Pilzwirt

Filamentöse Pilze können als Wirte für eine mikrobielle Karminsäure-Zellfabrik dienen, da sie in der Lage sind, eine ausreichende Versorgung mit Acetyl-CoA- und Malonyl-CoA-Bausteinen für die Synthese des Enzyms zu liefern Polyketid-Gerüst. Sie bieten auch die notwendige zelluläre Infrastruktur, um die ER-membrangebundene C-Glucosyltransferase UGT28 aufzunehmen. Da A. nidulans über einen gut entwickelten gentechnischen Werkzeugkasten verfügt, haben wir diese Art als Ausgangspunkt für die Entwicklung einer pilzlichen Karminsäure-Zellfabrik gewählt. Wie die meisten filamentösen Pilze ist A. nidulans in der Lage, eine Vielzahl von biosynthetisch vielfältigen Sekundärmetaboliten zu produzieren, einschließlich einer signifikanten Anzahl aromatischer Polyketide. Chiang et al. haben zuvor gezeigt, dass die Deletion der Gencluster, die für die Bildung der wichtigsten endogenen PKS-Produkte in A. nidulans11 verantwortlich sind, das Potenzial von A. nidulans als Zellfabrik für die heterologe Produktion von Polyketiden verbessert. Auf diese Weise werden die Pools an Acetyl-CoA- und Malonyl-CoA-Bausteinen vergrößert und die nachfolgenden chemischen Analysen zur Bildung neuer Produkte vereinfacht. Als ersten Schritt in Richtung einer Pilzzellfabrik für die Karminsäureproduktion haben wir daher die Biosynthesewege für die dominierenden aromatischen Polyketide eliminiert, die möglicherweise die Karminsäureproduktion stören und die Analyse und nachgeschaltete Reinigung erschweren könnten. Insbesondere wurden die Gencluster für die Produktion von Asperthecin, Monodictyphenon und Sterigmatocystin sowie die für die grüne Konidienpigmentbildung verantwortlichen Gene wA und yA in einem nicht homologen Endjoining defficient A. nidulans Hintergrund eliminiert. Neben dem erwarteten Mangel an Konidienpigmenten zeigte der resultierende Stamm NID2252 keine sichtbaren Auswirkungen auf Morphologie und Fitness (Ergänzende Datei, Abb. 1). Wir haben daher NID2252 als Referenzstamm und als Grundlage für den Aufbau einer Pilzzellfabrik zur Karminsäureproduktion verwendet.

Entwurf eines halbnatürlichen Weges für die Bildung von Flavokermesinsäureanthronen

Die größte Hürde für den Bau einer mikrobiellen Karminsäurezellfabrik war das Fehlen eines natürlichen PKS, das Flavokermesinsäureanthron synthetisiert, das erste mutmaßliche Zwischenprodukt im Weg. Um diese Einschränkung zu umgehen, verfolgten wir einen alternativen biosynthetischen Weg zur Herstellung dieses Polyketids. Das Octaketid-Flavokermesinsäure-Anthron mit seinem C7-C12-, C5-C14- und C2-C15-Cyclisierungsmuster könnte theoretisch in einem einzigen Schritt durch ein pilzliches nicht reduzierendes iteratives PKS vom Typ I gebildet werden, das eine geeignete Produktschablonendomäne besitzt (Abb. 1 links). In der Literatur sind solche Enzyme jedoch noch nicht beschrieben. Ein alternativer Mechanismus zur Bildung des Flavokermesinsäureanthrons besteht in einer zweistufigen Reaktion, bei der ein PKS eine nicht reduzierte lineare Octaketidkette synthetisiert, die anschließend durch transwirksame Cyclasen / Aromatasen in die gewünschte Struktur cyclisiert wird (Abb. 1 rechts). Reaktionen dieser Art existieren in der Natur z.B. im Actinorhodin (Act)-Weg in Streptomyces coelicolor12. In diesem Fall wird das Octaketid-Rückgrat durch ein bakterielles Typ-II-PKS-System mit mehreren Untereinheiten, KSa, KSß und ACP (das ACTK-PKS) synthetisiert, das durch actKR an Position C9 reduziert und anschließend durch die Aromatase / Cyclase, actARO / CYC und Cyclase actCYC2 gefaltet wird, um die tricyclische Verbindung 3,8-Dihydroxy-1-methylanthrachinon-2-carbonsäure (DMAC) zu erhalten 7. DMAC zeigt die gleiche Faltung wie Flavokermesinsäureanthron, ist jedoch an der C9-Position reduziert.

Von besonderem Interesse für die vorliegende Studie ist die ZhuI Cyclase und ZhuJ Aromatase aus Streptomyces sp. R1128, die zwei aufeinanderfolgende Cyclisierungsreaktionen nicht reduzierter linearer Polyketide zu Falten katalysieren, die denen von Flavokermesinsäureanhydrid ähneln13. Insbesondere ist die ZhuI-Cyclase für das Schließen des ersten Rings C7-C12 und die ZhuJ-Aromatase für das Schließen des zweiten Rings C5-C14 verantwortlich. Der dritte Ring, C2-C15, wird spontan gebildet. ZhuI und ZhuJ wurden zuvor in S koexprimiert. coelicolor mit dem Octaketid bildenden Typ II wirkt minimal PKS, was zur Bildung von Flavokermesinsäure führt, die in der Bakterienliteratur als 3,6,8-Trihydroxy-1-methylanthrachinon-2-carbonsäure (TMAC) bekannt ist14. Leider kann eine identische Strategie bei A. nidulans schwierig umzusetzen sein, da die minimalen Typ-II-PKSs trotz mehrerer Versuche nicht erfolgreich in heterologen Wirten außerhalb der Gattung Streptomyces implementiert wurden15. Und tatsächlich waren unsere Versuche, die Act-miniPKS in A. nidulans und Saccharomyces cerevisiae zu rekonstituieren, ebenfalls erfolglos (Daten nicht gezeigt). Ein alternativer Weg zur Bildung des benötigten nicht reduzierten Octaketids ist die Verwendung von Typ III PKS-Enzymen, die erfolgreich in Hefe exprimiert wurden, z.B. im Zusammenhang mit der Flavonoid-Biosynthese16. Von besonderem Interesse ist die Aloe arborescens Octaketide Synthase (OKS), die beschrieben wurde, um nicht-reduzierte Octaketide zu produzieren, die sich spontan in SEK4 und SEK4b in vitro17 falten (Abb. 2a). Bei Aspergillus blieb jedoch ungeprüft, ob die Produkte von Typ-III-PKSs, bei denen es sich um ACP-unabhängige Enzyme handelt, die Carbonsäuren freisetzen, durch den beschriebenen ZhuI-Cyclase-Typ, der auf ACP-gebundene Substrate wirkt, gefaltet werden können. In der aktuellen Studie haben wir uns daher vorgenommen, die Kompatibilität der pflanzlichen Typ III OKS mit der von Cyclasen / Aromatasen aus bakteriellen Typ II PKS-Systemen zu testen, mit dem Ziel, einen künstlichen de novo Biosyntheseweg für die Bildung des Flavokermesinsäureanthronvorläufers für die Bildung von Karminsäure zu entwickeln.

Herstellung von Polyketid-Precursoren für die Carminsäureproduktion in A. nidulans

Um die in vivo Performance von OKS in einem Pilzwirt zu testen, inserierten wir OKS gesteuert durch den A. nidulans gpdA Promotor als Einzelkopie in einen definierten Locus (Integrationsstelle 5, IS5) im A. nidulans genom18. Zwei Stämme wurden konstruiert, einer exprimiert die native OKS-kodierende Sequenz und einer exprimiert eine Codon-optimierte Version für die Expression in A. nidulans. Nach sieben Tagen Inkubation auf festen Wachstumsmedien, siehe Methodenabschnitt für Details, zeigten beide Stämme eine starke rotbraune Färbung des Myzels (Abb. 2b). Metabolisches Profiling durch HPLC-HRMS der Stämme ergab keine Spuren eines nicht reduzierten Octaketids, sondern die erwarteten SEK4 und SEK4b zusammen mit Flavokermesinsäure und drei anderen reichlich vorhandenen Verbindungen unbekannter Identität (Abb. 2c), die im NID2252-Referenzstamm nicht vorhanden waren. SEK4 und SEK4b wurden auf der Grundlage einer gründlichen HPLC-HRMS / MS-Analyse identifiziert (Ergänzende Datei, Abb. 2) und entsprach den zuvor gemeldeten Werten19, während Flavokermesinsäure mit einer aus D. coccus9 isolierten authentischen Referenz verglichen wurde (Ergänzende Datei, Abb. 3). Der Metabolit eluiert nach 13,0 min. hatte ein pseudomolekulares Ion+ von m/z 303.0867, entsprechend einer Summenformel von C16H14O6, die mit dem bekannten Octaketid-Shunt-Produkt Mutactin übereinstimmt, das zuvor in Streptomyces-basierten Experimenten mit dem Act-Gencluster7 beschrieben wurde. Diese Identifizierung wurde durch detaillierte Analyse des UV-Spektrums bestätigt und durch die Retentionszeit relativ zu SEK4 und SEK4b unterstützt (Ergänzende Datei, Abb. 4). Die beiden zusätzlichen Metaboliten mit den Summenformeln C16H12O6 (− m/z 299.0566) wiesen Octaketidprodukte auf, entsprachen jedoch keinem gemeinsamen Shuntprodukt (Ergänzungsdatei, Abb. 5). Daher wurden die Metaboliten isoliert und durch Strukturaufklärung anhand von 1D- und 2D-NMR-Experimenten als Dehydro-SEK4 (in der Bakterienliteratur auch als B26 bekannt) und Dehydro-SEK4b20 identifiziert (Ergänzende Datei, Abbildungen 6-11). Die Bildung der sechs neuen Polyketide, die im OKS-Stamm beobachtet wurden, kann durch drei verschiedene spontane erste Ringschlussreaktionen erklärt werden: C7-C12 (SEK4, Dehydro-SEK4 und Flavokermesinsäure), C10-C15 (SEK4b und Dehydro-SEK4b) und C7-C12 nach C9-Ketonreduktion (Mutaktin) (Abb. 2a und ergänzende Datei, Fig. 12). Von diesen ermöglicht nur der erste Ringverschlusstyp (C7-C12) die nachfolgende Bildung des gewünschten Flavokermesinsäureanthrons über einen zweiten C5-C14- und dritten C2-C15-Ringverschluss. Es wurde bereits berichtet, dass SEK4 und SEK4b spontan dehydrieren, um Dehydro-SEK4 bzw. Dehydro-SEK4b zu bilden, während die Bildung von Mutaktin von der enzymatischen Reduktion der C9-Position der Polyketidkette vor dem Falten abhängt21. Die Bildung von Flavokermesinsäure, einem bekannten Zwischenprodukt im Karminsäureweg (Abb. 1), war unerwartet, da nicht berichtet wurde, dass sich dieser Metabolit spontan aus nicht reduzierten Octaketidketten bildet. Dies deutet darauf hin, dass A. nidulans natürlich eine Reihe von Cyclasen / Aromatasen produziert, die das gewünschte Faltmuster fördern. Die Metabolitenprofilierung der beiden OKS-exprimierenden Stämme zeigte keine wesentlichen Unterschiede in den Produktionsniveaus und wir entschieden uns, uns auf den Stamm zu konzentrieren, der die native Version von OKS exprimiert, als Grundlage für die Weiterentwicklung einer Pilzzellfabrik für die Karminsäureproduktion.

Entwicklung des Faltungsweges nicht reduzierter Octaketide

Die promiskuitive Faltung des nicht reduzierten Octaketids verringert die Ausbeute an wünschenswerter Flavokermesinsäure. Wir stellten uns daher vor, dass die Produktion von Flavokermesinsäure erhöht werden könnte, indem der Faltungsprozess in die gewünschte Richtung rationalisiert wird, indem codonoptimierte Versionen von ZhuI und ZhuJ exprimiert werden. Um zu untersuchen, ob ZhuI und ZhuJ den nativen Metabolismus von A. nidulans stören, konstruierten wir zunächst Stämme, die ZhuI und ZhuJ einzeln und in Kombination aus definierten genomischen Loci (IS6 und IS7) im A exprimieren. nidulans NID2252 Referenzstamm. Metabolisches Profiling mittels HPLC-HRMS der drei Stämme ergab keine nachweisbaren metabolischen Unterschiede (Abb. 3b). Wir konstruierten dann einen Stamm, der OKS mit ZhuI coexprimiert, der die Cyclasen codiert, die die Bildung des ersten C7-C12-Ringverschlusses katalysieren (Abb. 3a). Im Vergleich zu dem Stamm, der nur OKS exprimiert, zeigte dieser Stamm einen 2,5-, 2,2- und 2,1-fachen Anstieg der Flavokermesinsäure-, SEK4- und Dehydro-SEK4-Spiegel. In Übereinstimmung mit ZhuI, der die Faltung in die gewünschte Richtung lenkte, gingen diese metabolischen Veränderungen mit verringerten Mengen an Metaboliten einher, die die unerwünschten ersten Ringfalten enthielten (Abb. 3b und Tabelle 1). Ein Stamm, der OKS und ZhuJ coexprimiert und für die Aromatasen kodiert, die den zweiten C5-C14-Ringschluss katalysieren (Abb. 3a) führte zu einem 2,7-fachen Anstieg der Flavokermesinsäurespiegel. Dieser Anstieg ging einher mit einer Verringerung der Spiegel von Metaboliten mit einer ersten C7-C12-Ringfalte (SEK4 und Dehydro-SEK4), während erwartungsgemäß die Spiegel von Metaboliten mit der unerwünschten ersten C10-C15-Ringfalte (SEK4b und Dehydro-SEK4b) nicht betroffen waren (Abb. 3b und Tabelle 1). Schließlich zeigte die Analyse des Stammes, der ZhuI, ZhuJ und OKS exprimierte, einen 4,1-fachen Anstieg der Produktion von Flavokermesinsäure im Vergleich zur alleinigen Expression von OKS. Darüber hinaus ist dieser Anstieg um 60% höher als bei den Stämmen, die OKS in Kombination mit ZhuI bzw. ZhuJ exprimieren (Tabelle 1). Dieses Ergebnis zeigt, dass die Cyclase und die Aromatase in additiver Weise in der Lage sind, den Fluss im künstlichen De-Novo-Weg zum gewünschten Produkt, Flavokermesinsäure, zu erhöhen (Abb. 3b).

Überraschenderweise und sehr ermutigend ergab eine weitere metabolische Analyse des Stammes, der OKS, ZhuI und ZhuJ koexprimiert, dass die erhöhte Bildung von Flavokermesinsäure mit der Produktion von Kermessäure einherging (Abb. 4). Daher A. nidulans liefert die notwendige Monooxygenase zur Umwandlung von Flavokermesinsäure in Kermessäure, die als letztes Zwischenprodukt im Karminsäureweg dienen kann (Abb. 1).

Herstellung von Karminsäure in A. nidulans

Der letzte Schritt der Karminsäurebildung ist die C-Glucosylierung von Kermessäure (Abb. 5a). Das verantwortliche Enzym für diesen Schritt im Karminsäure-Biosyntheseweg wurde zuvor in D. coccus identifiziert und durch heterologe Expression in S. cerevisiae8 charakterisiert. Wir fügten daher das UGT2-kodierende Gen, das für die Expression in A. nidulans optimiert ist, in den IS4-Locus des NID2252-Referenzstamms ein und vervollständigten den halbnatürlichen Karminsäure-Biosyntheseweg in A. nidulans in denselben Locus im Stamm, der ZhuI, ZhuJ und OKS coexprimiert. Die Expression von UGT2 allein im Referenzstamm beeinflusste weder das Aussehen der Wachstumsmediumfarbe noch das metabolische Profil von A. nidulans im Vergleich zum NID2252-Referenzstamm (Abb. 5b, c). Im Gegensatz dazu führte die Koexpression von OKS, ZhuI, ZhuJ und UGT2 zu einer roten Färbung des Mediums, was darauf hindeutet, dass ein wasserlöslicherer Farbstoff (e) gebildet wurde (Abb. 5b). Eine gezielte LC-HRMS-Analyse dieses Stammes bestätigte die Bildung von Karminsäure22 (Ergänzende Datei, Abb. 13), zusammen mit dcII9,23 und einem DCII-Isomer (Ergänzende Datei, Fig. 14), was zeigt, dass UGT2 in A funktionsfähig war. nidulans und konnte den Biosyntheseweg erfolgreich abschließen (Abb. 5c). Die positive Identifizierung von Karminsäure und dcII basierte auf ähnlichen Retentionszeiten, UV-Spektren, MS- und MS / MS-Fragmentierungsmustern für reine Standards der beiden Verbindungen. Drei Isomere der Karminsäure wurden in der Literatur beschrieben (Karminsäure, DCIV und DCVII) von Stathopoulou et al.23 zeigen alle drei unterschiedliche Retentionszeiten in der LC-MS/MS-basierten Analyse. In unserer Analyse fanden wir nur Karminsäure und nicht DCIV und DCVII basierend auf Retentionszeit und Fragmentierungsmuster von authentischem Karminsäurestandard, isoliert aus D. coccus (Ergänzende Datei, Abb. 13). Zusammen zeigen unsere Daten fest, dass es möglich ist, Karminsäure in A. nidulans basierend auf einem halbnatürlichen Weg zu produzieren.