Verwendung von ATP-Analoga durch Engineered CDKs

Wir haben mutierte ‚Shokat‘ -CDKs erzeugt, die Aminosäurenaustausch an einem konservierten sperrigen Rest in ihren ATP-Bindungstaschen enthalten. Im Falle von CDK2 und CDK3 war dies ein Phenylalanin-zu-Alanin-Austausch an Position 80, bezeichnet als CDK2 (F80A). Wir synthetisierten auch 12 ATP-Analoga, um festzustellen, ob die konstruierten CDKs diese Analoga verwenden können, um rekombinantes Retinoblastom (Rb) -Protein in vitro zu phosphorylieren, und fanden heraus, dass sie N6- (2-phenylethyl) -ATP (PE-ATP) am effizientesten verwendeten (Abbildung 1a und Daten nicht gezeigt). Obwohl sowohl Wildtyp- als auch Cyclin-E-CDK2 (F80A) normales ATP zur Phosphorylierung des Glutathion-S-Transferase (GST) -Rb-Proteins verwendeten, konnte nur die F80A-Kinase PE-ATP verwenden. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Cyclin E-CDK3 erhalten, aber in diesem Fall konnte die F80A-Mutante kein normales ATP mehr verwenden, obwohl die strukturelle Grundlage für diese Beobachtung unklar ist (Abbildung 1a). Diese Studien bestätigten, dass die Wildtyp- und Engineered-Kinasen die gewünschten ATP-Spezifitäten aufweisen.

Während die mutierten CDKs PE-ATP effizient zur Phosphorylierung von Rb in vitro verwendeten, scheiterten ähnliche Experimente mit radioaktiv markiertem PE-ATP in Zelllysaten, weil das markierte Phosphat durch eine Atpaseaktivität in den Lysaten von PE-ATP abgespalten wurde (Daten nicht gezeigt). Wir haben daher auf die Thiophosphatform des ATP-Analogons (PE-ATP-γ-S) umgestellt, die nicht durch Lysate hydrolysiert wurde (Abbildung 1b). Obwohl Kinasen ATP-γ-S oft weniger effizient nutzen als normales ATP, hat die Thiophosphorylierung in diesem Zusammenhang mehrere Vorteile. Erstens sind Thiophosphate stabiler und resistenter gegen Phosphatasen . Zweitens, da es keine vorbestehenden Thiophosphorylierungsereignisse in den Zellen gibt, liefert die Thiophosphatmarkierung einzigartige Marker für Proteine, die durch die mutierte Kinase phosphoryliert werden. Schließlich hat die Thiophosphatgruppe ähnliche chemische Eigenschaften wie die Sulfhydrylgruppe und ist chemischen Modifikationen zugänglich. Wir exprimierten und reinigten lösliche Wildtyp- und Cyclin-A-CDK2 (F80A) -Komplexe aus Bakterien und führten einen ähnlichen Rb-Kinase-Assay durch, um ihre Fähigkeit zur Verwendung von PE-ATP-γ-S zu testen. Wie in Abbildung 1c gezeigt, obwohl beide Kinasen ATP oder ATP-γ-S verwenden können, um GST-Rb-Protein zu phosphorylieren (wie durch seine Elektromobilitätsverschiebung angezeigt), kann nur die F80A-Mutante PE-ATP-γ-S verwenden.

Einstufige Reinigung thiophosphorylierter Peptide

Die Verwendung von Engineered CDKs und ATP-Analoga ermöglicht eine hochspezifische Substratphosphorylierung: Die nächste Herausforderung besteht darin, sie innerhalb eines komplexen Lysats zu identifizieren. Wir haben versucht, die Thiophosphat-Tags zu verwenden, um thiophosphorylierte Peptide nach Phosphorylierung und Verdauung der Lysate kovalent einzufangen und anzureichern. Ein zentrales Problem bestand jedoch darin, Thiophosphopeptide und cysteinhaltige Peptide chemisch zu unterscheiden. Obwohl ein chemoselektives Verfahren zur Anreicherung von Thiophosphopeptiden beschrieben wurde, erschwert die überwältigende Fülle von Cysteinresten in einem komplexen Proteingemisch diesen Ansatz . Wir verwendeten eine einfache Capture-and-Release-Methode, um thiophosphorylierte Peptide in trypsinisierten Zelllysaten selektiv zu isolieren (Abbildung 2a). Proteine innerhalb des Lysats wurden in vitro mit Cyclin A-CDK2 (F80A) und PE-ATP-γ-S phosphoryliert. Die Proteinmischung wurde anschließend verdaut und die resultierenden Peptide wurden mit Thiopropylsepharose 6B gemischt, einem aktivierten Disulfidharz, das sowohl cysteinhaltige Peptide als auch Thiophosphopeptide durch eine Disulfidaustauschreaktion einfängt. Da die traditionelle Dithiothreitol (DTT) -Elution beide Arten von gebundenen Peptiden freisetzt, nutzten wir die qualitativen Unterschiede zwischen harzgebundenen Thiophosphatpeptiden und cysteinhaltigen Peptiden an der Phosphorthiolatsulfidbindung bzw. Bei hohen pH-Werten wird die Phosphorthiolatsulfidbindung hydrolysiert und das Alkyldisulfid bleibt intakt . Die Behandlung des Harzes mit einer starken Base (wie Natriumhydroxid) setzt spezifisch Thiophosphopeptide frei (und wandelt sie auch in normale Phosphopeptide um), nicht jedoch die cysteinhaltigen Peptide, indem die Phosphorthiolatsulfidbindung hydrolysiert wird (Abbildung 2b). Da über Cystein gebundene Peptide im letzten Schritt nicht eluiert werden, können wir cysteinhaltige Thiophosphopeptide nicht zurückgewinnen. Darüber hinaus führt die Elution zum Verlust der Thiophosphatsignatur durch Umwandlung des Thiophosphopeptids in ein Phosphopeptid. Unsere Thiophosphopeptid-Isolationsmethode unterscheidet sich geringfügig von der von Blethrow et al. dadurch fangen wir die Thiophosphopeptide unter Verwendung der Disulfidaustauschchemie (Disulfidharz) anstelle der Alkylierung (Jodacetamidharz) ein und eluieren sie selektiv mit basischer Hydrolyse anstelle von Oxidation.

Um die Machbarkeit dieses Ansatzes zu testen, phosphorylierten wir GST-Rb mit Cyclin A-CDK2 (F80A) und PE-ATP-γ-S und wendeten unser Reinigungsverfahren auf einen Trypsin-Digest des Reaktionsgemisches an. Die isolierten Peptide wurden mittels Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (ESI-MS/MS) unter Verwendung eines Ionenfallen-Massenspektrometers analysiert. Peptide wurden identifiziert, indem die Tandem-Massenspektren mit einer humanen Proteinsequenzdatenbank (mit GST-Rb-Sequenz hinzugefügt) unter Verwendung einer Sequenzierungssoftware abgeglichen wurden . Das GST-Rb-Substrat enthält fünf Cysteine sowie sieben SP / TP-Stellen, die für die CDK-Phosphorylierung bevorzugt sind. Wir fanden mehrere Phosphopeptide, die nur und alle erwarteten Phosphorylierungsstellen enthielten (Tabelle 1). Weiterhin konnten keine cysteinhaltigen Peptide und nur sehr wenige unspezifische Peptide gefunden werden. Dies lieferte einen Proof-of-Principle für unsere groß angelegten Assays.

Identifizierung von humanen Cyclin A-CDK2 Substraten in Zelllysaten

Unser Ziel war es, potentielle Cyclin A-CDK2 Substrate auf einer proteomweite Skala. Um die Probenkomplexität zu reduzieren, haben wir das Gesamtzelllysat von HEK293-Zellen mittels Ionenaustauschchromatographie und Ammoniumsulfatfällung in 11 Fraktionen fraktioniert (Zusätzliche Datendatei 1). Anschließend führten wir an jeder Fraktion In-vitro-Kinase-Assays durch. Als Positivkontrolle fügten wir jeder Reaktion auch eine kleine Menge GST-Rb hinzu. Nach dem Verdauen der Reaktionsmischung mit Trypsin haben wir unser Reinigungsprotokoll angewendet, um die Thiophosphopeptide aus den Peptidmischungen zu isolieren. Die gewonnenen Peptide wurden einer Flüssigkeitschromatographie-MS / MS-Analyse und Datenbanksuche unterzogen. Aus jeder der Lysatfraktionen wurde eine unterschiedliche Anzahl von Peptiden und mindestens ein Rb-Phosphopeptid gewonnen (Zusätzliche Datendatei 2).CDKs phosphorylieren Proteine auf prolin-gerichtete Weise entweder auf Serin oder Threonin, und zahlreiche Studien unterstützen die Idee, dass das Motiv S / T-P-X-R / K das CDK-Konsensusmotiv darstellt. Aus den Phosphopeptiden identifizierten wir insgesamt 203 Proteine: 180 Kandidaten wurden innerhalb von SP- oder TP-Motiven phosphoryliert (prolin-gerichtet; Zusätzliche Datendatei 3). Diese Kandidatensubstrate repräsentieren ein breites Spektrum biologischer Prozesse, einschließlich Zellzykluskontrolle, DNA- und RNA-Metabolismus, Translation und Zellstrukturen (Abbildung 3). Insgesamt 96 von 222 (43%) der Prolin-gerichteten Stellen entsprachen dem bekannten CDK-Konsens (mit einem positiv geladenen Rest in der +3-Position). Interessanterweise enthielten etwa 24% der Prolin-gerichteten Stellen (53/222) einen positiv geladenen Rest entweder in der +4- oder +5-Position, was darauf hindeutet, dass dieses Motiv auch von CDK2 begünstigt werden kann. In der Tat, Blethrow et al. es wurde auch festgestellt, dass eine beträchtliche Anzahl von Cyclin-B-CDK1-Substraten Nicht-Konsensstellen enthält. Für die Peptide, die Nicht-Konsensstellen enthielten, fanden wir, dass etwa 50% der entsprechenden Proteine distal zu den Phosphorylierungsstellen mindestens ein K / RXLφ- oder K / RXLXφ-Motiv (wobei φ ein großer hydrophober Rest und X eine beliebige Aminosäure ist) trugen, und fast alle von ihnen trugen mindestens ein minimales RXL-Motiv (Zusätzliche Datendatei 3). Dies steht im Einklang mit der etablierten Idee, dass diese Motive die Bindung von Cyclin A-CDK2 an Substrate fördern . Zusätzlich zur Auswahl für Phosphorylierungen mit CDK-Konsensusmotiven identifizierten wir 28 Proteine, die zuvor als CDK-Substrate in Verbindung gebracht wurden (fett markiert in zusätzlicher Datendatei 3) . So wurden fast 15% unserer Kandidaten zuvor als CDK-Targets gefunden, was die Idee, dass unsere Methoden CDK2-Substrate einfangen und anreichern, weiter unterstützt. Schließlich wurden 43% der Phosphorylierungen, die wir gefunden haben, zuvor in groß angelegten In-vivo-Phosphoproteomanalysen identifiziert, was darauf hinweist, dass diese Phosphorylierungen nicht auf unsere In-Lysat-Bedingungen beschränkt sind .

Sowohl unsere Studien als auch die von Blethrow et al. verwendeten ähnliche Phosphopeptid-Isolationsschemata und verwandte Cyclin-CDKs, und wir gingen davon aus, dass es zu erheblichen Überschneidungen bei den Substraten kommen könnte, die in beiden Studien nachgewiesen wurden. Tatsächlich fanden wir fast 50% (30/68) der Cyclin-B-CDK1-Substrate in unserer Liste der Cyclin-A-CDK2-Kandidaten; daher sind diese Methoden robust und reproduzierbar (Zusätzliche Datendatei 4). Es gibt jedoch auch erhebliche Unterschiede zwischen den beiden Listen, und diese resultierten wahrscheinlich aus vielen Faktoren, einschließlich prozeduraler Unterschiede, verschiedener Zelltypen, unvollständiger Peptididentifikation durch MS und Substratspezifität, die durch die Cyclin- und / oder Kinase-Untereinheiten verliehen wird. Einige dieser Unterschiede können auch die unterschiedlichen biologischen Funktionen von Cyclin A-CDK2 und Cyclin B-CDK1 widerspiegeln. Zum Beispiel fanden wir neun Proteine, die an der Proteintranslation und / oder der Ribosomenfunktion beteiligt sind, aber keines dieser Proteine wurde mit Cyclin B-CDK1 gefunden, trotz ihrer relativ hohen Häufigkeit.

Obwohl wir eine Reihe bekannter CDK2-Substrate identifiziert haben, haben wir einige zuvor beschriebene CDK2-Substrate nicht identifiziert. Einige der oben aufgeführten Faktoren können auch dafür verantwortlich sein, dass in unseren Analysen keine bekannten CDK2-Substrate gefunden wurden. Darüber hinaus wären Substrate, die bereits durch endogene CDKs phosphoryliert wurden, in vitro nicht thiophosphoryliert worden. Es ist auch möglich, dass einige Proteine während der Lysatherstellung und / oder des Ultraschallschritts nicht solubilisiert und von unseren Analysen ausgeschlossen wurden. Schließlich ist es möglich, dass große Proteinkomplexe durch die Fraktionierungsverfahren vor der Kinasereaktion gestört wurden und dass Proteine, die nur im Rahmen dieser Komplexe durch CDK2 phosphoryliert werden, mit unseren Methoden nicht entdeckt werden können.

Wir fanden auch vier Phosphopeptide, die Cyclin A und CDK2 entsprachen, und 27 zusätzliche Phosphopeptide mit nicht-Prolin-gerichteten Stellen (Zusätzliche Datendatei 5). Wir vermuteten, dass diese Phosphopeptide aus der Auto-Phosphorylierung von Cyclin A-CDK2 und der Hintergrundphosphorylierung durch andere Kinasen resultierten, und andere haben über eine ähnliche Hintergrundphosphorylierung berichtet . Um diese Möglichkeiten zu testen, führten wir eine Kontrollkinase-Reaktion mit Cyclin A-CDK2 (F80A) und PE-ATP-γ-S ohne Zelllysatzusatz durch und konnten drei der vier Cyclin A-CDK2-Peptide zurückgewinnen (Zusätzliche Datendatei 5). Darüber hinaus, wenn wir eine ähnliche ‚Kinase-only‘ Reaktion in Gegenwart von γ-32P-ATP durchgeführt, beobachteten wir 32P Einbau in diese beiden Proteine in einer dosisabhängigen Weise (Zusätzliche Datendatei 6). Diese Experimente bestätigten, dass es in den ursprünglichen Assays eine Hintergrund-Auto-Phosphorylierung von Cyclin A-CDK2 gab.

Wir führten auch Kontrollkinasereaktionen mit den Lysatfraktionen GST-Rb ’spike-in‘ und PE-ATP-γ-S ohne Zusatz von Cyclin A-CDK2 durch. Diese ‚No-Kinase‘ -Kontrollreaktionen phosphorylierten 7 der 27 nicht-Prolin-gerichteten Phosphopeptide auf unserer Liste (Zusätzliche Datendatei 5), was darauf hindeutet, dass die meisten, wenn nicht alle dieser Phosphopeptide aus der Hintergrundphosphorylierung durch Kinasen resultierten, die das ATP-Analogon in begrenztem Umfang verwenden können. Beispielsweise enthalten die meisten dieser Peptide saure rückstandsgerichtete Phosphorylierungsstellen, die Caseinkinase-2-Motive sind. Kaseinkinase 2 ist insofern einzigartig, als sie sowohl GTP als auch ATP nutzen kann; Somit kann das aktive Zentrum die sperrigen ATP-Analoga wie PE-ATP aufnehmen. Wichtig ist, dass wir keine Rb-Phosphopeptide aus diesen Kontrollexperimenten gewonnen haben, was darauf hindeutet, dass es in unseren Assays keine unspezifische CDK-Aktivität gab. Wir fanden auch 44 unmodifizierte Peptide, von denen 12 Cysteinreste enthielten. Die Mehrzahl dieser Peptide stammte aus mehreren Lysatfraktionen (Zusätzliche Datendatei 2). Wir vermuten, dass diese auf eine geringe unspezifische Bindung von Peptiden an das Harz trotz strenger Waschbedingungen und im Falle der cysteinhaltigen Peptide auf eine geringe Hydrolyse der Alkyldisulfidbindung während des Elutionsschritts zurückzuführen sind. Zusammenfassend waren unsere Methoden sehr selektiv und unsere Studien identifizierten eine überraschend große Gruppe von Kandidaten für Cyclin A-CDK2-Substrate, von denen die meisten bisher nicht als CDK-Targets identifiziert wurden.

Validierung von Kandidaten-Substraten als Cyclin-A-CDK2-Targets

Wir haben verschiedene Strategien angewendet, um einige der neuartigen Kandidaten in unserer Liste als Cyclin-A-CDK2-Substrate zu validieren. Da unsere Proteinidentifikationen auf Peptidsequenzen basierten, bestätigten wir zunächst, dass Cyclin A-CDK2 drei Kandidaten voller Länge und native Kandidaten phosphorylierte, die über Epitop-Tags aus transfizierten 293 Zellen (EF2, TRF2 und RAP1) immunpräzipitiert wurden. Da diese Proteine nicht auf der Cyclin B-CDK1-Liste vorhanden waren , haben wir festgestellt, ob sie auch durch Cyclin B-CDK1 phosphoryliert werden. Jeder CDK2-Kandidat wurde sowohl von Cyclin A-CDK2 als auch von Cyclin B-CDK1 phosphoryliert, obwohl EF2 in geringerem Maße phosphoryliert war als TRF2 oder RAP1 (Abbildung 4a). Wir exprimierten auch TRF2, RAP1 und das ribosomale Protein RL12 als GST-Fusionen und reinigten sie von Escherichia coli. Als wir Cyclin A-CDK2 zur Phosphorylierung von TRF2 und RAP1 in vitro verwendeten, waren die Proteine stark phosphoryliert, und MS-Analysen ergaben, dass diese Phosphorylierungen an denselben Stellen auftraten, die wir ursprünglich identifiziert hatten (Abbildung 4b). Wir verwendeten auch Cyclin A-CDK2 und Cyclin B-CDK1, um GST-RL12 zu phosphorylieren, und fanden heraus, dass beide CDKs auch RL12 in vitro phosphorylierten (Abbildung 4c). Diese Studien bestätigen somit, dass die in unserem Bildschirm identifizierten Peptide Proteine darstellen, die zumindest in vitro durch Cyclin A-CDK2 phosphoryliert werden können. Obwohl wir qualitative Unterschiede in der Fähigkeit von Cyclin A-CDK2 und Cyclin B-CDK1 fanden, spezifische Proteine zu phosphorylieren, wurden die Kandidaten jeweils von beiden CDKs phosphoryliert. Da das Enzympräparat, das wir in diesen Studien verwendeten, einen Überschuss an freiem CDK2 (F80A) enthielt, haben wir die Möglichkeit in Betracht gezogen, dass einige Substratphosphorylierungen aus der Assoziation endogener Cycline mit CDK2 (F80A) resultieren könnten, das entweder monomer war oder sich während der Testbedingungen von Cyclin A dissoziiert haben könnte. Wir fanden heraus, dass die Menge an Cyclin B-CDK2 (F80A) -Aktivität in diesen Extrakten im Vergleich zu Cyclin A-CDK2 (F80A) vernachlässigbar war, und wir konnten keine Cyclin E-CDK2 (F80A) -Aktivität nachweisen (Zusätzliche Datendatei 7). Nichtsdestotrotz können wir die Möglichkeit nicht ausschließen, dass einige Peptide durch CDK2 (F80A) im Komplex mit einem endogenen Cyclin phosphoryliert wurden, und die Spezifität eines Kandidatensubstrats für Cyclin A gegenüber anderen Cyclinen, die CDK2 aktivieren, muss wie unten beschrieben validiert werden.

Validierung von RL12 als in vitro CDK2-Substrat

Die oben genannten Studien validierten mehrere neuartige Kandidaten, die in unserem Bildschirm als CDK2-Substrate in vitro identifiziert wurden. Um jedoch festzustellen, ob ein neuartiges Substrat auch in vivo durch CDK2 phosphoryliert wird, führten wir eine umfassendere Analyse des ribosomalen Proteins RL12 durch. Wir mischten zuerst Immunpräzipitate von epitopmarkiertem Cyclin A-CDK2 und RL12, die in menschlichen Zellen in Gegenwart von γ-32P-ATP exprimiert wurden, und fanden heraus, dass Cyclin A-CDK2 RL12 in vitro phosphorylierte (Abbildung 5a). Die Phosphorylierung wurde in einer Mutante RL12 weitgehend aufgehoben, wo das identifizierte Phosphoserin S38 durch ein Alanin ersetzt wurde, und es wurde wiederhergestellt, wenn S38 durch ein Threonin ersetzt wurde (Abbildung 5b). Wir verwendeten dann Phosphopeptid-Mapping, um das Peptid mit S38 zu identifizieren, und bestätigten, dass es direkt durch CDK2 in vitro phosphoryliert wurde (Abbildung 5c). Um zu testen, ob RL12 auch in vivo in CDK2-abhängiger Weise an derselben Stelle phosphoryliert wird, markierten wir Zellen metabolisch mit 32P-Orthophosphat und immunpräzipitierten Wildtyp oder RL12-S38A aus Zellen, die entweder Cyclin E-CDK2, katalytisch inaktives Cyclin E-CDK2 oder den CDK-Inhibitor p21 (zur Hemmung endogener CDKs) überexprimieren . Da wir die endogene RL12-Phosphorylierung aufgrund des Fehlens eines geeigneten Anti-RL12-Antikörpers nicht untersuchen können, wurde in diesen Studien die Phosphorylierung von ektopischem RL12 in vivo untersucht (diese Transfektionsbedingungen führten zu einer etwa fünf- bis zehnfachen Überexpression von RL12-mRNA (Zusätzliche Datendatei 8). Wir fanden heraus, dass Wildtyp-RL12, aber nicht RL12-S38A, in vivo phosphoryliert wurde (Abbildung 5d). Diese Phosphorylierung wurde in Zellen verstärkt, die Cyclin E-CDK2 überexprimierten, aber nicht inaktives Cyclin E-CDK2, und war in Zellen vermindert, die den p21-CDK-Inhibitor überexprimierten (der endogene Cyclin-CDKs hemmt; Abbildung 5d). Schließlich verwendeten wir Phosphopeptid-Mapping und Phosphoaminosäureanalysen von RL12-Protein, das aus den markierten Zellen immunpräzipitiert wurde, und bestätigten, dass die RL12-Phosphorylierung durch Cyclin E-CDK2 in vivo auch auf S38 auftrat (Abbildung 5e). RL12 S38-Phosphorylierung in vivo wurde auch in Phosphoproteomstudien berichtet .

Obwohl wir jeden der neuartigen Kandidaten, die wir bisher getestet haben, validiert haben, indem wir gezeigt haben, dass die Proteine in voller Länge durch CDK2 phosphoryliert werden, werden sich einige Kandidaten auf unserer Liste wahrscheinlich nicht als physiologisch relevante Cyclin A-CDK2-Substrate erweisen. Beispielsweise wurden die Kinasereaktionen in Lysaten durchgeführt, und in vivo kann eine subzelluläre Kompartimentierung den Zugang von CDK2 zu einigen Kandidaten einschränken. Darüber hinaus ist es möglich, dass andere zelluläre Kinasen in Bezug auf einzelne Substrate in vivo entweder redundant oder wichtiger als CDK2 sind. Es ist daher entscheidend, dass die Kandidaten in einem möglichst physiologischen Kontext rigoros bewertet werden. Zu diesem Zweck verwenden wir in laufenden Studien einen Gen-Targeting-Ansatz, um eine Teilmenge dieser Phosphorylierungsstellen in den endogenen Genen zu mutieren, um ihre physiologische Bedeutung zu untersuchen.