Ergebnisse

Modulation zellulärer p107-Spiegel durch kontrollierte Proteolyse. Wir haben zuvor gezeigt, dass das endogene p107, ein Mitglied der RB–Proteinfamilie, das kein natürliches Substrat von SCFßTrCP ist, in den C33A-Zervixkarzinomzellen durch die ektopische Expression einer chimären ßTrCP-Ubiquitin-Protein-Ligase (ßTrCP-E7N) eliminiert werden kann, die ein p107-bindendes Peptid trägt, das von den N-terminalen 35-aa-Resten des HPV-Onkoproteins E7 (E7N) abgeleitet ist (1). Die Funktionen vieler zellulärer Proteine werden jedoch durch ihre intrazelluläre Häufigkeit bestimmt und nicht nur durch ihre Anwesenheit oder Abwesenheit. Bisher gab es keine zuverlässige Methode, um die intrazellulären Proteinspiegel in Säugetierzellen präzise zu modulieren.

Wir untersuchten zunächst, ob die p107-Spiegel durch kontrollierte Expression unterschiedlicher Mengen an ßTrCP-E7N systematisch gesenkt werden können. Die humanen C33A-Zervixkarzinomzellen wurden mit steigenden Dosen von rekombinantem Adenovirus, das ßTrCP-E7N trägt, oder dem Kontroll-Adenovirus für 24 h infiziert. Die Infektion betrug 100%, selbst bei der niedrigsten verwendeten Dosis, gemessen an der Expression von GFP, die vom Adenovirus in allen Empfängerzellen übertragen wurde (Daten nicht gezeigt). Wie in Fig. 1 (Oben) wurden die endogenen p107-Spiegel systematisch auf 78%, 25% und 5% der Steady-State-Spiegel reduziert, wenn C33A-Zellen mit rekombinantem ßTrCP-E7N-Adenovirus bei Mois von 10, 35 und 80 transduziert wurden, jedoch nicht die gleichen Dosen von Ad1-Kontrollvirus. Daher bietet das Engineered SCFßTrCP-BP ein einfaches und reproduzierbares Mittel, um die Gesamtmengen an Zielproteinen auf definierte Mengen zu reduzieren, um die Dosiseffekte auf biologische Aktivitäten zu bestimmen.

P107 assoziiert stabil mit Cyclin A und Cdk2 über eine hochaffine Bindungsstelle in proliferierenden Zellen (13-15). Um zu untersuchen, ob diese p107-assoziierten Proteine auch durch ßTrCP-E7N gezielt abgebaut werden, wurde in C33A-Zellen, die mit dem Ad-F-TrCP-E7N-Virus infiziert sind, ein Immunoblotting durchgeführt. Wie in Fig. 1 blieben die endogenen Cyclin A- und Cdk2-Spiegel unverändert, während p107 dramatisch herunterreguliert wurde. Darüber hinaus wurden die Spiegel von nicht zielgerichtetem β-Aktin durch F-TrCP-E7N nicht beeinflusst (Abb. 1). Dieses Ergebnis lieferte einen starken Beweis dafür, dass die konstruierte ßTrCP-E7N–Ubiquitin-Protein-Ligase das Zielsubstrat p107 spezifisch abbaut, nicht jedoch die zugehörigen Proteine.

Selektiver Abbau einer spezifischen posttranslational modifizierten Subpopulation des Zielproteins. Die Modifikation eines zellulären Proteins auf der posttranslationalen Ebene, wie die Phosphorylierung, ist ein grundlegendes Mittel, mit dem Zellen die Funktion regulieren oder neue Aktivitäten des Proteins verleihen. Experimentelle Werkzeuge zur Analyse der Funktion, die mit einem bestimmten posttranslationalen Modifikationsereignis verbunden ist, sind derzeit begrenzt. Da Protein Knockout auf der posttranslationalen Ebene arbeitet, die Zielproteine direkt erkennt, besteht eine Anwendung darin, ein spezifisches E3 zu entwickeln, das in der Lage ist, eine Subpopulation posttranslational modifizierter Proteine für den Abbau auszuwählen, anstatt die gesamte Population zu zerstören.

Es wurde festgestellt, dass das HPV16 E7 selektiv an die hypophosphorylierte Form von RB (16) bindet. Wir untersuchten, ob die chimäre ßTrCP-E7N Ubiquitin-Protein-Ligase hypo- und hyperphosphoryliertes RB unterscheiden und nur die Hypoform für den Abbau selektieren kann. Die humanen U2OS-Osteosarkomzellen exprimieren beide Formen von RB, die aufgrund ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität auf SDS /PAGE leicht identifiziert werden können (Abb. 2A, Spur 1) (17). Die Identität dieser beiden RB-Spezies wurde weiter durch Immunoblotting unter Verwendung von Antikörpern verifiziert, die entweder für hypo- oder hyperphosphorylierte Formen von RB spezifisch sind (Abb. 2A, Spuren 2 und 3). U2OS-Zellen wurden 48 h lang mit den rekombinanten Ad-F-TrCP-E7N- oder den Kontroll-Ad1-Adenoviren infiziert, und die Steady-State-Spiegel von RB-P und RB wurden gleichzeitig durch Western-Blotting unter Verwendung eines monoklonalen Anti-RB-Antikörpers analysiert, der beide Formen erkennt. In Übereinstimmung mit der bevorzugten Bindung von E7N an hypophosphoryliertes RB führte die ektopische Expression von F-TrCP-E7N zur Elimination von hypophosphoryliertem RB, während das hyperphosphorylierte RB-P intakt blieb (Abb. 2B Oben, Fahrspuren 4-6 mit Fahrspuren 1-3 vergleichen). Dieses Ergebnis unterstreicht die Fähigkeit der technischen F-TrCP-E7N Ubiquitin-Protein-Ligase bei der Auswahl einer spezifischen Subpopulation von RB für den Abbau, die auf dem Status bestimmter posttranslationaler Modifikationen des Zielproteins beruhte.

HPV16 E7 in voller Länge konnte mit den Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitoren p21waf1 und p27Kip1 interagieren, aber die Bindungsdomäne wurde auf die C-terminale Domäne (Reste 40-98) anstelle des E7N-Fragments (Reste 18-20) abgebildet. Um die Spezifität von F-TrCP-E7N weiter zu untersuchen, wurden die gleichen U2OS-Zellextrakte auch mit Antikörpern gegen p21Waf1 und p27Kip1 untersucht. Wie in Fig. 2B (Mitte) blieben die Steady-State-Werte von p21Waf1 und p27Kip1 unverändert. Zusammengenommen zeigte das konstruierte F-TrCP-E7N eine proteolytische Spezifität gegenüber den Proteinen der RB-Familie, jedoch nicht gegenüber anderen Zellzyklusregulatoren wie Cdk2, Cyclin A, p21Waf1 und p27Kip1.

Strukturbasierte Mutagenese zur Erzeugung einer hochspezifischen ßTrCP-E7N Ubiquitin-Protein-Ligase. Das chimäre ßTrCP-E7N ist immer noch in der Lage, die endogenen ßTrCP-Substrate, einschließlich IkB, β-Catenin und ATF4 (3-7), zu binden. Eine Überexpression von ßTrCP-E7N könnte den Abbau dieser nativen Substrate stören. Umgekehrt könnte die Bindung des endogenen Substrats an ßTrCP-E7N die korrekte Positionierung des beabsichtigten Substrats zur Aufnahme von Ubiquitin aus dem Ubiquitin-konjugierenden Enzym beeinträchtigen und daher die Effizienz des gezielten Abbaus verringern (Abb. 3 Oben). Weiterhin interagiert ßTrCP mit einem Pseudosubstrat hnRNP-U, das ßTrCP und seine Derivate im Kern anbindet und deren Wechselwirkung mit den Substraten ausschließt (21). Durch die Einführung spezifischer Mutationen der Aminosäurereste auf ßTrCP, um seine Bindung an β-Catenin, IkB oder hnRNP-U zu eliminieren, erwarten wir, nicht nur die Spezifität, sondern auch die Verfügbarkeit des engineerierten ßTrCP-E7N zur Rekrutierung des beabsichtigten Substrats zu verbessern (Abb. 3ALower).

Die Substratbindungsdomäne von ßTrCP enthält sieben WD40-Wiederholungen in der C-terminalen Region, die sich in die typische siebenblättrige β-Propellerstruktur falten, die unter WD40-Proteinen konserviert ist (3-7). Da die Gesamtintegrität der β-Propellerstruktur von WD40-Proteinen für ihre Funktionen entscheidend ist, wird der Standard-Deletionsmutagenese-Ansatz wahrscheinlich grobe strukturelle Veränderungen induzieren und ist daher nicht anwendbar für die Definition von Substratbindungsstellen auf ßTrCP. Die bekannte Kristallstruktur von WD40-Proteinen kann jedoch ausgenutzt werden, um Oberflächenreste zu identifizieren, die an der Bindung von ßTrCP-Substraten beteiligt sind. Ein strukturbasierter Mutagenese-Ansatz wurde entwickelt, um fünf positiv geladene Reste (R285, K365, R474, R521 und R524) zu identifizieren und zu mutieren, die sich voraussichtlich auf der Oberseite des WD40-β-Propellers befinden und an der Bindung an WD40-assoziierte Proteine beteiligt sind (Abb. 3B) (22). Dieser Ansatz wurde in Supporting Methods beschrieben, das als Supporting Information auf der PNAS-Website veröffentlicht wird. Siehe auch Fig. 6, die als unterstützende Informationen auf der PNAS-Website veröffentlicht wird. Darüber hinaus werden Substitutionen dieser Lys / Arg-Reste die gesamte ßTrCP-Struktur wahrscheinlich nicht verändern.

Mit dem QuikChange Multisite-directed mutagenesis Kit (Stratagene) haben wir diese Reste gleichzeitig zu Glu mutiert. Diese FLAG-markierte Verbindungsmutante mit der Bezeichnung F-TrCP (m1) -E7N wurde auf ihre Bindung sowohl an die endogenen (IkB) als auch an die beabsichtigten (p107) Knockout-Ziele getestet. HeLa-Zellen wurden transient mit F-TrCP(m1) -E7N oder F-TrCP-E7N transfiziert und ihre Wechselwirkungen mit IkB und p107 wurden durch Coimmunpräzipitation bestimmt. F-TrCP-E7N und F-TrCP zeigten ähnliche Affinitäten zum phosphorylierten IkB-Protein, während die Mutationen der Verbindung m1 die Bindung von F-TrCP(m1)-E7N aufhoben (Abb. 3C Mitte). Im Gegensatz dazu wurden ähnliche p107-Spiegel in den Immunkomplexen von F-TrCP-E7N oder F-TrCP (m1) -E7N nachgewiesen (Abb. 3C unten), was darauf hinweist, dass die konstruierte F-TrCP (m1) -E7N–Ubiquitin-Protein-Ligase bei der Rekrutierung der beabsichtigten zellulären Ziele voll funktionsfähig ist. Diese Ergebnisse stimmen mit den strukturellen Vorhersagen in Fig. 3B, und definieren weiter die Aminosäurereste auf ßTrCP, die für die endogene Substraterkennung kritisch sind.

Das konstruierte F-TrCP(m1)-E7N wurde weiter auf seine Wirksamkeit beim Abbau von endogenem p107 analysiert. C33A-Zellen wurden mit F-TrCP, F-TrCP-E7N oder F-TrCP(m1)-E7N zusammen mit einem CD19-Expressionsplasmid kotransfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden Zellen geerntet und für diejenigen, die die transfizierten Plasmide erhielten, angereichert, indem die immunomagnetischen Kügelchen verwendet wurden, die mit dem monoklonalen Anti-CD19-Antikörper konjugiert waren. Endogene p107-Spiegel wurden anschließend durch Immunoblotting bestimmt. Wie in Fig. 3D, ektopische Expression von F-TrCP (m1) -E7N führte zu einer 95% igen Reduktion der endogenen p107-Spiegel, während eine 82% ige Herunterregulierung von p107 für F-TrCP-E7N beobachtet wurde (Abb. 3D Oben, vergleiche Bahnen 4 und 3). Darüber hinaus hatte die Expression von F-TrCP(m1) -E7N keinen beobachtbaren Effekt auf den durch den Tumornekrosefaktor (TNF) -α induzierten Abbau von IkB durch das native SCFßTrCP oder auf die Zerstörung von p27kip1 durch die SCFSkp2–Ubiquitin-Protein-Ligasen (Daten nicht gezeigt). Daher stört die ektopische Expression des engineerierten F-TrCP (m1) -E7N die gesamte SCF-Ubiquitinierungsaktivität nicht, indem die von den endogenen F-Box-Proteinen gemeinsam genutzten SCF-Kernkomponenten (Skp1, CUL-1 und Rbx1 / Roc1) unterdrückt werden.

Der gezielte p107-Abbau wurde in einzelnen C33A-Zellen durch indirekten Immunfluoreszenz-Assay weiter untersucht. Konsistent wurde p107 in C33A-Zellen, die F-TrCP-E7N oder F-TrCP (m1) -E7N exprimierten, weitgehend ausgerottet, jedoch nicht F-TrCP allein (Abb. 3E). Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass durch Eliminierung der Bindungsstellen der endogenen ßTrCP-Substrate die engineerierte F-TrCP (m1) –E7N-Ubiquitin-Protein-Ligase eine erhöhte Spezifität und robuste proteolytische Aktivität gegenüber dem beabsichtigten Ziel zeigte.

Minimale Bindungsdomäne als Targeting-Peptid für effiziente Substratrekrutierung. Um eine hohe Spezifität der Substratrekrutierung zu erreichen und das unspezifische Targeting anderer zellulärer Proteine zu minimieren, testeten wir, ob die minimale p107 / RB-Interaktionsdomäne von E7N (bezeichnet als E7m), die Reste 21-29 von E7 umfasst, die das LXCXE-Motiv überspannen (23), eine effiziente Bindung und Degradation von p107 erreichen könnte. Es wurde eine chimäre Ubiquitin-Protein-Ligase konstruiert, in der ßTrCP und E7m durch einen flexiblen 20-aa-Spacer kovalent miteinander verbunden waren, der aus 10 Kopien von Gly-Ser-Wiederholungen (bezeichnet als 10GS) bestand. Die F-TrCP-E7N oder F-TrCP-10GS-E7m wurden transient in C33A-Zellen transfiziert, und ihre Bindung an das endogene p107 wurde durch Immunpräzipitation in Extrakten beurteilt, die nach Behandlung mit dem Proteasominhibitor MG132 hergestellt wurden, um den Abbau als Folge dieser Wechselwirkung zu hemmen. Wie in Fig. 4A (Spuren 2 und 3), F-TrCP-10GS-E7m hatte eine leicht erhöhte Affinität zu p107 als die des ursprünglichen F-TrCP-E7N. Die F-TrCP-E7N und F-TrCP-10GS-E7m wurden weiter auf ihre Effizienz beim p107-Abbau durch transiente Transfektion in C33A-Zellen wie in Fig. 3D. Wie in Fig. 4B induzierten F-TrCP-E7N und F-TrCP-10GS-E7m eine bis zu 92% und 95% ige Herunterregulierung von p107, was darauf hindeutet, dass das konstruierte ßTrCP, das die minimale p107-Bindungsdomäne trägt, genauso effizient funktioniert wie das ursprüngliche F-TrCP-E7N beim Abbau von Zielproteinen.

Retroviral vermittelte Abgabe des manipulierten ßTrCP zum nachhaltigen Abbau endogener Ziele. Als nächstes untersuchten wir, ob die manipulierten Ubiquitin–Protein-Ligasen stabil exprimiert werden könnten, um einen nachhaltigen Abbau des beabsichtigten Ziels zu erreichen. Die HL-60 promyelozytären Leukämiezellen wurden mit den rekombinanten Retroviren transduziert, die PBMN-GFP, F-TrCP (m1) -E7N oder die Kontrolle F-TrCP-E7N (ΔDLYC) exprimierten, in denen die RB/ p107-Bindungsstelle deletiert war (1). Infizierte Zellen mit chromosomal integrierten chimären F-TrCP-Transgenen wurden durch FACS-Sortierung, basierend auf der Expression von GFP aus den Viren, isoliert und der Abbau des endogenen p107 aus infizierten HL-60-Zellen entweder unmittelbar nach der Infektion beurteilt (Abb. 5A) oder nach 3-monatiger Kultivierung im Wachstumsmedium (Fig. 5B). Da außerdem zwei weitere Mitglieder der RB-Familie, RB und p130, ebenfalls in HL-60-Zellen exprimiert werden, untersuchten wir, ob ein einzelnes F-TrCP-E7N gleichzeitig auf den Abbau der gesamten RB-Familie von Proteinen abzielen kann, die mit demselben LXCXE-Motiv von E7N interagieren. Die ektopische Expression von retroviral transduziertem F-TrCP-E7N induzierte eine dramatische Herunterregulierung der hypophosphorylierten Form von RB sowie von p107 (Abb. 5A) und p130 (Daten nicht gezeigt) in HL-60-Zellen, entweder unmittelbar nach Infektion und FACS-Sortierung (Fig. 5A) oder 3 Monate nach Infektion und kontinuierlicher Kultivierung (Fig. 5B, Spur 3). Im Gegensatz dazu hatte die stabile Expression von F-TrCP-E7N (ΔDLYC) in HL-60-Zellen keinen Einfluss auf die Veränderung von p107, RB (Abb. 5A, Spur 3) und p130-Pegel (Daten nicht dargestellt). In Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass F-TrCP-E7N hypophosphoryliertes RB in U2OS-Zellen bevorzugt abbaut (Abb. 2) war die Reduktion der hyperphosphorylierten RB-Spezies durch stabile Expression von F-TrCP-E7N weniger ausgeprägt als die der hypophosphorylierten Form in HL-60-Zellen (Abb. 5A, vergleiche Spur 2 von pRB und pRB-P).

Bei Behandlung mit All-trans-Retinsäure (ATRA) verlassen HL-60-Zellen den Zellzyklus und durchlaufen eine terminale Differenzierung. Es wurde eine Akkumulation von hypophosphoryliertem RB beobachtet, von der zuvor berichtet wurde, dass sie zu einem ATRA-induzierten Wachstumsstillstand beiträgt, während das hyperphosphorylierte RB nicht nachweisbar war (24, 25). Um zu untersuchen, ob die SCFßTrCP-Maschinerie auch während des Zellzyklusausgangs genutzt werden kann, wurden HL-60-Zellen, die F-TrCP-E7N oder F-TrCP (m1) -E7N stabil exprimieren, 72 h lang mit 1 µM ATRA behandelt und der Abbau der Proteine der RB-Familie bewertet. HL-60-Zellen, die F-TrCP-E7N stabil exprimieren, führten zu einer Abnahme der RB-, p107- und p130-Spiegel um 95%, 98% bzw. 85% im Vergleich zu Zellen, die mit dem Kontroll-pBMN-GFP-Virus infiziert waren (Abb. 5B, Spur 2). Da ATRA auch die Transkription von Genen unter der Kontrolle des Moloney murine leukemia Virus LTR von pBMN-GFP aktiviert (26), trug die erhöhte Expression von F-TrCP-E7N unter ATRA-Behandlung wahrscheinlich weiter zur effizienten Herunterregulation von p107, p130 und hypophosphoryliertem RB bei (Abb. 5B).

Die Wirkung der Proteine der RB-Familie auf die normale Zellzyklusprogression wurde in Mausembryo-Fibroblasten mit Störungen in RB-, p107- und p130-Genen untersucht und als unempfindlich gegenüber Signalen, die einen G1-Arrest induzieren, wie z Wachstumsfaktorinsuffizienz oder DNA-Schädigung (27, 28). Die kollektiven Auswirkungen der RB-Familienmitglieder auf die Tumorzellproliferation wurden jedoch aufgrund des Mangels an effizienten Reverse-genetischen Werkzeugen nicht untersucht. Die stabilen HL-60-Zellen, die F-TrCP (m1) -E7N aus dieser Studie exprimieren, ermöglichten es uns zu beurteilen, wie Tumorzellen, die für alle drei Proteine der RB-Familie defizient sind, auf G1-Arrest-Signale reagierten. In exponentiell wachsenden HL-60-Zellen, die F-TrCP (m1) -E7N exprimierten, das den konstitutiven Abbau der Proteine der RB-Familie induzierte, wurde eine deutliche Beschleunigung des Zellzyklusverlaufs im Vergleich zu denen beobachtet, die mit dem Kontroll-PBMN-GFP-Virus infiziert waren (Abb. 5C links). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der beeinträchtigten Kontrolle von G1–S–Übergängen, die bei RB– /–, p107– /– und p130– / – Triple Knockout-Mausembryo-Fibroblasten beobachtet wurden (27, 28).

Die ATRA-Behandlung inhibierte den G1-zu-S-Phasenübergang in HL-60-Zellen, die mit der Kontrolle pBMN-GFP infiziert waren (Abb. 5C) oder F-TrCP-E7N (ΔDLYC) -Virus (Daten nicht gezeigt), was mit dem übereinstimmt, was für nicht infizierte HL-60-Zellen berichtet wurde (Abb. 5C) (24). Eine anfängliche Verzögerung des G1-S-Übergangs wurde auch in pBMN-F-TrCP (m1) -E7N / HL-60-Zellen bei 48 h nach ATRA beobachtet. Ein vollständiger G1-Arrest konnte jedoch im späteren Stadium (72-96 h) nicht erreicht werden und die Zellen setzten den Verlauf der Zellzyklusprogression fort (Abb. 5C). Im Gegensatz dazu wurden die Kontroll-PBMN-GFP / HL-60-Zellen alle in G1 zwischen 72 und 96 h blockiert. Diese Beobachtungen legen nahe, dass der F-TrCP (m1) -E7N–vermittelte Abbau von RB-Familienmitgliedern ein spätes ATRA-Response-Ereignis beeinträchtigt, das für den Abschluss des Wachstumsstillstands erforderlich ist, während die frühe Abschwächung der G1-S-Progression weitgehend unbeeinflusst blieb. Darüber hinaus wurde eine dramatische Verringerung der Zellzahlen zwischen 72 und 96 h nach der ATRA-Behandlung aufgrund eines massiven Zelltods während des ATRA-induzierten Zellzyklusausgangs und der Differenzierung beobachtet (29). Auffallend ist, dass HL-60-Zellen, die F-TrCP (m1) -E7N exprimieren, in den subG1-Populationen im Vergleich zu den mit dem Kontrollvirus infizierten HL-60–Zellen (Daten nicht gezeigt) einen durchschnittlichen Anstieg um das 2– bis 3–fache zeigten, was mit dem erhöhten Zelltod in embryonalen Fibroblastenzellen der RB– /–, p107– /- und p130- /-Triple Knockout-Maus unter wachstumshemmenden Bedingungen übereinstimmt (28). Kollektiv induzierte die konstitutive Expression von F-TrCP (m1) -E7N eine Herunterregulierung der gesamten Proteine der RB-Familie, was zu einer Hemmung des Wachstumsstillstands und einer Zunahme des Zelltods bei ATRA-Behandlung führt.

ATRA-induzierter G1-Arrest beinhaltet die koordinierte Regulation mehrerer zellulärer Signale / Komponenten, die den Zellzyklus negativ steuern (überprüft in Ref. 30). Dimberg et al. (31) berichteten, dass ATRA eine Abfolge von Ereignissen in myeloischen Zellen auslöst, die einen frühen Anstieg der p21waf1-Expression, eine Stabilisierung von p27kip1 und später eine Dephosphorylierung von RB zu Beginn des G1-Arrests beinhalten. Da ßTrCP (m1) -E7N nur RB-Familienmitglieder abbaut und keinen Einfluss auf die Stabilität von p21waf1 und p27kip1 hat, ist es wahrscheinlich, dass nur die späte, RB-abhängige ATRA-Reaktion betroffen ist, die mit der Resistenz von pBMN-F-TrCP(m1) –E7N / HL-60-Zellen gegen vollständigen G1-arrestat72-96 h übereinstimmt (Abb. 5C). Die beobachtete frühe Wachstumshemmung durch ATRA nach 48 h (Fig. 5C) könnte zumindest teilweise auf die Hochregulierung von p21waf1 und p27kip1 zurückgeführt werden, deren Stabilität durch die konstitutive F-TrCP(m1)-E7N-Expression nicht beeinträchtigt wird (Fig. 2 und 5).