurde von der Ethikkommission des ChinesePLA General Hospital (LREC 2012/40) eingeholt. Alle Proben wurden unter der Bedingung einer vorherigen schriftlichen Einverständniserklärung der Patienten entnommen.

Patienten und Gewebeproben

Sechzehn Paare frischer HCC und angrenzender Nicht-Tumorgewebe, die für Echtzeit-PCR- und Western-Blot-Analysen verwendet wurden, wurden während der Operation vom chinesischen PLA General Hospital (Peking, China) von November 2012 bis Februar 2013 gesammelt. Gewebe wurden bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Paraffin-eingebettete, archivierte HCC und angrenzende Nicht-Tumorgewebe, die für die Immunhistochemie (IHC) verwendet wurden, wurden von 132 HCC-Patienten erhalten, die zwischen Januar 2006 und Dezember 2007 im selben Krankenhaus eine partielle Leberresektion durchliefen. Das Durchschnittsalter der Patientenwar 52 Jahre (Bereich 24-80 Jahre).

Zellkultur

Eine normale Leberzelllinie (LO2) und drei HCC-Zelllinien (HepG2, SMMC7721, Huh7) wurden von der American TypeCulture Collection (ATCC, Manassas, VA) oder der Chinese Academy ofScience Cell Bank erworben und im Institute ofBiotechnology, Academy of Military Medical Sciences gepflegt. Alle Zellen wurden in Dulbecco’s modifiziertem Eagle’s Medium (DMEM, Invitrogen, CA) gehalten, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, Gibco, Carlsbad, CA) und 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 µg / Mlstreptomycin bei 37 ° C mit 5% CO2 ergänzt wurde.

RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und Echtzeit-PCR-Analyse

Die Gesamt-RNA wurde aus Zelllinien und Gewebeproben unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Insgesamt 2 µg RNA wurden mit dem TransScript and cDNA Synthesis Kit der Fa. Transgen Biotech (Beijing, China) reversetranskribiert. Real-time PCR was performed toexamine CDC20 mRNA level in cell lines and tissue samples by usinga Bio-Rad iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad,Hercules, CA). β-actin was used as an internal control fornormalization. PCR primers were designed using the Primer Premier 5software and the sequences were: CDC20 forward,5′-TCGCATCTGGAATGTGTGCT-3′; and reverse,5′-CCCGGGATGTGTGACCTTTG-3′; β-actin forward,5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′; and reverse, 5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′. Expressionsdaten wurden auf den geometrischen Mittelwert des Housekeepinggens β-Aktin normalisiert und mit dem ΔΔCt (22) berechnet und die Ergebnisse mit 2−ΔΔCt exprimiert.

Western-Blot-Analyse

Die Western-Blot-Analyse wurde unter dem Standardprotokoll durchgeführt. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10%) wurde verwendet, um das Protein zu trennen, das dann vom Gel auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran elektrotransferiert wurde. Nach 1 h Blockierung mit 5% getrockneter Magermilch wurde die Membran mit dem polyklonalen Antikörper rabbit anti-human CDC20 (1:1000, Bioworld Technology, St. Louis Park, MN) für 1 h bei Raumtemperatur. Als interne Kontrolle wurde der Maus-Anti-Human α-Tubulin monoklonale Antikörper (1:5000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) verwendet. Nach dreimaligem Waschen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung withTween-20 (TBST) wurde die Membran mit sekundärem Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Antikörper gegen Rabbitor-Maus inkubiert (Verdünnung 1:5000). Der Chemilumineszenznachweis wurde mit dem Immobilion Western Chemiluminescent HRP Substratekit (Millipore Corporation, Billerica, MA) durchgeführt.

Immunhistochemie (IHC) und Scoring

Die Immunhistochemie für die CDC20-Expression in HCC- und angrenzenden Nicht-Tumorproben wurde unter Verwendung von Standardmethoden durchgeführt.Kurzzeitig wurden Gewebeschnitte mit Kaninchen-Anti-cdc20verdünnt 1:200 (Bioworld Technology) über Nacht bei 4°C inkubiert. Als Negativkontrolle wurde Rinderserumalbumin (1%; BSA) ohne Primärantikörper verwendet. Der sekundäre Poly-Meerrettich-Peroxidase (HRP)Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (ZSGB-Bio, Beijing, China) wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Alle immunbehafteten Abschnitte wurden unabhängig voneinander von zwei Pathologen in verblindeter Manier ohne Kenntnis der klinisch-pathologischen Informationen überprüft und bewertet, basierend auf der H-Score-Methode, die die Färbeintensität zusammen mit dem Prozentsatz der positiv gefärbten Zellen berücksichtigt (23,24).Für die H-Score-Methode wurden 10 Felder zufällig bei × 400vergrößerung ausgewählt. Die Färbeintensität in den Zellen wurde als 0,1, 2 und 3 entsprechend der negativen, schwachen, mittleren bzw. starken Färbung bewertet. In jedem Feld wurden die Gesamtzahl der Zellen und die bei jeder Intensität gefärbten Zellen gezählt. Der H-Wert wurde nach folgender Formel berechnet: (% der Zellen, die mit der Intensitätskategorie 1 × 1 angefärbt wurden) + (% der Zellen, die mit der Intensitätskategorie 2 × 2 angefärbt wurden) + (% der Zellen, die mit der Intensitätskategorie 3 × 3 angefärbt wurden). H-Scores variierten von 0 bis 300, wobei 300 100% der stark gefärbten Zellen repräsentierte (3+) (24). Eine hohe cdc20-Expression wurde definiert als Färbung von H-Scores von Zellen ≥200.

Unterdrückung von CDC20 durch kleine interferierende RNA (siRNA)

Doppelsträngige, kleine interferierende RNA (siRNA) wurde von GenePharma (Shanghai, China) synthetisiert und gereinigt. Die Sequenzen, die der kodierenden Region der menschlichen CDC20 entsprachen, waren: sense, 5′-GGAGCUCAUCUCAGGCCA UUU-3′; antisense,5′-AUGGCCUGAGAUGAGCUCCUUU-3′. Eine verschlüsselte Nicht-Targeting-siRNA wurde für die Negativkontrolle verwendet. Diese siRNAs wurden in Ethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser gelöst, um eine Konzentration von 20µM zu erreichen. Leberkrebs-HepG2-Zellen wurden mit CDC20-siRNA oder negativer Kontroll-siRNA in 20 nM unter Verwendung des INTERFERin invitro siRNA-Transfektionsreagenzes (Polyplus Transfektion, New York, NY) behandelt.

Quantitative Real-Time PCR- und Western-Blot-Analysen wurden zum Nachweis des Interferenzeffekts von siCDC20 verwendet. Zellen, die unbehandelt oder mit Negativkontroll-siRNAoligonukleotiden behandelt wurden, waren die Kontrollgruppen.

Zellproliferationstest

Zwei 25 cm2 Plastikflaschen wurden jeweils mit 2×105 Leberkrebszellen (HepG2) inokuliert, die dann mit 20 nM negativer Kontroll-siRNA bzw. CDC20siRNA für 48 h Inkubation transfiziert wurden. Dann wurden die Zellen verdaut und in 6-Well-Platten mit 2 ml Medium pro Well ausgesät.Anschließend wurden die Zellen aus einer Vertiefung verdaut und alle 24 h bis zum fünften Tag mit dem automatischen Zellzähler (Invitrogen) gezählt.

Fluoreszenz-aktivierter Zellsortiertest(FACS) des Zellzyklus

siRNA für CDC20 und Negativkontroll-Sirnaoligonukleotide wurden mit dem in vitro siRNA-Transfektionsreagenz Interferin für 48 h in HepG2-Zellen transfiziert.Nach Behandlung mit 2 µg/ml Thymidin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) für 24 h wurden Zellen bei 0, 3, 6, 9, 12- h Nachentfernen von Thymidin aus dem Medium und Fixieren mit 70%igem Alkohol.Vor der Analyse wurden die Zellen mit PBS gewaschen, 30 min bei 37°C mit 1 mg/ml RNase A behandelt und anschließend mit Propidiumiodid (PI) gefärbt. Die Analysen wurden von BD FACSCalibur (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) durchgeführt und die Ergebnisse von WinMDI Version 2.9Software analysiert.

Statistische Analysen

Alle statistischen Analysen wurden mit dem Statistiksoftwarepaket IBMSPSS 20.0 durchgeführt. Eine Einweganalyse der Varianz (ANOVA) wurde verwendet, um die Expression von CDC20 mrnanormalisiert zu β-Aktin in Zelllinien zu vergleichen. Die gleiche Methode wurde auchdurchgeführt beim Vergleich der histologischen Differenzierung in Tumorgeweben normalisiert auf normale Leberproben. Datenvergleiche in zwei Gruppen wurden durch den T-Test des Schülers durchgeführt. Der χ2-Testwurde verwendet, um die Beziehung zwischen der CDC20-Expression und den klinisch-pathologischen Merkmalen zu analysieren. Bivariate Korrelationen zwischenvariablen wurden nach Spearmans Korrelationskoeffizienten berechnet.Die statistische Signifikanz wurde für alle Tests auf P<0.05 gesetzt.

Ergebnisse

CDC20 ist der Hauptknoten in molekularen HCC-Interaktionsnetzwerken

Die SAM-Analyse identifizierte 4.358 inHCC-überexprimierte Gene, bei denen 137 Gene in mehr als 50 HCC-Geweben exprimiert wurden, jedoch in weniger als 10 Para-Karzinom-Geweben. Die GenCLiP-Analyse zeigte, dass unter den 137 Genen 72 Gene mit dem Zellzyklus verwandt waren (P = 1,238e-15, nach χ2-Test), 19 Gene mit der Spindelanordnung verwandt waren (P = 2,172e-55, nach χ2-Test) und 26 Gene mit der Chromosomensegregation verwandt waren (P = 5,472e-55, nach χ2-Test). Unter den molekularen Netzwerken, die mit den 137 Genen aufgebaut wurden, war CDC20 der Hauptknoten, von dem bisher nicht berichtet wurde, dass er mit HCC verwandt ist. Es ist bekannt, dass neun Gene (NEK2, E2F1, BUB1, BUB1B, AURKB, CCNB1, CCNB2, UBE2C und CDKN2A) mit CDC20 interagieren, wobei 7 Gene mit dem Spindleassembly Checkpoint (SAC) verwandt waren (Abb.1). Das Ziel des SAC ist CDC20 (25). So folgerten wir, dass in HCC,Überexpression von CDC20 führt zur Abwesenheit von SAC, und Zellen rapidlybecome aneuploid.

CDC20 wird in HCC überexprimiert

Quantitative Real-time PCR wurde verwendet, um den Transkriptspiegel von CDC20 in drei HCC-Zelllinien (HepG2, SMMC-7721 und Huh7) und einer normalen Leberzelllinie (LO2) zu untersuchen. Der CDC20-mRNA-Spiegel war in allen drei HCC-Zelllinien höher als in der Normalzelllinie (Abb. 2).

Um festzustellen, ob die Hochregulation von CDC20 in HCC-Zelllinien bei HCC-Patienten ähnlich ist, führten wir eine quantitative Echtzeit-PCR an 16 Paaren übereinstimmender HCC- und benachbarter normaler Lebergewebe durch. Wie in Fig.3A wurde festgestellt, dass CDC20 in 14 aller untersuchten humanen primären HCC-Proben im Vergleich zu nicht krebsartigen Proben derselben Patienten differentiell überexprimiert wurde. Zusätzlich war das Tumor / Nicht-Tumor (T / NT) -Verhältnis der CDC20-mRNA-Expression mindestens >2-fach in all diesen 14 hochregulierten Proben, und das höchste Verhältnis war sogar bis zu etwa 40-fach. Der Proteingehalt von CDC20 wurde in allen bestätigtdie 16 gepaarten Gewebeproben durch Western-Blot-Analyse. Image J1.47v Software wurde verwendet, um den Graupegel jeder Bande zu quantisieren und das CDC20 T / NT-Verhältnis jedes Patienten zu berechnen, der sich mit Tubulin normalisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass alle untersuchten HCC-Proben außer Probe 1 und Probe 4 ein höheres Expressionsniveau des CDC20-Proteins aufwiesen, das mit dem mRNA-Niveau übereinstimmte (Abb. 3B). Diese Ergebnisse zeigten, dass CDC20 häufig entweder in HCC-Geweben oder in Zelllinien hochreguliert wurde.

Immunhistochemische Färbung von CDC20protein

Die Immunhistochemie (IHC) wurde durchgeführt, um die Proteinexpression und Lokalisation von CDC20 in 132paraffin eingebetteten archivierten HCC-Gewebeproben zu analysieren, darunter 14 Fälle von gut differenzierten, 78 Fälle von mäßig differenzierten und 40 Fälle von schlecht differenzierten Tumoren. CDC20-Protein wurde in 90 (68,18%) von 132 HCC-Geweben hochreguliert (H-Score ≥200). Wie in Fig. 4A, hohe CDC20-Spiegel waren in primären HCC-Läsionen vorhanden, und die positive Färbung war hauptsächlich im Zytoplasma und in den Kernen lokalisiert. Im Gegensatz dazu war CDC20 in entsprechenden Nicht-Tumorgeweben negativ oder schwach gefärbt. Durch quantitativen Vergleich der Werte der CDC20-Färbung zwischen 132archivierten HCC und benachbarten Nicht-Tumorgeweben (hauptsächlich einschließlich Hepatocirrhose und Hepatitis) waren die Werte der CDC20-Färbung in HCC-Proben im Vergleich zu Peritumorproben signifikant erhöht (Abb. 4B). Darüber hinaus wurde die Wirksamkeit der CDC20-Färbung zusammen mit signifikant erhöhtdas Fortschreiten der histologischen Tumordifferenzierung von gut zu schwach differenzierten Geweben (Abb.5).

Korrelation zwischen erhöhter cdc20-Expression und klinisch-pathologischen Parametern von HCC

Die Beziehung zwischen CDC20-Proteinexpression und den klinisch-pathologischen Merkmalen von 132 HCC-Patienten wurde weiter analysiert. Wie in Tabelle I zusammengefasst, war die CDC20-Expression signifikant mit dem Geschlecht (P = 0,013), der Tumordifferenzierung (P = 0,000), dem TNM-Stadium (P = 0,012), der P53- und der Ki-67-Expression (P = 0,023 bzw. P = 0,007) assoziiert. Es wurde jedoch ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen einer hohen cdc20-Expression und anderen klinisch-pathologischen Merkmalen gefunden, darunter Alter, Tumorgröße, HBV-Infektion, Serum-AFP-Spiegel, Leberzirrhose, Gefäßinvasion und intra- / extrahepatische Metastasierung. Die Spearmancorrelation-Analyse ergab, dass eine hohe Expression von CDC20 eng mit dem Geschlecht zusammenhängt (R = 0,215, P =0,013), schlechtere Tumordifferenzierung (R = 0,421, P<0,001), fortgeschrittenes TNM-Staging (R = 0,218, P = 0,012), höheres Expressionsniveau von p53 (R = 0,212, P= 0,014) und Ki-67 (R=0,235, P=0,007) (Tabelle II). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass CDC20 in HCC-Geweben stark exprimiert wurde und seine Expression eng mit der Differenzierung und dem Fortschritt von HCC korrelierte.

Unterdrückung der CDC20-Expression durch siRNA

Die quantitative Echtzeit-PCR ergab eine 90% ige Unterdrückung der Transkriptionsebene von CDC20 bei 48 h Nachtransfektion mit siCDC20 im Vergleich zu unbehandelten Zellen oder mit negativer Kontroll-siRNA transfizierte Zellen (Abb. 6A) (P<0,0001). Die Western-Blotanalyse zeigte auch eine offensichtliche Suppression des CDC20-Proteinspiegels innerhalb von 48 h nach Transfektion mit siCDC20 (Abb. 6B). Die veränderte Expression des Proteins des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitors 1A (p21) wurde ebenfalls durch Western-Blot-Analyse untersucht, und die Ergebnisse zeigten, dass der P21-Proteinspiegel aufgrund der Unterdrückung von CDC20 bemerkenswert hochreguliert war (Abb. 6B).

Wirkung der CDC20-Suppression auf die Zellproliferation und den Zellzyklus

Der Zellproliferationstest ergab, dass das Zellwachstum von CDC20-siRNA-transfizierten Zellen im Vergleich zu den mit negativer Kontroll-siRNA transfizierten Zellen bemerkenswert gehemmt war(Abb. 6C). Es wurde erwartet, dass die Hemmung der Zellproliferation durch siCDC20 mit der Erholung an der Metaphase des Zellzyklus einhergeht. Im Durchflusszytometrietest wurde in sicdc20transfizierten Zellen eine erhöhte Anzahl von Zellen in der G2 / M-Phase beobachtet, verglichen mit Zellen, die mit negativer Kontroll-siRNA transfiziert wurden (Abb. 6D). Diese Daten zeigten, dass die Unterdrückung von CDC20 das Zellwachstum hemmte, indem es den G2 / M-Phasenarrest induzierte.

Diskussion

Durch bioinformatische Analyse eines Microarraydatasets aus der GEO-Datenbank identifizierten wir CDC20, das der Hauptknoten in molekularen HCC-Interaktionsnetzwerken war, es war verwandt mitspindle Assembly Checkpoint (SAC) im Zellzyklus. Während der Tumorentstehung wurde angenommen, dass Defekte oder Störungen im Prüfpunkt der Spindelbaugruppe für die erhöhte Aneuploidisierungsrate verantwortlich sind (26). Mondalet al haben berichtet, dass CDC20 in primären überexprimiert wirdkopf- und Halstumoren und mehrere orale Plattenepithelkarzinom (OSCC) Zelllinien. Ein hohes Expressionsniveau von CDC20 in OSCC-Zellen ist mit einer vorzeitigen Anaphasenförderung verbunden, die zu mitotischen Anomalien führt (27). Studien haben auch gezeigt, dass eine hohe CDC20-Expression in Geweben von Plattenepithelkarzinomen und Kolorektalkarzinomen nachgewiesen wird und ihre Überexpression eine schlechte Prognose für Patienten vorhersagen kann (28,29).

CDC20 wird auch benötigt, damit späte Anaphasezellen aus der Mitose austreten können (30). TargetingCDC20 führt zur Blockierung des Mitose-Austritts, was eine bessere krebstherapeutische Strategie zur effektiveren Abtötung von Krebszellen sein kann als spindelstörende Medikamente (31). Wang et al. berichteten, dass CDC20, das als Onkoprotein zur Förderung des Fortschreitens und der Entwicklung von Krebserkrankungen beim Menschen fungieren kann, ein vielversprechendes therapeutisches Ziel darstellt (32). Obwohl die Rolle von CDC20 bei der Tumorentstehung und Prognose mehrerer Krebserkrankungen beim Menschen eingehend erforscht und bestätigt wurde, haben begrenzte Studien die potenzielle Funktion von CDC20 bei der Initiierung und dem Fortschreiten des hepatozellulären Karzinoms untersucht.

In dieser Studie bewerteten wir das Expressionsniveau von CDC20 in 16 gepaarten frisch gefrorenen HCC-Geweben und entsprechenden Nicht-Tumor-Proben. Die Ergebnisse zeigten, dass der mittlere mRNA- und Proteinspiegel von CDC20 in HCC-Geweben viel höher war als in übereinstimmenden Nicht-Tumorgeweben. Immunhistochemie wurde verwendet, um die subzelluläre Lokalisation von CDC20 und seine Beziehung zu klinisch-pathologischen Parametern von HCC zu untersuchen patients.By unter Verwendung des χ2-Tests fanden wir heraus, dass ein höheres CDC20-Proteinexpressionsniveau mit Geschlecht, Tumordifferenzierung, TNM-Stadium, P53- und Ki-67-Expression assoziiert war. Um die potentielle biologische Funktion und den molekularen Mechanismus von CDC20 in HCC zu untersuchen, haben wir eine doppelsträngige, kleine interferierende RNA (siRNA) entwickelt, die auf CDC20 abzielt, um sein Expressionsniveau in der HepG2-Zelllinie zu stören. Durch Zellproliferationstest und FACS-Test fanden wir heraus, dass Zellen, die mit siCDC20-Oligonukleotiden transfiziert wurden, eine verringerte Wachstumsgeschwindigkeit und einen erhöhten Anteil an Zellen im G2 / M-Stadium zeigten.

Der spezifische Knockdown von CDC20 durch siRNA zeigte eine unterdrückte Wirkung gegen die Leberkrebszellproliferation invitro, was darauf hindeutete, dass die Überexpression von CDC20 die Zellproliferation beschleunigen und die Tumorinitiierung und das Fortschreiten des HCC fördern könnte. Die Leberkrebszellen mit unterdrückter CDC20-Expression wurden dazu veranlasst, inG2 / M-Phase anzusammeln, was für die Hemmung des Zellwachstums verantwortlich sein kann. Der Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor 1A (p21), der bekanntermaßen am G2 / M-Checkpoint (33) beteiligt ist, erwies sich als hochreguliert, wenn die CDC20-Expression in Leberkrebszellen spezifisch unterdrückt wurde. P21 kann die Aktivität von CDKs hemmen, was zur Akkumulation von unphosphoryliertem Rb-Tumorsuppressorprotein führt, das die transkriptionelle Aktivierung von E2F hemmt und anschließend den Eintritt der Zellen in die S-Phase des Zellzyklus verhindert (34).Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies die erste Studie ist, die darauf abzielt, die CDC20-Expression in HCC-Geweben und -Zelllinien zu untersuchen und einen neuen Fokus darauf zu legen, dass CDC20 ein klinisch relevanter Indikator und ein vielversprechendes therapeutisches Ziel von HCC sein kann. Nichtsdestotrotz sind weitere Studien zu den molekularen Mechanismen von CDC20 bei der Initiierung und Progression von HCC sowie Untersuchungen zur prognostischen Signifikanz von CDC20 erforderlich.

Danksagung

Die Autoren danken ihren Kollegen vom Institut für Biotechnologie der Akademie der Militärmedizinwissenschaften für ihre technische Unterstützung.

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