Laborhinweise für BIO 1003
© 30 August 1999, John H. Wahlert & Mary Jean Holland
ENZYME
Proteine, die als Katalysatoren wirken
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Zellen haben nicht die Möglichkeit, chemische Reaktionen durch Hitze und kräftiges Rühren zu beschleunigen, indem Atome und Moleküle häufiger und mit mehr Kraft aufeinander stoßen. Stattdessen stellen sie Proteinkatalysatoren her, die Enzyme genannt werden, die Oberflächen bereitstellen, auf denen Reaktanten in der richtigen Orientierung aufeinander treffen, und die Enzyme können sogar Bindungen schwächen, die gebrochen werden sollen. Enzyme haben eine hohe Spezifität – nur spezifische Reaktanten passen auf ihre Oberflächen und gleichen die lokalen Oberflächenladungen des Ortes aus, der als aktive Stelle bezeichnet wird. Der bestimmte Satz von Reaktanten für ein Enzym wird als Substrat (e) bezeichnet. Enzyme werden wie alle Katalysatoren nicht durch die Reaktion verändert, die sie katalysieren; wenn also alle Reaktanten in Produkte umgewandelt wurden, bleiben die ursprünglichen Enzymmoleküle erhalten.
Die Enzymfunktion hängt von der Umgebung ab, in der die Reaktion stattfindet. Faktoren wie Temperatur und pH-Wert können die Fähigkeit eines Enzyms, seine Arbeit zu erledigen, stark beeinflussen. Die folgende Versuchsreihe veranschaulicht die Prinzipien enzymatisch katalysierter Reaktionen in biologischen Systemen. Wir werden das in Pflanzen übliche Enzym Katecholase (oder Katecholoxidase) verwenden; Es ist in dem frisch gepressten Kartoffelsaft enthalten, der bereitgestellt wurde. Die Substrate der Katecholase sind Katechol und Sauerstoff. Die Substrate reagieren innerhalb des aktiven Zentrums des Enzyms miteinander. Die durch diese Reaktion gebildeten Produkte sind Benzochinon und Wasser; Da Benzochinon eine braune Farbe hat, können Sie sehen, dass die Reaktion stattgefunden hat. Dies wird als Fruchtbräunungsreaktion bezeichnet. Benzochinon hemmt das Wachstum von Mikroorganismen und verhindert, dass beschädigte Früchte verrotten. In unbeschädigten Zellen wird Katecholase in Vesikeln gespeichert und interagiert nicht mit Katechol.
In Gegenwart des Enzyms Katacholase:
catechol + ½O2 
Benzochinon + H2O
Mischen Sie in allen folgenden Experimenten die Zutaten wie angegeben und rühren Sie die Mischung mit einem Wirbelgeist um oder klopfen Sie auf die Seite des Röhrchens in Bodennähe. Inkubieren Sie Mischungen bei 40 Grad C, sofern nicht anders angegeben.
Wenn Sie an der Reinheit des Enzyms zweifelten, wie konnten Sie herausfinden, ob der Kartoffelextrakt neben Katecholase noch etwas anderes enthält?
I. Bildung und Nachweis von Benzochinon
Dieses Experiment legt die Standards für das Aussehen fest, wenn die Reaktion stattgefunden hat oder nicht. Verwenden Sie destilliertes Wasser, wenn H2O angegeben ist.
| Mix | Initial color | Color change (after 5 min) |
| 10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol (experiment) |
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| 10 drops potato extract with 10 drops H2O (control) |
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| 10 drops 1 % catechol with 10 drops H2O (Kontrolle) |
Wie würden Sie die Konzepte einer Kontrolle und eines Experiments definieren?
II. Enzymspezifität
Hydrochinon ist strukturell ähnlich, aber nicht dasselbe wie Catechol. In diesem Experiment werden wir sehen, ob das Enzym es auch in Benzochinon umwandeln kann oder ob das Enzym in seinem Design einfach zu spezifisch ist, um mit dem ähnlichen, aber nicht identischen Molekül zu interagieren.
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Mix |
Initial color | Color change (after 5 min) |
| 10 drops potato extract with 10 drops 1% catechol |
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| 10 drops potato extract with 10 drops hydroquinone |
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| 10 drops hydroquinone with 10 drops H2O (kontrolle) |
Kann das Enxyme Hydrochinon in Benzochinon umwandeln? Wie sind Sie zu diesem Schluss gekommen?
HINWEIS: IHRE GRUPPE WIRD ENTWEDER III ODER IV MACHEN – NICHT BEIDES.
Fragen Sie Ihren Laborlehrer, ob Ihre Gruppe III-Temperatur oder IV-pH-Wert durchführen wird.
III. Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität
Enzyme sind so konzipiert, dass sie innerhalb eines bestimmten Temperaturbereichs funktionieren. Sie können einige Vermutungen über das Ergebnis für die folgenden Temperaturen unten anstellen. Denken Sie daran, dass die Strukturen, die das Enzym produzieren, Obst und Kartoffeln sind; Auf der Celsius-Temperaturskala ist 0 Grad gefrieren, 22 Grad ist Raumtemperatur und 100 Grad kochen. Je heißer es ist, desto schneller schwingen und bewegen sich Moleküle. Kollisionen von Wassermolekülen mit dem Enzym könnten seine gefaltete Struktur rückgängig machen, die durch Wasserstoffbrückenbindungen in Position gehalten wird; Wenn dies geschieht, soll das Molekül denaturiert sein. Was würde in diesem Fall mit der aktiven Site passieren? Bei niedrigen Temperaturen bewegen sich Moleküle sehr langsam und die Wahrscheinlichkeit, dass sie kollidieren und miteinander reagieren, ist sehr gering. Beachten Sie, dass der Kartoffelextrakt auf Eis gehalten wurde. Warum?
Schreiben Sie Ihre Hypothese über den Einfluss der Temperatur auf die Enzymaktivität auf:
Stellen Sie 6 Paare Reagenzgläser mit 10 Tropfen Kartoffelextrakt in einem Satz und 10 Tropfen 1% Katechol in dem anderen auf. Inkubieren Sie sie für 5 Minuten, ein Paar in jeder der 5 unten angegebenen Temperaturumgebungen. Mischen Sie dann den Kartoffelextrakt und das Katechol zusammen; notieren Sie die Anfangsfarbe und setzen Sie dieses Rohr zurück in die Umwelt der kontrollierten Temperatur. Notieren Sie die Farbe nach 5 Minuten erneut.
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Temperatur |
Anfangsfarbe |
Farbwechsel |
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0 degrees C |
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22 degrees C |
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40 degrees C |
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60 degrees C |
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80 grad C |
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100 Grad C |
Stützen die Ergebnisse Ihre ursprüngliche Hypothese?
Die Temperaturen denaturieren das Enzym, so dass es sich nicht erholen kann.
Was ist der weiße Niederschlag, der sich bei 100 Grad C bildet?
IV. Einfluss des pH-Wertes auf die Enzymaktivität
Die pH-Skala misst die Anzahl der in Lösung vorhandenen Wasserstoffionen (jeweils mit einer Ladung von +1). Die Skala in biologischen Systemen reicht von 0 (stark sauer) bis 14 (stark basisch). 7, der neutrale Punkt, ist der pH-Wert von reinem Wasser. Es sei daran erinnert, dass die gefaltete Struktur von Proteinmolekülen zu einem großen Teil auf die Wasserstoffbindung zwischen entgegengesetzt geladenen Teilen der Polypeptidkette zurückzuführen ist. Andere Ionen in Lösung könnten die passenden Teile der Kette ersetzen und sie rückgängig machen. Wenn dies geschieht, was wird aus der aktiven Site?
Schreiben Sie Ihre Hypothese über die Wirkung des pH-Bereichs auf die Enzymaktivität auf:
Stellen Sie 7 Reagenzgläser mit jeweils 40 Tropfen einer anderen gepufferten pH-Lösung auf. Fügen Sie jeweils 10 Tropfen Kartoffelextrakt hinzu und rühren Sie um. Dann jeweils 10 Tropfen 1% Katechol zugeben und umrühren.
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pH |
Initial color |
Color change (5 min after adding catechol) |
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pH 2 |
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pH 4 |
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pH 6 |
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pH 7 |
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pH 8 |
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pH 10 |
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pH 12 |
Do the results support your hypothesis?
Bei welchem pH-Wert oder pH-Wertbereich funktioniert das Enzym am besten?
Warum verzögert das Auftragen von Zitronensaft auf frisch geschnittene Früchte die Bräunung?
V. Notwendigkeit von Cofaktoren für die Enzymaktivität
Viele Enzyme funktionieren nur, wenn ihnen ein Cofaktor zugeordnet ist. Katecholase benötigt Kupfer als Cofaktor. PTU ist eine Chemikalie, die eine höhere Affinität zu Kupfer hat als Katecholase und das Kupfer dem Enzym entzieht. Sie können beobachten, was mit der Funktion des Enzyms passiert, wenn sein Cofaktor entfernt wird. We refer to cofactors that our bodies need as vitamins and minerals.
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Mix |
Initial color |
Color change (5 min after adding catechol) |
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Tube A |
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Tube B |
Welche Röhre, A oder B, ist die Kontrolle in diesem Experiment?
