Die Karotte (Daucus carota) ist eine im Winter gereifte zweijährige Pflanze, die wegen ihrer essbaren Pfahlwurzel angebaut wird. Es ist eines der am meisten konsumierten und produzierten Gemüse aufgrund seiner diätetischen Vielfalt in Farbe, Geschmack, Ballaststoffen und Vitamin A sowie seines Verzehrs sowohl in roher als auch in gekochter Form. Mehr als 20 Millionen Tonnen davon werden jedes Jahr für den menschlichen Verzehr produziert.

Gewebekulturpraktiken waren beim Klonen von Pflanzen sehr beliebt. Die erste Studie zur Karottengewebekultur wurde 1939 von Gautheret und Nobecourt berichtet. Steward et al. und Reinert berichtete von der ersten Studie zur „Karottenembryogenese“; Sie versuchten, die Wurzeln mit Zellsuspension und Kalluskulturen zu züchten.Die somatische Embryogenese ist eine effiziente Methode, um die biochemischen, physiologischen und genetischen Aspekte pflanzlicher Zellkultur zu verstehen und zu untersuchen.

Viele Studien zur Karottengewebekultur führten zur Entwicklung einer einfachen Methode der Embryogenese bei Karotten. Gemäß der Methode kann das Wachstum von Karottenkulturen induziert werden, indem nur das Hormon 2,4-D aus Zellsuspensionskulturen entfernt wird. Heute wird die Karotte häufig als experimentelles Modell für die Analyse der somatischen Embryogenese in verschiedenen Labors weltweit verwendet.

Material und Ausrüstung für die Einrichtung der Kultur erforderlich

Sterilisierte Materialien

• 5 Bröckelige Kalluskultur von Karotten, nicht kontaminiert und bei 25 ℃ gehalten.
• 5 Erlenmeyerkolben (250 ml), enthaltend Kulturmedium mit 5 x 10-8 g/ml 2, 4-D.
• 5 Messzylinder (100 ml) mit Folienkappen.
• 2 Spatel.
• 25 Blatt Aluminiumfolie (100 x 100 mm).
• 2 Stück Nylon- oder Edelstahlsiebe mit einer Porosität von 250 µm, die in die Öffnung der Messzylinder eingeführt werden können.
• 5 Petrischalen.

Nicht sterilisierte Materialien

• Wasserdichter Markierungsstift
• Rotationsschüttelmaschine
• Bunsenbrenner
• 1 Erlenmeyerkolben (150 ml) mit 95 % Ethanol
• Parafilm

Verfahren zur Initiierung und Etablierung der Kultur

1. Nehmen Sie die Röhrchen der Kalluskultur, sterilen Sie den Mund aller 5 Röhrchen und übertragen Sie den Kallus separat in die Petrischale (5 Kalli in 5 Petrischalen).
2. Nehmen Sie einen 250 ml kanonischen Kolben mit den Kulturmedien und 2, 4-D.
3. Übertragen Sie alle 5 Calli separat aus der Petrischale in 5 kanonische Flaschen.
4. Flamme/sterile die Mündung der Flaschen und decken Sie sie mit der Kappe. Sichern Sie die Kappe mit Parafilm.
5. Stellen Sie alle Flaschen, die die Kultur enthalten, bei dunkler oder geringer Lichtintensität bei 25 ℃ auf die Rotationsschüttelmaschine.
6. Nach 7 Tagen die Flaschen aus dem Shaker in einen sterilen Raum überführen.
7. Entfernen Sie den Parafilm und die Folienkappe von jedem Kolben und flammen / sterilen Sie die Mündung der Kolben.
8. Übertragen Sie die Suspension jedes Kolbens separat in einen sterilen 100-ml-Zylinder, indem Sie ihn durch ein Sieb passieren.
9. Den Inhalt 10 Minuten absetzen lassen und dann den Überstand verwerfen.
10. Die im Messzylinder verbliebenen Zellreste in einen 250 ml Kolben mit 60 ml frischem Medium überführen.
11. Wiederholen Sie Schritt 10 für jede Kulturflasche.
12. Stellen Sie alle fünf Flaschen wieder auf den Shaker.
13. Wiederholen Sie nach 7 Tagen den Vorgang, den Sie zuvor durchgeführt haben (ab Schritt 6-10). Nehmen Sie diesmal jedoch nur 1/5 der restlichen Zellen als Inokulum.
14. Wiederholen Sie den Vorgang etwa 3-4 mal. Auf diese Weise verbleiben nur einzelne Zellen oder kleine Aggregate in der Karottensuspension.
15. Für Karottenzellsuspension liegt die Anzahl geeigneter Zellen zwischen 105 und 3 x 105 Zellen/ml oder 100 und 300 mg (Frischgewicht) Inokulum in einem Volumen von 60 ml Frischmedium enthaltenden Medien und 5×10-8 g/ml, 2,4-D.
16. Eine Transferperiode von 7 Tagen ist angemessen, damit die Karotte Einzelzellen in der Suspensionskultur erhält.

Approximate Schedule of the Culture

Event	Timing (approximate)
Initiation of cell suspension and determination of total cell number and PCV (packed cell volume)	Day 0
First transfer of cultures	Day 8
Fourth transfer of cultures	Day 29

Result

What should you observe while experimenting? Hier sind einige Punkte zu beachten, während Sie Ihre Ergebnisse notieren.

• Datum und Dauer des Experiments.
• Die Anzahl der angewendeten Kulturen und Behandlungen.
• Morphologie und Anzahl der infizierten Kulturen im Abstand von drei Wochen aufzeichnen.
• Bestimmen Sie PCV (Packed cell volume) zu Beginn und am Ende des Transfers der Kultur.
• Schätzen Sie die Gesamtzahl der Zellen nach 3 Subkulturen an den Tagen 1, 2, 4 und 7 und zeichnen Sie ein Diagramm gegen die Zeit.
• Untersuchen Sie die Beziehung zwischen der Dichte des Inokulums und dem Wachstumsmuster.

Die Suspensionskultur bietet einen Vorteil gegenüber anderen Kulturen, da sie die Bewegung des Gewebes in den Kulturmedien ermöglicht, was den Gasaustausch erleichtert. Darüber hinaus entfernt es jegliche Polarität des Gewebe- und Nährstoffgradienten innerhalb und an den Medien.

Anwendung von Gewebekultur für Karotten

1. Zum Klonen der Pfahlwurzeln.
2. Um die mutierte Form der Karotten zu untersuchen.
3. Um die physiologischen Reaktionen der Karotte zu untersuchen, die auch das Verständnis anderer Pflanzen erleichtern können.
4. Um das Wachstum und die Entwicklung der Karotte aus einer Einzelzelle zu untersuchen.
5. Um die Stressreaktion der Karotte zu untersuchen, die einen Einblick in die Reaktionen anderer Pflanzen gibt.
6. Hunderte von transgenen Pflanzen aus der Suspension einzelner Zellen für experimentelle Zwecke zu erzeugen.

1. Reinert J. und Yeoman M. M. (1982). Pflanzenzell- und Gewebekultur: Ein Laborhandbuch. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, New York.
2. Hardegger M., Shakya R. (2004) Transformation von Karotte. In: K. S. (Hrsg.) Transgenic Crops of the World. In: Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-1-4020-2333-0_22.
3. Wachstum und Teilung von Karottenzellen in Suspensionskultur. (1970). Pflanzen- und Zellphysiologie. DOI:10.1093/oxfordjournals.pcp.a074564.
4. https://www.atzlabs.com/prodcut-info/C1955-Carrot-…