Abstract

Es wurde ein direktes und hochspezifisches Chemilumineszenz-Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (CL-ELISA)-Verfahren zur Überwachung von Chloramphenicol (CAP) in Kosmetika entwickelt. Der in dieser Arbeit für den direkten Immunoassay verwendete Anti-Chloramphenicol-Antikörper (mAb) könnte spezifisch an CAP binden, mit vernachlässigbarer Kreuzreaktivität (CR) (weniger als 0,01%) mit den meisten CAP-Analoga, einschließlich strukturell verwandtem Thiamphenicol (TAP) und Florfenicol (FF). Die Nachweisgrenze (LOD), gemessen mit IC10, betrug 0,0021 ng mL−1. Der Nachweisbereich (IC20-IC80) lag im Bereich von 0,00979 bis 0,12026 ng mL−1. In mit Spikes versehenen Kosmetikproben lagen die mittleren Gewinnungsraten zwischen 82,7% und 99,6%, wobei die Intraday- und Interday-Variation weniger als 9,8 bzw. 8,2% betrug. Darüber hinaus konnte das Verfahren mit Hilfe von HRP-markiertem Anti-CAP-mAb im schnellen direkten Immunreaktionsmodus verarbeitet werden. Diese CL-ELISA-Methode könnte für den spezifischen, schnellen, semiquantitativen und quantitativen Nachweis von CAP in Kosmetika eingesetzt werden, was die präzise Qualitätskontrolle der CAP-Kontamination erleichtert.

1. Einführung

Chloramphenicol (CAP) ist ein Mitglied der Amphenicol-Familie von antibakteriellen Wirkstoffen, und sie wurden von venezolanischen Streptokokken produziert (Struktur in Abbildung 1) . Chloramphenicol wird normalerweise als Breitbandantibiotikum mit wirksamer antimikrobieller Aktivität durchgeführt. Es kann gegen eine Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien, einschließlich der anaeroben Organismen, eingesetzt werden . Aufgrund der hohen Aktivität wird Chloramphenicol in der Viehzucht-, Aquakultur- und Kosmetikindustrie häufig zur Vorbeugung und Behandlung bakterieller Infektionen eingesetzt. In jüngsten Veröffentlichungen wurde berichtet, dass Chloramphenicol zur Behandlung von Epifollikulitis, Akne und anderen Hauterkrankungen eingesetzt wird. Das Chloramphenicol wurde auch in der Kosmetik als Antiseptikum zur Hemmung des Wachstums von Mikroorganismen eingesetzt .

Abbildung 1

Jüngste Untersuchungen zeigten jedoch, dass Amphenicol-Antibiotika potenzielle nachteilige Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit hatten . Daher sind die Anwendungen von Chloramphenicol in vielen Ländern verboten, darunter EU-Mitglieder, USA und China . Obwohl es offizielle Vorschriften für diese Antibiotika gibt, wird Chloramphenicol aufgrund seiner geringen Kosten und seiner hervorragenden antibakteriellen Wirkung immer noch illegal zu Kosmetika hinzugefügt. Um die Sicherheit von Kosmetika zu gewährleisten und die menschliche Gesundheit zu erhalten, ist es wichtig, empfindliche, zuverlässige und verfügbare Methoden zum Nachweis von Chloramphenicol auf Spuren in Kosmetikproben zu entwickeln.

Für den Nachweis von CAP und verwandten Antibiotika wurden zahlreiche Analysemethoden berichtet, wie z. B. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) , Gaschromatographie (GC) und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) . Diese Methoden erfordern jedoch hauptsächlich teure Instrumente, komplizierte Vorbehandlungsverfahren und gut ausgebildetes Personal und waren nicht für das schnelle Screening einer großen Anzahl von Proben geeignet. Immunoassays, die hauptsächlich auf der antikörper-Antigen-spezifischen Erkennung basieren, wurden für das Hochdurchsatz- und schnelle Screening von Zielanalyten eingesetzt. Chemilumineszierendes Substrat mit hochempfindlichem Charakter könnte in einer direkten chemilumineszierenden enzymgebundenen Immunosorbens-Assay-Plattform (CL-ELISA) eingesetzt werden. Im Vergleich zu herkömmlichen kolorimetrischen Protokollen konnte die Empfindlichkeit von Immunoassays mit Chemilumineszenz als Substrat um mindestens das 2- bis 3-fache verbessert werden.

Bisherige Literatur zum Immunoassay-Nachweis von CAP kann CAP aufgrund der hochspezifischen Antikörper nicht von seinen Analoga der Amphenicol-Familie (Abbildung 1), einschließlich Thiamphenicol (TAP) und Florfenicol (FF), unterscheiden . In diesen Untersuchungen ist es schwierig zu bestimmen, ob die Kontamination KAPPE, ihre Analoga oder Summe von ihnen, wenn ein positives Ergebnis. In dieser Forschung verwendeten wir einen hochspezifischen monoklonalen Anti-CAP-Antikörper (mAb), der an die CAP-Spezifität und vernachlässigbare CR-Werte für die meisten getesteten Analoga binden kann. Auf Basis dieses mAb wurde eine hochspezifische und direkte CL-ELISA-Methode zur Bestimmung von Spuren von CAP in Kosmetika entwickelt. Dieses entwickelte Protokoll benötigt keine komplexe indirekte Konjugationsreaktion mit HRP-markiertem Sekundärantikörper. Mit chemilumineszierendem Substrat konnte die Empfindlichkeit deutlich verbessert werden (schematische Darstellung in Abbildung 2). Unter Verwendung von HRP-markiertem Anti-CAP-mAb wurde der Assay im schnellen direkten Immunreaktionsmodus ohne komplexe Immunreaktionsverfahren durchgeführt. Diese CL-ELISA-Methode kann für den spezifischen, schnellen, semiquantitativen und quantitativen Nachweis von CAP in Kosmetika angewendet werden, und diese Arbeit wird zur Qualitätskontrolle und Regulierung von CAP beitragen.

Abbildung 2

2. Materialien und Methoden

2.1. Chemikalien und Reagenzien

Chloramphenicol (CAP), Ciprofloxacin (CIP), Florfenicol (FF), Penicillin (PEN), Ractopamin (RAC), Salbutamol (SAL), Sulfadiazin (SUL) und Thiamphenicol (TAP) Standards wurden von Sigma Aldrich (99% Reinheit, St. Louis, MO, USA) gekauft. CAP-konjugiertes Antigen und HRP-markierter CAP-Antikörper wurden von ZeYang Co. (Peking, China). Die Chemilumineszenz-Substratlösung SuperSignal wurde von Thermo Fisher (USA) erworben. Milli-Q-Synthesesystem wurde von Millipore (Bedford, MA, USA) zur Wasserreinigung erhalten. Andere Reagenzien (analytische Qualität) wurden von Beijing Reagent Corp. (Peking, China) gekauft.

2.2. Ausrüstung und Instrumentierung

Costar white opaque 96-well Polystyrol-Mikrotiterplatten (Costar Inc., Milpitas, CA, USA) wurden in dieser Arbeit verwendet. SpectraMax M5 Microplate Reader wurde von Molecular Devices (CA, USA) bezogen. Die Zentrifuge MIKRO 22R wurde von der Firma Hettich Laborapparate (Tuttlingen, Deutschland) bezogen.

2.3. Puffer und Lösungen

Für diesen entwickelten CL-ELISA-Assay wurden verschiedene Puffer und Lösungen für den Immunoassay hergestellt.

Phosphat-Puffer-Kochsalzlösung (PBS, 0,01M, pH 7,4): 8,0 g NaCl, 2,9 g Na2HPO4, 0,2 g KH2PO4 und 0,2 g KCl wurden in 1 L entionisiertem Wasser gelöst.

Blockierpuffer (pH 7,4): 0,5% Casein in 0,01 M PBS.

Beschichtungspuffer (pH 9,6): 1,59 g Na2CO3 und 2,93 g NaHCO3 wurden in 1 L entionisiertem Wasser gelöst.

Enzymverdünnungspuffer (pH 7,4): 5% fetales Rinderserum in 0,01 M PBS.

Waschpuffer (PBST): 0,01% Tween-20 in 0,01 M PBS.

2.4. Competitive Chemiluminescent ELISA (CL-ELISA) -Verfahren

Costar White opaque 96-well Polystyrol-Mikrotiterplatten wurden für die Immunoassay-Reaktion verwendet. 100 µL CAP-konjugiertes Antigen wurden in einer Endkonzentration von 0,00042 ng mL−1 in Beschichtungspuffer gelöst, der zugegeben und zur Beschichtung 20 h bei 4 °C inkubiert wurde. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurde zu jeder Vertiefung Blockierpuffer (150 µL pro Vertiefung) zugegeben und 1,5 h bei 37 °C inkubiert, um überschüssige aktive Stellen zu besetzen. Die beschichteten Platten wurden vor Gebrauch bei 4 ° C gelagert.

Zur CAP-Analyse wurden die beschichteten Mikrotiterplatten 30 min bei Raumtemperatur vorkonditioniert. Dann wurden 30 µL verarbeitete Proben oder CAP-Standard und 70 µL HRP-markierter Anti−CAP-Antikörper (2,46 ng mL-1), verdünnt mit Enzymverdünnungspuffer, nacheinander zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden zur direkten kompetitiven Reaktion 30 min bei 37°C inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen der Platte mit Waschpuffer wurde SuperSignal-Chemilumineszenzsubstratlösung (100 µL / Well) zugegeben und die Chemilumineszenzintensität jedes Well mit einem SpectraMax M5 Mikroplattenreader gemessen.

2.5. Standardkurve

Für die Auswertung von Kalibrierkurven wurden zehn verschiedene Konzentrationsstufen getestet. Die höchste Konzentration lag bei 1000 ng mL-1, und die folgenden Konzentrationen wurden seriell um ein Drittel der vorherigen verdünnt. Jede Konzentration wurde dreimal nach dem CL-ELISA-Protokoll durchgeführt.

B/B0 ist für das Chemilumineszenzverhältnis der Ergebnisse definiert. Hier steht B für die Chemilumineszenzintensität unterschiedlicher CAP-Standardkonzentration und B0 für die Chemilumineszenzintensität ohne CAP-Standard in jedem Test.

Standardkurven wurden ausgewertet, indem B/ B0 bei verschiedenen CAP-Standardkonzentrationen aufgetragen und die Daten mit Origin (Version 7.5, OriginLab, Northampton, MA, USA) an die folgende logistische Gleichung mit vier Parametern angepasst wurden: In dieser Gleichung steht A für die obere Asymptote (Chemilumineszenzverhältnis B/ B0 ohne CAP-Standard). B ist die Steigung der Kurve am Wendepunkt. C, das 50% der maximalen Absorption darstellt, ist der X-Wert am Wendepunkt. Und D ist die untere Asymptote (Hintergrundsignal).

2.6. Probenvorbereitung für die CL-ELISA-Analyse

Kosmetikproben (2,00 g ± 0,02 g) wurden präzise gewogen und in 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen überführt. Dann wurden 20 ml PBS zugegeben und für 30 s vortext, und dann Ultra-Beschallung für 3 min für die Extraktion von CAP. Jede Probe wurde bei 12000 g für 10 min bei 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt und durch eine 0,22 µm Membran filtriert. Dreißig Mikroliter-Aliquots des Überstandes jeder Probe wurden zu einer beschichteten 96-Well-Platte zur Analyse gemäß dem entwickelten CL-ELISA-Verfahren gegeben.

2.7. Genauigkeit und Präzision

Negative Primer Lotion Kosmetikproben wurden zuvor durch UPLC-MS/MS-Analysen bestätigt. Dann wurde jede Probe mit CAP−Standard in drei verschiedenen Konzentrationen von 5, 20 und 100 ng L-1 versetzt. Die Analyse erfolgte nach dem entwickelten CL-ELISA-Protokoll mit jeweils fünf Replikaten (n = 5). Die Konzentrationen der Proben wurden gemäß der Kalibrierungskurve berechnet, und die Genauigkeit und Präzision wurden auf der Grundlage der Wiederfindungen aller Proben bewertet.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Assay-Spezifität

Die Spezifität der Methode wurde durch Bewertung des Ausmaßes der Kreuzreaktivität (CR) mit strukturell verwandten Verbindungen von CIP, FF, PEN, RAC, SAL, SUL und TAP bewertet. Die CR-Werte wurden mit folgender Gleichung ausgewertet:In dieser Gleichung ist IC50 die halbe maximale Hemmkonzentration einer Substanz. Die Spezifitätsergebnisse des Anti-CAP-mAk sind in Tabelle 1 dargestellt. Aus den Ergebnissen wurden vernachlässigbare CR-Werte (weniger als 0,01%) für alle in dieser Studie untersuchten Analoga erhalten, einschließlich der strukturbezogensten TAP und FF. Daraus kann geschlossen werden, dass dieser entwickelte CL-ELISA-Assay für den spezifischen CAP-Nachweis eingesetzt werden könnte.

3.2. Optimierung des CL-ELISA-Verfahrens

Das Antigen-Antikörper-Verhältnis in einem kompetitiven Reaktionssystem beeinflusst die Immunreaktion signifikant. In diesem CL-ELISA-Protokoll wurde das Antigen-Antikörper-Verhältnis ausgewertet und optimiert. Antigen-Antikörper-Verhältnisse von 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, und 30:70 wurden untersucht. Die Ergebnisse wurden nach IC50 und RLUmax (maximum relative light units) optimiert und in Tabelle 2 dargestellt. Der IC50-Wert stieg mit zunehmendem Antikörperverhältnis signifikant an. Wenn das Antigen-Antikörper-Verhältnis 70: 30 betrug, wurde das empfindlichste Ergebnis mit dem niedrigsten IC50-Wert erhalten. Zusätzlich führte ein hoher Antikörperanteil zu einem hohen RLUmax-Wert. Für die getesteten Antigen-Antikörper-Verhältnisse waren jedoch alle RLU-Werte für den Nachweis von CAP geeignet. Aufgrund der hohen Empfindlichkeit des chemilumineszierenden Substrats gab es keinen offensichtlichen Unterschied des RLUmax-Wertes. In order to obtain the most optimized and sensitive result, an antigen to antibody ratio of 70:30 was adopted in this research.

3.3. Empfindlichkeit

IC50, LOD (gemessen mit IC10) und der Detektionsbereich (IC20−IC80) wurden aus der Sigmoidkalibrierungskurve erhalten, um die Empfindlichkeit des vorgeschlagenen CL-ELISA-Protokolls zu bewerten (Abbildung 3). In dieser Studie betrug die LOD 0,0021 ng mL−1, während der IC50-Wert 0,016 ng mL-1 für CAP betrug. Der Nachweisbereich dieser Methode betrug 0,00979-0,12026 ng mL-1. Im Vergleich zu etablierten Immunoassays zeigte diese Methode eine höhere Sensitivität und eine niedrigere LOD für CAP .

Abbildung 3

3.4. Genauigkeit und Präzision

Zur Genauigkeits- und Präzisionsuntersuchung wurden zuerst die Wiederfindungsraten von CAP in angereicherten Proben berechnet. Und die Genauigkeit und Präzision wurden mit jeweils fünf Replikaten an drei Validierungstagen bewertet. Bei drei verstärkten Konzentrationen von 5, 20 und 100 ng L−1 lagen die mittleren Wiederfindungsraten für CAP in mit Spikes versehenen Primer-Lotion-Kosmetikproben zwischen 82,7% und 99,6%. Die Intraday- und die Interday-Variation betrugen weniger als 9,8% bzw. 8,2% (Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt).

4. Schlussfolgerungen

In dieser Forschung wurde eine neuartige und hochsensitive CL-ELISA-Methode zur CAP-Detektion in Kosmetika entwickelt. Der im Assay verwendete mAb zeigte eine hohe Spezifität für CAP mit vernachlässigbaren CR-Werten für seine Analoga, insbesondere für die meisten strukturbezogenen TAP und FF. Auf der Grundlage dieses mAb könnte die vorgeschlagene CL-ELISA-Methode für den Nachweis von CAP spezifisch anstelle von Mischungen von CAP und anderen Analoga angewendet werden. Dies ist der erste Bericht eines CL-ELISA zur Bestimmung von CAP in Kosmetika. Die methode LOD war 0,0021 ng mL−1, IC50 war 0,016 ng mL−1, und die erkennung bereich war 0,00979−0,12026 ng mL-1. In den mit Spikes versehenen Kosmetikproben lagen die mittleren Wiederfindungsraten zwischen 82,7% und 99,6%, wobei die Intraday- und Interday-Variation weniger als 9,8% bzw. 8,2% betrugen. Der Assay bietet die Vorteile einer hohen Spezifität, Einfachheit, schnellen Analysezeiten und Kosteneffizienz. In Bezug auf seine Empfindlichkeit und Spezifität ist die entwickelte CL-ELISA-Methode den meisten gemeldeten Immunoassays für den CAP-Nachweis überlegen. Daraus kann geschlossen werden, dass diese entwickelte CL-ELISA-Methode für den spezifischen, schnellen, semiquantitativen und quantitativen Nachweis von CAP in Kosmetika eingesetzt werden könnte.

Datenverfügbarkeit

Die Daten, die zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels bestehen.

Danksagung

Wir danken LetPub (www.letpub.com ) für die sprachliche Unterstützung bei der Erstellung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National R&D Key Programme of China (Nr. 2017YFE0110800), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31871718) und der EU Horizon 2020 Research and Innovation action (Nr. 727864-EU-China-Safe) unterstützt.