Screening von humanen Zelloberflächenmarkern

hESC- und hPSC-RPE-Zellen wurden unter Verwendung von TrypLE für 5-10 min in Einzelzellen dissoziiert. Optische Vesikel wurden mit TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) für 10 min in einzelne Zellen dissoziiert, gefolgt von physikalischer Dissoziation durch eine 20 G-Nadel. Um die gleichzeitige Analyse dieser verschiedenen Populationen in derselben Probe zu ermöglichen, wurden hESC-, hPSC-RPE-Zellen und optische Vesikelzellen gemäß dem Herstellerprotokoll (Thermo Fisher Scientific) mit CellTrace ™ CFSE (0,25 µM) für 7 Minuten bei 37 ° C oder CellTrace ™ Violet (5 µM) für 20 Minuten bei 37 ° C markiert. Anschließend wurden die drei Zelltypen mit den BD Lyoplate™ Screening Panels (BD Biosciences) nach dem Herstellerprotokoll gefärbt. Die Barcodierung der Zellen ermöglichte eine einfache Unterscheidung zwischen den drei Zellgruppen und eine Minimierung der Probenvariabilität während des Screenings. Die Proben wurden auf 96-Well-Platten auf einem LSRFortessa mit 405-, 640-, 488-, 355- und 561-nm-Laser (BD Biosciences) oder einem CytoFLEX mit 405-, 638-, 488- und 561-nm-Laser (Beckman Coulter) analysiert. Nicht lebensfähige Zellen wurden von der Analyse mit dem Nukleinsäurefarbstoff 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) (BD Biosciences) ausgeschlossen. Die Analyse der Daten erfolgte mit der Software FlowJo v.10 (Tree Star). Der Zelloberflächenmarker-Bildschirm wurde einmal für 3D-optische Vesikel und einmal für hPSC-RPE Tag 60 durchgeführt.

Zellkultur

Die hESC-Linien HS980 und HS983 wurden zuvor unter xenofreien und definierten Bedingungen gewonnen und kultiviert30 (Swedish Ethical Review Authority: 2011/745:31/3). Die Spender gaben ihre Einverständniserklärung zur Ableitung und anschließenden Verwendung der hESC-Linien ab. Die WA09/H9-hESC-Linie wurde von Wicell erhalten und an Feeder-freie Kultur auf hrLN-521 (10 µg/ml, Biolamina) angepasst. Die Zellen wurden durch klonale Vermehrung auf hrLN-521-beschichteten Platten in NutriStem hPSC XF Medium (Biological Industries) in einem 5% CO2 / 5% O2 Inkubator gehalten und alle 5-6 Tage enzymatisch im Verhältnis 1: 10 passiert.

Die IPSC-Linien CTRL-7-II, CTRL-9-II, CTRL-12-I und CTRL-14-II wurden freundlicherweise von der IPSC Core Facility des Karolinska Institutet (Swedish Ethical Review Authority: 2012/208-31/3, 2010/1778-31/4). Die Spender gaben ihre Einverständniserklärung zur Ableitung und anschließenden Verwendung der hiPSC-Linien ab. Die Zellen wurden durch klonale Vermehrung auf hrLN-521-beschichteten Platten (Biolamina) in NutriStem hPSC XF Medium (Biological Industries) in einem 5% CO2 / 5% O2 Inkubator gehalten und alle 5-6 Tage enzymatisch im Verhältnis 1: 10 passiert.

Zur Passage wurden konfluente Kulturen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2+ und Mg2+ gewaschen und 5 min bei 37°C, 5% CO2/5% O2 mit TrypLE Select inkubiert. Das Enzym wurde dann vorsichtig entfernt und die Zellen wurden in frischem, vorgewärmtem NutriStem hPSC XF-Medium durch sanftes Pipettieren gesammelt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen wurden 4 min bei 300 × g zentrifugiert, das Pellet in frischem, vorgewärmtem NutriStem hPSC XF-Medium resuspendiert und die Zellen auf einer frisch hrLN-521-beschichteten Schale plattiert. Zwei Tage nach der Passage wurde das Medium durch frisches vorgewärmtes NutriStem hPSC XF Medium ersetzt und täglich gewechselt.

hPSC-RPE-Monoschicht-Differenzierung

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, das das Differenzierungsprotokoll beschreibt, finden Sie unter Protocol Exchange36. hESC oder hiPSC wurden mit einer Zelldichte von 2,4 × 104 Zellen/cm2 auf lamininbeschichteten Schalen (20 µg/ml) mit NutriStem hPSC XF Medium plattiert. Rho-Kinase-Inhibitor (Y-27632, Millipore) in einer Konzentration von 10 µM wurde während der ersten 24 h zugegeben, während die Zellen bei 37 °C, 5% CO2/5% O2 gehalten wurden. Nach 24 h wurde hPSC Medium durch Differenzierungsmedium NutriStem hPSC XF ohne basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGFß) (Biologische Industrien) ersetzt und die Zellen bei 37°C, 5% CO2/21%O2 platziert. Ab Tag 6 nach dem Plattieren wurden den Medien 100 ng/ml Activin A (R&D5) zugesetzt. Die Zellen wurden dreimal pro Woche gefüttert und 30 Tage lang aufbewahrt. Monoschichten wurden dann mit TrypLE Select (Gibco, Invitrogen) für 10 min bei 37°C, 5% CO2 trypsinisiert. Das Enzym wurde vorsichtig entfernt und die Zellen wurden in frischem vorgewärmtem NutriStem hPSC XF Medium ohne bFGF und TGFß durch sanftes Pipettieren gesammelt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen wurden 4 min bei 300 × g zentrifugiert, das Pellet resuspendiert, durch ein Zellsieb (ø 40 µm, BD Biosciences) geleitet und Zellen auf lamininbeschichteten Schalen (hrLN-111 und hrLN-521 bei 20 mg / ml) mit unterschiedlichen Zelldichten im Bereich von 1,4 × 106 bis 1,4 × 104 Zellen / cm2 ausgesät. Replizierte Zellen wurden während der folgenden 30 Tage dreimal wöchentlich mit NutriStem hPSC XF Medium ohne bFGF und TGFß gefüttert. Für die hPSC-RPE-In-vitro-Differenzierung in 3D-Suspensions-EBs folgten wir unserem zuvor veröffentlichten Protokoll10. Kurz gesagt, pluripotente Stammzellen wurden zur Konfluenz auf rhLN-521 kultiviert und manuell geschabt, um EBs unter Verwendung einer 1000 µL Pipettenspitze zu produzieren. Die EBs wurden dann in Suspension in Low Attachment Plates (Corning) mit einer Dichte von 5-7 × 104 Zellen/cm2 kultiviert. Die Differenzierung wurde in maßgeschneidertem NutriStem hESC XF-Medium durchgeführt, in dem bFGF und TGFß wurden zweimal wöchentlich mit Medienwechsel eliminiert. Zehn Mikromol Rho-Kinase-Inhibitor (Y-27632, Millipore) wurden den Suspensionskulturen nur während der ersten 24 h zugesetzt. Nach 5-wöchiger Differenzierung wurden pigmentierte Bereiche mechanisch mit einem Skalpell aus dem EBs herausgeschnitten. Die Zellen wurden dann mit TrypLE Select dissoziiert, gefolgt von einer Spülung durch eine 20 G Nadel und Spritze. Die Zellen wurden durch ein Zellsieb (ø 40 µm, BD Biosciences) auf LN-beschichteten Schalen mit einer Zelldichte von 0 ausgesät.6-1,2 × 104 Zellen/cm2 und zweimal wöchentlich mit dem oben genannten Differenzierungsmedium gefüttert. Hellfeldbilder wurden mit einem Nikon Eclipse TE2000-S Mikroskop aufgenommen und eine Canon SX170 IS Kamera wurde verwendet, um Pigmentierung von der Oberseite der Vertiefungen zu erfassen.

Quantitative real-time PCR

Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Plus Mini Kit isoliert und mit rnasefreier DNase (beide von Qiagen) behandelt. Komplementäre DNA (cDNA) wurde unter Verwendung von 1 µg Gesamt-RNA in 20 µL Reaktionsgemisch, enthaltend zufällige Hexamere und hochgestellte III-Reverse-Transkriptase (Gibco, Invitrogen), gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert.

Durchflusszytometrie

Die Zellsortierung wurde an hPSC-RPE-Kulturen nach 21 oder 30 Tagen Differenzierung durchgeführt. Zellen wurden mit den genannten konjugierten Antikörpern auf Eis für 30 min inkubiert. FMO-Kontrollen wurden für jede Bedingung eingeschlossen, um zu identifizieren und Gate-negative und -positive Zellen. Gefärbte Zellen wurden dann mit einem BD FACS Aria Fusion Cell Sorter (BD Biosciences) unter Verwendung der FACSDiva-Software v8.0.1 sortiert.

Gleich nach der Sortierung wurden 70.000 Zellen, verdünnt in 100 µL 2% igem FBS und 1 mM EDTA (Sigma), 5 min bei 400 upm auf Objektträger cytospinnt. Die Objektträger wurden über Nacht bei Raumtemperatur trocknen gelassen, gefolgt von Fixierung mit 4% methanolfreiem Formaldehyd bei Raumtemperatur für 10 min und Immunfluoreszenzfärbung.

Immunfluoreszenz

Histologie und Gewebeimmunfärbung

Unmittelbar nach Euthanasie durch intravenöse Injektion von 100 mg/kg Pentobarbital (Allfatal vet. 100 mg/ml, Omnidea) wurden die Augen enukleiert und der Bleb-Injektionsbereich mit grünem Gewebemarkierungsfarbstoff (TMD) (Histolab-Produkte) markiert. Eine intravitreale Injektion von 100 µL Fixierlösung (FS) bestehend aus 4% gepuffertem Formaldehyd (Solvenco AB) wurde vor der Fixierung in FS für 24-48 h und der Einbettung in Paraffin durchgeführt. Vier-Mikrometer-Serienschnitte wurden durch den TMD-markierten Bereich erzeugt und alle vier Abschnitte wurden mit Hämatoxylin–Eosin gefärbt.

Zur Immunfärbung wurden Objektträger in Xylol entparaffiniert, in abgestuften Alkoholen dehydratisiert und mit ddH2O und Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS, pH 7,6) gespült. Die Antigen-Retrieval wurde in 10 mM Citratpuffer (Trinatriumcitrat-Dihydrat, Sigma-Aldrich, pH 6,0) mit 1:2000 Tween-20 (Sigma-Aldrich) bei 96°C für 30 min erreicht, gefolgt von 30 min Kühlung bei Raumtemperatur. Objektträger wurden mit TBS gewaschen und für 30 min mit 10% normalem Eselsserum (Abcam) verdünnt in TBS mit 5% (w/v) IgG und proteasefreiem Rinderserumalbumin (Jackson Immunoresearch) in einer befeuchteten Kammer blockiert. In Blockierpuffer verdünnte Primärantikörper wurden über Nacht bei 4°C inkubiert: human nuclear mitotic apparatus protein (NuMA) (1:200, Abcam ab84680), BEST-1 (1:200, Millipore MAB5466), CD140b/PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) und CD56/NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, clone) (Ergänzende Daten 2). Sekundärantikörper (donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 555 A31572 und donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 A31571, beide von Thermo Fisher Scientific) (Ergänzende Daten 2) verdünnt 1:200 in Blockierpuffer wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden mit vector Vectashield mit DAPI ((4′,6-diamidino-2-phenylindol)) Montagemedium (Vector Laboratories) unter einem 24 × 50 mm2 Deckglas montiert.

Für die Immunhistochemie wurden Objektträger entparaffiniert, gefolgt von einer Antigen-Gewinnung (ER2-Lösung, pH 9, 20 min, Leica Biosystems) und Färbung (IHC-Protokoll F) für CD140b / PDGFRB (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-432) und CD56 / NCAM1 (1:100, Santa Cruz Biotechnology sc-7326, Klon) Antikörper (Ergänzende Daten 2) auf Bond RXm Instrument (Leica Biosystems).

Die Bilder wurden mit dem Fluoreszenz-Inversmikroskop Olympus IX81 oder dem konfokalen Punktrastermikroskop Zeiss LSM710-NLO aufgenommen. Die Post-Acquisition-Analyse der Bilder wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.

Phagozytose-Assay

Fluorescein-Isothiocyanat-markierte Rinder-POSS wurden isoliert und freundlicherweise von Dr. E.F. Nandrot vom Institut de la Vision, Paris37, gegeben. hPSC-RPE-Zellen wurden auf einer Transwell-Membran (0,33 cm2, Corning) kultiviert, die mit hrLN-521 20 µg / ml für 1 Monat nach der Aussaat beschichtet war. Die Zellen wurden bei 37 ° C oder 4 ° C für 16 h mit 2,42 × 106 aufgetautem POS / Transwell in DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) bzw. CO2-unabhängigen Medien (beide von Thermo Fisher Scientific) inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit Trypanblau-Lösung 0 abgeschreckt.2% (Gibco, Invitrogen) für 10 min bei Raumtemperatur, fixiert mit 4% methanolfreiem Formaldehyd (Polysciences) bei Raumtemperatur für 10 min und permeabilisiert mit 0,3% Triton X-100 in D-PBS für 15 min. Rhodamin-Phalloidin-Färbung (1:1000, 20 min bei Raumtemperatur, Biotinum 00027) (Ergänzende Daten 2) wurde zur Visualisierung der Zellgrenzen verwendet. Kerne wurden mit Hoechst 33342 (1:1000, 20 min bei Raumtemperatur, Invitrogen) angefärbt.

Die Bilder wurden mit dem Zeiss LSM710-NLO Point Scanning confocal Mikroskop aufgenommen. Die Post-Acquisition-Analyse der Bilder wurde mit Imaris (Bitplane) durchgeführt und POS-Quantifizierungen wurden mit der CellProfiler 2.1.1-Software durchgeführt. Verwendete Module: LoadImages, ColorToGrey, IdentifyPrimaryObjects, MeasureObjectSizeShape, SaveImages und ExportToSpreadsheet. Objekte wurden mit einem typischen Durchmesser von 10-40 Pixeleinheiten unter Verwendung von zwei Klassen identifiziert, Global, Otsu, gewichtete Varianzschwellenmethode mit 0,01 und 1,0 unteren und oberen Grenzen und 2,1 Korrekturfaktor, wobei verklumpte Objekte durch Intensität unterschieden wurden.

Enzymgebundener Immunosorbens-Assay

hPSC-RPE-Zellen wurden auf Transwell-Membranen (0,33 cm2, Millipore) kultiviert, die mit verschiedenen Substraten beschichtet waren. Überstände sowohl von der apikalen als auch von der basalen Seite des hPSC-RPE (d. h. obere und untere Kompartimente des Transwells) wurden 60 h nach dem Mediumwechsel gesammelt. PEDF-Sekretionsniveaus wurden in Triplikaten für jede Bedingung mit handelsüblichen humanen PEDF-ELISA-Kits (BioVendor RD191114200R) gemessen, die gemäß den Anweisungen des Herstellers nach 60 Tagen Kultur verwendet wurden. Die optische Dichte Sreadings wurden mit SpectraMax 250 Microplate Reader (Molecular Devices) gemessen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt.

TEER-Messungen

Transepithelialer elektrischer Widerstand RPE-Zellen, die auf Transwells (0,33 cm2, Millipore) plattiert sind, wurden mit dem Millicell Electrical Resistance System Volt-Ohm-Meter (Millicell ERS-2, Millipore) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Sechzig-Tage-Kulturen wurden außerhalb des Inkubators bei Raumtemperatur für 15-20 min vor dem Experiment äquilibriert. Die Messungen wurden in unveränderten Kulturmedien in dreifacher Ausfertigung für jede Bedingung an drei verschiedenen Positionen jeder Vertiefung durchgeführt. Mittelwerte wurden für die weitere Analyse verwendet. Die Hintergrundresistenz wurde aus einem leeren Kultureinsatz in den gleichen mit dem entsprechenden Substrat beschichteten Medien, jedoch ohne Zellen, bestimmt und von der jeweiligen Versuchsbedingung subtrahiert. Die Messungen werden als Widerstand in Ohm mal Fläche in Quadratzentimetern (Ω × cm2) angegeben. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt.

Rasterelektronenmikroskopie

hPSC-RPE-Zellen wurden 60 Tage lang auf mit LN521 (20 µg/ml) beschichteten Transwell-Inserts gezüchtet. Sie wurden durch Eintauchen in 2,5%igen Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 fixiert. Die Transwell-Membran wurde ausgeschnitten und in MilliQ Wasser gewaschen, bevor Ethanol schrittweise entwässert und mit Kohlendioxid (Leica EM CPD 030) kritisch getrocknet wurde. Die Inserts wurden mit Kohlenstoffklebelaschen auf Probenstummel montiert und mit einer dünnen Platinschicht (Quorum Q150T ES) sputterbeschichtet. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem Feldemissions-Rasterelektronenmikroskop Ultra 55 (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) bei 3 kV und dem SE2-Detektor aufgenommen.

Transmissionselektronenmikroskopie

hPSC-RPE-Zellen wurden 60 Tage lang auf mit LN521 (20 µg/ml) beschichteten Transwell-Inserts gezüchtet. Sie wurden durch Eintauchen in 2,5%igen Glutaraldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 fixiert. Die Transwell-Membran wurde ausgeschnitten und in dünne Streifen geschnitten, in 0,1 M Phosphatpuffer gespült, gefolgt von einer Nachfixierung in 2% igem Osmiumtetroxid in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, bei 4°C für 2 h. Die Membranstreifen wurden stufenweise Ethanol-dehydratisiert und schließlich flach in LX-112 eingebettet. Ultradünne Schnitte (~ 50-60 nm) wurden mit einem Leica EM UC7 hergestellt und mit Uranylacetat, gefolgt von Bleicitrat, kontrastiert. Die Transmissionselektronenmikroskopie wurde mit einem Hitachi HT7700 Transmissionselektronenmikroskop (Hitachi High-Technologies) durchgeführt, das bei 80 kV betrieben wurde, und digitale Bilder wurden mit einer Veleta CCD-Kamera (Olympus Soft Imaging Solutions) aufgenommen.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung bioinformatische Analyse

Sechzig-Tage-hPSC-RPE-Zellen wurden mit TrypLE Select dissoziiert und durch ein Zellsieb (ø 40 µm, BD Biosciences) geleitet. Sie wurden in einer Konzentration von 1000 Zellen/µl in 0,04% BSA in PBS resuspendiert. Die Zellen wurden bei 4 ° C zur Eukaryotic Single Cell Genomics Facility (ESCG, SciLifeLab, Stockholm, Schweden) transportiert, wo eine 3′ cDNA-Bibliothek für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung mit der 10x Genomics Platform (10x Genomics) unter Verwendung der NovaSeq 6000-Software vorbereitet wurde. Zelle Ranger 2.1.1 (10x Genomics) Pipeline wurde verwendet, um Illumina-Basisaufrufdateien in das fastq-Format zu konvertieren, Sequenzierungslesungen mit dem hg19-Transkriptom mit dem STAR aligner38 auszurichten und Feature-Barcode-Matrizen zu generieren. Cell Ranger-Qualitätskontrolle gefilterte Zellen (718, 810, 931 und 1129 zellhaltige Tröpfchen wurden für CD140b + GD2-, CD140b + CD184−, replierte 1: 20− und hESC-Proben erfasst) wurden in R Version 3.5.1 (R Core Team) 39 unter Verwendung von Seurat Suite Version 2.3.440,41 analysiert. Als weitere Qualitätskontrollmaßnahme wurden RPE-Zellen mit eindeutig exprimierten Genen (≥2000 bis ≤5000), UMIs (≥10.000 bis ≤30.000) und Prozentsatz der UMI-Zuordnung zu MT-Genen (≥0,025 bis ≤0,10) ausgewählt. In ähnlicher Weise hESC mit eindeutig exprimierten Genen (≥2000 bis ≤8000), UMIs (≥10.000 bis ≤80.000) und Prozentsatz der UMI-Zuordnung zu MT-Genen (≥0,025 bis ≤0,10). Dieser Filtrationsschritt führte zu einem endgültigen Datensatz von 616, 725, 779 und 905 Zellen für CD140b + GD2−, CD140b + CD184−, replierten 1: 20- und hESC-Proben. Vor der Dimensionalitätsreduktion durch Hauptkomponentenanalyse (PC) wurden die durch UMIs gesteuerte Zell–Zell-Variation der Genexpression, die mitochondriale Genexpression und die Zellzyklusstadien während des Datenskalierungsprozesses zurückgebildet42. Variable Gene in RPE-Proben wurden basierend auf ihrer normalisierten durchschnittlichen Expression und Dispersion ausgewählt (Expressionsgrenzwert = 0,0125-5 und Bodendispersionsgrenzwert = 0,5). Für die PC-Auswahl wurden die Ergebnisse der PCHeatmap-, jackStraw-, PC-Standardabweichungen- und Clustree-Analyse bewertet43. Die ersten 15 PCs wurden für die tSNE-Projektion44 und Clustering-Analyse verwendet (Auflösung = 0,1, Perplexität = 40).

Zellcluster wurden mit zwei Ansätzen analysiert. Top-Differential-Gene wurden zuerst für jeden Cluster mit Wilcoxons Rank-Sum-Test identifiziert. Sekundäre, Signaturgenexpression (Modul-Scores) wurde für undifferenzierte hESC und mehrere Zelltypen in der menschlichen Netzhaut berechnet. Zellen, die Mesodermmarker exprimieren, wurden manuell in einem separaten Cluster unter Verwendung interaktiver Plotfunktionen von Seurat unterteilt. Die Daten werden in ArrayExpress (EMBL-EBI) hochgeladen — siehe Details unten.

Tiere

Nach Genehmigung durch die Ethikkommission für Tierversuche im Norden Stockholms (DNR N25 / 14) wurden in dieser Studie 10 neuseeländische weiße Albino-Kaninchen (bereitgestellt von der Lidköpings Rabbit Farm, Lidköping, Schweden) im Alter von 5 Monaten mit einem Gewicht von 3, 5 bis 4, 0 kg verwendet. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Aussage für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung durchgeführt.

Subretinale Transplantation

hPSC-RPE-Monoschichten wurden mit PBS gewaschen, mit TrypSE inkubiert und zu Einzelzellsuspension dissoziiert. Die Zellen wurden in einer Neubauer-Hämozytometerkammer mit 0,4% Trypanblau (Thermo Fisher Scientific Corp.) gezählt, 4 min bei 300×g zentrifugiert und das Zellpellet in frisch filtersterilisiertem PBS auf eine Endkonzentration von 1000 Zellen/µL resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann aseptisch in 600 µL Einheiten aliquotiert und bis zur Operation auf Eis gehalten.

Die Tiere wurden durch intramuskuläre Verabreichung von 35 mg/kg Ketamin (Ketaminol, 100 mg/ml, Intervet) und 5 mg/kg Xylazin (Rompun vet. 20 mg/ml, Bayer Animal Health), und die Pupillen wurden mit einer Mischung aus 0,75% Cyclopentolat/2,5% Phenylephrin (APL) erweitert. Mikrochirurgische Eingriffe wurden an beiden Augen unter Verwendung einer 2-Port-25-G-Transvitreal-Pars-plana-Technik (Alcon Accurus, Alcon Nordic) wie zuvor beschrieben durchgeführt45. Die Zellsuspension wurde in eine 1 ml Spritze gezogen, die mit einem Verlängerungsrohr und einer 38 G Polytip-Kanüle (MedOne Surgical Inc) verbunden war. Ohne vorherige Vitrektomie wurde die Kanüle durch den oberen Temporaltrokar eingeführt. Nach der richtigen Positionierung der Spitze, die durch eine fokale Netzhautfackel festgestellt wurde, wurden 50 µL Zellsuspension (entsprechend 50.000 Zellen) langsam subretinal ~ 6 mm unterhalb des unteren Randes des Sehnervenkopfes injiziert, wodurch eine gleichmäßige Blase gebildet wurde, die unter dem Operationsmikroskop deutlich sichtbar war. Es wurde darauf geachtet, die Spitze während der Injektion innerhalb der Blase zu halten, um den Rückfluss zu minimieren. Nach dem Entfernen des Instruments wurde leichter Druck auf die selbstdichtenden nahtlosen Sklerotomien ausgeübt. Zwei Mikrogramm (100 µl) intravitreales Triamcinolon (Triescence, Alcon Nordic) wurden 1 Woche vor der Operation verabreicht, und es wurden keine postoperativen Antibiotika verabreicht.

Statistik und Reproduzierbarkeit

Für statistische Analysen wurden eine Zwei-Wege-Varianzanalyse und Post-hoc-Mehrfachvergleiche unter Verwendung der Tukey-Testkorrektur durchgeführt, um die In-vitro-Unterschiede der verschiedenen bewerteten und sortierten Dichten gegenüber den replierten Bedingungen in TEER- und PEDF-Sekretionsassays zu bewerten.

Alle Quantifizierungen wurden unblindet durchgeführt. Statistische Parameter einschließlich der Definitionen und des genauen Werts von n (z. B. Gesamtzahl der Experimente, Replikationen usw.), Abweichungen, P-Werte und die Arten der statistischen Tests sind in den Abbildungen, den entsprechenden Figurenlegenden und in diesem Abschnitt angegeben. Die statistische Auswertung erfolgte mit Prism 7 (GraphPad Software, Version 7.0c). In allen Fällen wurde eine statistische Analyse von Daten aus mindestens drei biologisch unabhängigen experimentellen Replikaten durchgeführt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden vor statistischen Tests geplant und die Zieleffektgrößen waren nicht vorgegeben. In Diagrammen angezeigte Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar. Alle gezeigten mikroskopischen Aufnahmen sind repräsentative Bilder von drei unabhängigen Experimenten, sofern nicht anders angegeben (z.B. Fig. 1c).

Berichtszusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.