Das myeloische Kompartiment des angeborenen Immunsystems besteht aus einer Reihe von Zelltypen, deren Funktionen die Clearance geschädigter und apoptotischer Zellen, die Antigenpräsentation, die Immunsuppression und den Schutz des Wirts vor fremden Mikroorganismen umfassen.

Monozyten stellen eine hochplastische Untergruppe von Zellen dar, aus denen das angeborene Immunsystem besteht. Diese Zellen sind in der Lage, das Gefäßsystem zu durchqueren und werden, wenn sie bestimmten Zytokinen ausgesetzt sind, in verschiedene Zelltypen differenziert. Zirkulierende Monozyten werden entweder als nicht klassisch oder klassisch klassifiziert und können durch ihr Muster der Zelloberflächenrezeptorexpression unterschieden werden. Die klassischen Monozyten im Kreislauf weisen CD14+++Hi/CD16−/lo auf und sind vor allem an Infektions- oder Krankheitsstellen vorhanden (1,2).

Humane nicht-klassische Monozyten im Kreislauf zeigen CD16+++Hi/CD14+/lo Oberflächenexpression (1). Nach der Aktivierung erfahren Monozyten mehrere morphologische und biochemische funktionelle Veränderungen, was zu einer Differenzierung der Monozyten in neue Zelltypen wie Makrophagen führt (3).

In einem Paradigma, das als klassische Aktivierung bezeichnet wird, zeigen humane Monozyten phänotypische Plastizität, die durch Exposition gegenüber dem Th1—antwortfördernden Zytokin Interferon-γ (IFN-γ) oder dem Tumornekrosefaktor α (TNF-α) sowie dem Endotoxin-Lipopolysaccharid (LPS) ausgelöst werden kann (4,5). Dieser Mechanismus der klassischen Aktivierung erzeugt M1-Makrophagen, die entzündungsfördernde Mediatoren produzieren, die den Wirtsschutz gegen Bakterien und Viren bieten (6). Menschliche Monozyten können auch zu M2—Makrophagen differenziert werden, indem sie Th2-reaktionsfördernden Zytokinen wie Interleukin-10 (IL-10) und Transforming Growth Factor-β (TGF-β) ausgesetzt werden (4,7). M2-Makrophagen exprimieren hohe Spiegel an CD206 (Mannoserezeptor) und CD163, produzieren niedrige Spiegel an entzündungsfördernden Zytokinen und fördern die Wundheilung und den Matrixumbau.Dendritische Zellen (DCs) sind ein weiterer Satz von Monozyten-abgeleiteten Immunzellen, deren Funktion es ist, Antigene an T-Zellen zu präsentieren, um eine adaptive T-Zell-basierte Immunantwort zu initiieren. DCs können weitgehend in drei Untergruppen eingeteilt werden: klassische (CDCs), plasmazytoide (PDCs) und von Monozyten abgeleitete (moDCs). CDCs werden typischerweise im lymphatischen Gewebe, in der Milz, in den Lymphknoten und im Knochenmark gefunden. PDCs ähneln Plasmazellen und werden typischerweise im Blutkreislauf gefunden (8). Monozyten können nach Exposition gegenüber dem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulationsfaktor (GM-CSF) und IL-4 (9,10) in DCs differenziert werden, die häufig als Monozyten-abgeleitete DCs (moDCs) bezeichnet werden. Es wurde berichtet, dass moDCs in vitro die Zelloberflächenmarker CD80, CD83, CD86 und CD1a exprimieren (11-13). Während sich moDCs von Makrophagen in Zellform und -funktion unterscheiden, teilen sie die Expression mehrerer Zelloberflächenantigene, einschließlich CD11c, CD206 und CD1a (14).

Mehrere Gruppen haben über eine erfolgreiche Differenzierung von humanen CD14+-Monozyten in Makrophagen berichtet; viele dieser veröffentlichten Protokolle sind jedoch unterschiedlich. Eine häufige Variation unter diesen Methoden ist die Aufnahme (15) oder Auslassung (16) von IL-6. Ein weiterer Unterschied zwischen den Protokollen ist der Zeitpunkt der Behandlung. Dieser Mangel an Konsistenz zwischen den Protokollen ist problematisch.

Um diese Probleme anzugehen, untersuchten und verglichen wir die Aufnahme und Auslassung von IL-6 in die Zytokinbehandlung, die in gängigen Methoden zur Differenzierung humaner Monozyten verwendet wird. Wir fanden heraus, dass diese Strategien in Abwesenheit von IL-6 Zellen mit einem geringen Grad an Homogenität produzieren, was zu mehrdeutigen experimentellen Ergebnissen führen kann. Zweitens, um dieses Problem weiter anzugehen, entwickelten wir eine neuartige Phased-in-vitro-Strategie unter Einbeziehung von IL-6. Wir fanden heraus, dass diese Strategie die zelluläre Homogenität von M1- und M2-Makrophagen sowie von moDCs, die von humanen CD14 + -Monozyten differenziert waren, stark verbesserte. Diese Verbesserung der Methodik wird den Forschern bessere Modelle für die Untersuchung des Immunsystems und der Krankheitszustände liefern.

Materialien und Methoden

Zellpräparate

Buffy Coats wurden aus dem Vollblut von fünf oder mehr gesunden männlichen Spendern entnommen, die gepoolt worden waren. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus Buffy Coats durch Ficoll-Paque (1,077 g/ml Dichte) (17-1440-02; GE Healthcare Bio-sciences, Piscataway, NJ) Dichtegradientenzentrifugation bei 400 × g bei 18 °C für 35 min zur Abtrennung von Blutbestandteilen hergestellt. Die Zellen wurden mehrmals mit 1× PBS gewaschen und mit einem Nexcelom Cellometer Auto T4 plus Zellzähler (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA) gezählt. Nach der Zählung wurden CD14 + -Monozyten aus PBMCs durch magnetische Markierung unter Verwendung von MAb CD14-konjugierten Mikrokügelchen (130-050-201) isoliert; Miltenyl Biotec, San Diego, CA) und anschließender Separation mittels Magnetsäulen (130-042-401 und 130-042-302; Miltenyl Biotec) gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit einer Ausnahme: Bei der Entnahme von CD14+-Zellen aus der Magnetsäule wurden die Zellen zunächst mit 5 ml Puffer, der nur auf der Schwerkraft beruhte (ohne Verwendung des mitgelieferten Kolbens), ausgespült. Nach der anfänglichen 5-ml-Spülung wurde ein zusätzlicher 5-ml-Puffer zugegeben und vorsichtig mit dem mitgelieferten Kolben gespült.

Zellkultur

Humane CD14+–Monozyten wurden bei einer Zelldichte von 2,0-3 ausgesät.0 × 105 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium mit 2 mM/L L-Glutamin (Life Technologies, Frederick, MD) ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS (Sigma, Carlsbad, CA), 100 U/ml Penicillin (Life Technologies) und 100 mg/ml Streptomycin (Life Technologies) bei 37°C in einem befeuchteten 5% CO2 Inkubator. Zur Differenzierung von Zellen in M1-Makrophagen wurden als Zytokine GM-CSF (20 ng /ml) (PeproTech, Rocky Hill, NJ), IFN-γ (20 ng /ml), IL-6 (20 ng /ml) und Endotoxin LPS (20 ng / ml) verwendet. Für die M2-Makrophagen-Differenzierung wurden als Zytokine Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), IL-4, IL-6 und IL-13 in einer Konzentration von 20 ng/ml (PeproTech) verwendet. moDCs wurden durch Zugabe von GM-CSF (100 ng / ml) und IL-4 (20 ng / ml) erzeugt. Der Zeitpunkt jeder Strategie wird in Abbildung 1 näher beschrieben.

Durchflusszytometrie

Polarisierte Makrophagen und DCs wurden 9 Tage lang auf 10 cm2 Schalen (BD Falcon, Billerica, MA) kultiviert. Am Tag 9 wurden Medien und nicht adhärente Zellen gesammelt; Adhärente Zellen wurden mit 1 × PBS gewaschen, mit Zelldissoziationspuffer (Life Technologies) entfernt und dann zu den gesammelten Medien / nicht adhärenten Zellen gegeben, die gewaschen werden sollten. Suspendierte Zellen wurden zentrifugiert und zweimal gewaschen (1 × PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA), gezählt und dann mit fluorophorkonjugierten Primärantikörpern gegen CD206 (FITC), CD36 (PE), CD163 (PE-Cy7), E-Cadherin (AlexaFluor-488), CD86 (PE), CD1a (FITC), CD83 (PE), CD80 (PE), CD124 (PE) und CD64 (FITC) im Dunkeln für 45 min bei 4°C. Fluoreszenz wurde durch einen S3TM-Zellsortierer (Bio-Rad, Hercules, CA) nachgewiesen.

Endozytose-Assay

Polarisierte humane Makrophagen wurden in 4-Well-Kammer-Objektträger (MA Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific, Waltham, MA) mit einer Dichte von 3 plattiert.0 × 105 Zelle / ml am Tag 7 und weiterhin mit den entsprechenden Zytokinen für die verbleibenden 2 Tage kultiviert werden. Perylen-Bisimid (PBI-12-Man) (17) war ein freundliches Geschenk von Ke-Rang Wang an der Universität Hebei. Die Zellen wurden mit 10 µg/ml PBI-12-Man für 30 min bei 37°C kultiviert, dann mit 1× PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 70%igem Ethanol fixiert und mit DAPI (P36962; Life Technologies) montiert. Um die Endozytose von PBI-12 Man sichtbar zu machen, wurden Objektträger angeregt und bei 585 nm emittiert. Rote Fluoreszenzbilder wurden mit der Metafer Slide Scanning Software (MetaSystems, Boston, MA) quantifiziert. Statistische Tests wurden mit der Software MATLAB R2015a (The Mathworks, Inc., Natick, MA). Rangsummentests wurden durchgeführt, um die univariate statistische Signifikanz zwischen den Stichproben zu testen.

Immunfluoreszenz

Makrophagen wurden nach zuvor beschriebenen Methoden 7 Tage lang differenziert und anschließend mit den entsprechenden Zytokinen auf Nunc Lab-Tek II 4-well Glaskammerobjekte transferiert. Die Zellen wurden für die nächsten 7 Tage wachsen gelassen; 14 Tage nach dem ersten Plattieren wurden die Zellen mit 70% Ethanol fixiert und mit einem Diamant-Anti-Fade-Mountant mit DAPI montiert. Die Zellen wurden mittels Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie auf dem EVOS FL Auto (Life Technologies) visualisiert.

Ergebnisse und Diskussion

Strategien und Bedingungen für die Differenzierung humaner CD14+ -Monozyten

Wir haben zunächst untersucht, welche Strategien bei der Herstellung homogener Populationen humaner M1- und M2-Makrophagen sowie von moDCs am effektivsten waren. Humane CD14 + -Monozyten wurden isoliert und auf Gewebekulturplatten ausgesät, um in vitro in Makrophagen oder moDCs differenziert zu werden. Wir testeten dann drei spezifische Behandlungsbedingungen, um die Methode zu bestimmen, die die einheitlichsten Makrophagen- und moDC-Populationen ergab. Für die erste Bedingung kultivierten wir Zellen mit der Zugabe von nur GM-CSF oder M-CSF für 9 Tage (Abbildung 1). Diese Bedingung wird als „nur“ bezeichnet (Abbildung 1). Die zweite Behandlungsstrategie bestand darin, die Zellen am Tag 0 kontinuierlich dem entsprechenden Zytokinmilieu auszusetzen, die Medien, Zytokine und LPS am Tag 5 aufzufüllen und die Zellen am Tag 9 zu analysieren. Dieser Zustand wird als „kontinuierlich“ bezeichnet (Abbildung 1). Die dritte Strategie bestand darin, CD14 + -Monozyten entweder mit GM-CSF oder M-CSF für 5 Tage zu stimulieren, gefolgt von der Zugabe von frischen Medien, die LPS für humane M1-Makrophagen und alle anwendbaren Zytokine für eine bestimmte Behandlungsgruppe enthielten (GM-CSF, IFN-γ und IL-6 für M1-Makrophagen oder M-CSF, IL-4, IL-13 und IL-6 für M2-Makrophagen). Diese Behandlungsstrategie wurde als „phased“ bezeichnet (Abbildung 1). Die Behandlung von CD14 + -Monozyten mit 100 ng / ml GM-CSF und IL-4 für 5 Tage und der Austausch von Medien und allen Zytokinen am Tag 5 erzeugten moDCs. Die moDCs wurden dann vor der Analyse (Tag 8) 24 h lang mit IL-6 und LPS stimuliert, um die DC-Reifung und -aktivierung zu fördern. Diese Kultivierungsmethode wurde als „stimuliert“ bezeichnet (Abbildung 1). Die moDCs, die nie eine IL-6- und LPS-Exposition erhielten, wurden als „unstimuliert“ bezeichnet (Abbildung 1). Nach 9 Tagen Kultur unter den oben beschriebenen spezifischen Bedingungen wurden Zelloberflächenrezeptorexpression und Zellfunktionalität analysiert.

IL-6-Exposition erhöht die M2-Polarisationseffizienz in vitro

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Exposition von Makrophagen gegenüber dem Zytokin IL-6 nicht nur die Monozytendifferenzierung von einer dendritischen Zelle zu einem Makrophagen-Phänotyp verzerrt, sondern dass die IL-6-Exposition auch das mit M2-Makrophagen assoziierte mRNA-Expressionsprofil erhöht (15,18). Um diese Befunde zu bestätigen und die Wirkung von IL-6 auf die M1- und M2-Polarisation zu testen, wurden humane CD14 + -Monozyten unter den kontinuierlichen und phasenweisen Kultivierungsbedingungen mit oder ohne IL-6 behandelt. Die Untersuchung der M2-Makrophagen-Oberflächenmarkerexpression in M1-differenzierten Zellen zeigte keine signifikanten Veränderungen, wenn sie mit IL-6 kultiviert wurden (Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass die IL-6-Behandlung M1-polarisierte Makrophagen nicht in Richtung eines M2-Phänotyps leitet.

Umgekehrt ergab die Analyse der kontinuierlichen und phasenförmigen M2-Makrophagen-Kulturgruppen, dass die IL-6-Behandlung die Expression von M2-Makrophagen-Oberflächenmarkern erhöhte. In M2-Makrophagenpopulationen blieben sowohl die CD206- als auch die CD36-Expression hoch und erschienen unverändert, wenn sie IL-6 ausgesetzt wurden (Abbildung 2, A und B). CD163 und E-Cadherin zeigten jedoch einen signifikanten Anstieg der Oberflächenexpression und der Populationshomogenität, wenn sie mit IL-6 behandelt wurden (Abbildung 2, C und D). Dies wird durch eine Abnahme der niedrig exprimierenden CD163- und E-Cadherin-Peaks (rote Pfeile in Abbildung 2, C und D) und die daraus resultierende Verschiebung hin zu einer homogen hoch exprimierenden Population demonstriert.

IL-6 wird häufig verwendet, um die moDC-Reifung zu induzieren (18,19). Um festzustellen, ob eine IL-6-Behandlung zu unerwünschten moDCs innerhalb der Makrophagen-polarisierten Populationen führen könnte, wurde die Expression des DC-Oberflächenmarkers (CD83) untersucht. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass keine der M1- oder M2-Kulturbedingungen einen signifikanten Anstieg der CD83-Expression förderte (Abbildung 2E). Dies deutet darauf hin, dass es innerhalb dieser Makrophagenpopulationen keine moDC-Kontamination gab oder dass kontaminierende moDCs IL-6-unempfindlich waren.

Phased polarization leads to increased expression of canonical M1, M2, and moDC cell-surface markers

Um zu bestätigen, dass humane CD14+ -Monozyten bis Tag 9 vollständig in Makrophagen oder moDCs differenziert waren, wurde die Durchflusszytometrie verwendet, um Zelloberflächenmarker zu analysieren und morphologische Unterschiede zu bewerten (Abbildung 3, A-C). Humane CD14 + -Monozyten wurden differenziert (Abbildung 1), um zu beurteilen, welche Strategie zu einer hohen Expression zelltypgerechter Oberflächenmarker führen würde. Für jeden der Zelltypen wurde ein Panel von Zelloberflächenmarkern getestet. Unser M1-Zelloberflächenmarkerpanel bestand aus den kanonischen Markern CD86 und CD80 (Abbildung 3, A-C). Für das M2-Makrophagen-Panel verwendeten wir CD206, CD163, CD124 (IL-4-Rezeptor-α), E-Cadherin und CD36 (Klasse-B-Scavenger-Rezeptor) (Abbildung 3, A-C). Für moDCs wurden CD83, CD86 und CD1a verwendet. Oberflächenexpressionsniveaus für alle getesteten Marker wurden für alle Zelltypen bestimmt (Ergänzende Abbildung S1). Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) wurde berechnet und als Faltungsänderung relativ zur entsprechenden ungefärbten Kontrolle dargestellt (siehe Tabellen in Abbildung 3).

Interessanterweise ergab die Analyse der M2-Zelloberflächenmarker CD36 und IL-4Ra in den M1 GM-CSF-only polarisierten Makrophagen einen dramatischen Anstieg (Abbildung 3A). Beim Vergleich von GM-CSF-only-behandelten Zellen mit allen M1-Behandlungsgruppen hatte die GM-CSF-only-Gruppe eine deutlich höhere CD36-Expression. Diese GM-CSF- only-Zellen exprimierten auch niedrige Spiegel der M1-assoziierten Marker CD86 und CD80. In ähnlicher Weise ergab die kontinuierliche Bedingung Zellen, die nicht nur in CD86 und CD80 niedrig waren, sondern auch in CD36 und IL-4Ra Expression hoch waren. Umgekehrt, wenn menschliche CD14 + -Monozyten unter der M1-Phased-Bedingung differenziert wurden, waren CD86 und CD80 merklich hochreguliert, während die CD36- und IL-4Ra-Expression niedrig blieb. Eine weitere durchflusszytometrische Analyse der Zelloberflächenmarkerexpression ergab, dass M1-Makrophagen eine geringere Expression von CD206, CD36 und CD163 im Vergleich zu M2-Makrophagen sowohl unter phasenweiser als auch unter kontinuierlicher Exposition aufwiesen (ergänzende Abbildungen S1 und S4). Darüber hinaus erzeugen diese unterschiedlichen Kultivierungsbedingungen Zellen mit unterschiedlichen morphologischen Merkmalen und Strukturen (Abbildung 3A). Während die nur mit GM-CSF behandelten Zellen größer zu sein scheinen, zeigten die Vorwärtsstreuungsdaten (FSC) minimale Größenunterschiede zwischen den Gruppen (ergänzende Abbildungen S2 und S3). Der Vergleich der internen Komplexität (SSC) zwischen den Behandlungsbedingungen ergab eine Zunahme der Granularität in den GM-CSF- und Phased-Gruppen (Ergänzende Abbildung S2). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass GM-CSF-only und kontinuierliche Behandlung Zellen ergeben, die niedrige Spiegel von M1-Markern und hohe Spiegel bestimmter M2-Marker exprimieren und morphologische Veränderungen aufweisen.

Die M2-Makrophagen-Kultivierungsbedingungen ergaben etwas mehrdeutigere Ergebnisse als die M1-Makrophagen-Kultivierungsbedingungen (Abbildung 3B). Im Vergleich zur reinen M-CSF-Gruppe zeigten die Phased- und Continuous-Gruppen erhöhte Expressionsniveaus von CD206. Umgekehrt waren die IL-4Ra-Oberflächenspiegel unter reinen M-CSF-Bedingungen im Vergleich zu kontinuierlich und phased deutlich höher. Die E-Cadherin-Expression blieb über die Gruppen hinweg einheitlich, während CD163 sowohl in der M-CSF-only- als auch in der Phased-Gruppe signifikant höher war. Eine bemerkenswerte Beobachtung ist, dass die kontinuierliche Expositionsgruppe in Bezug auf die Expression von Zelloberflächenmarkern durchweg weit weniger homogen war. Dies wird durch die bimodale Verteilung und die große Varianz der Expressionsniveaus im Histogramm veranschaulicht. Zusätzlich können dramatische morphologische Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen beobachtet werden. Basierend auf den Phasenkontrastbildern erzeugte die M-CSF-only-Gruppe Zellen, die kleiner und hochgranular erscheinen (Abbildung 3B). Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass diese Zellen eine ähnliche Größe haben (FSC), jedoch gibt es eine Zunahme der zellulären Granularität in den Phasen- und kontinuierlichen Behandlungsbedingungen (Ergänzende Abbildung S2). Schließlich veränderte der Glutaminmangel die M2-Polarisation, was zeigt, dass Stoffwechselprodukte im Rahmen dieser Strategie notwendig sind (ergänzende Abbildung S5). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass die Phasenbedingungen die größte Effizienz für die M2-Makrophagenpolarisation ergeben.

Wir untersuchten dann die Oberflächenmarkerexpression von moDCs, die vor der durchflusszytometrischen Analyse 24 h nicht oder mit IL-6 und LPS stimuliert wurden. Die Stimulation mit IL-6 und LPS führte zu einem Anstieg der CD80-, CD83- und CD86-Expression (Abbildung 3C). Die Expression des reifen DC-Markers CD83 auf der Zelloberfläche nahm bei Aktivierung mit IL-6 und LPS am Tag 8 im Vergleich zur nicht stimulierten Gruppe dramatisch zu. Dies bestätigte, dass IL-6 und LPS in der Lage waren, die dendritische Zellreifung zu fördern (Ergänzende Abbildung S1L). Die CD1a-Expression blieb zwischen der nicht stimulierten und der stimulierten Gruppe einheitlich. Interessanterweise blieben die stimulierten DCs in Suspension, jedoch schienen sie zu beginnen, sich zu aggregieren und aneinander zu haften (Abbildung 3C). Diese Ergebnisse bestätigen frühere Erkenntnisse zur moDC-Polarisation und bieten eine zusätzliche Kontrolle für die Oberflächenmarkeranalyse, um unerwünschte moDC-Populationen unter den verschiedenen Makrophagen-Kultivierungsbedingungen zu identifizieren.

M2-Makrophagen, die durch Phased-Cytokin-Exposition erzeugt werden, besitzen eine M2-assoziierte Funktionalität

Der Mannose-Rezeptor (CD206) ist ein endozytärer und Recycling-Rezeptor, der in unseren M2-Makrophagen-Populationen unter Phased-Behandlungsbedingungen stark exprimiert wird. Als nächstes wollten wir die CD206-vermittelte endozytäre Aufnahme in unseren Makrophagen untersuchen. Dies wurde unter Verwendung von PBI-12-Man bestimmt, einem biokompatiblen Mittel, das bei Bindung an den Mannoserezeptor fluoresziert (17). Nach einer 1-stündigen Behandlung von M1- und M2-Makrophagen mit PBI-12-Man war die rote Fluoreszenz von PBI-12-Man in M2-Makrophagen unter Phasen- und kontinuierlichen Behandlungsbedingungen überwiegend intrazellulär (Abbildung 4, A und B). Dieser Befund legt nahe, dass die Bindung der Zelloberfläche an CD206 und die Endozytose zu einer vesikulären Lokalisation führen. Dies stimmt mit den vorherigen Daten aus der Durchflusszytometrie überein, die zeigten, dass die M2-Makrophagen unter phasenweisen Behandlungsbedingungen eine höhere Zelloberflächenexpression von CD206 im Vergleich zur M1-Makrophagenpopulation aufwiesen. Interessanterweise fanden wir heraus, dass GM-CSF-only-Zellen ein hohes Maß an PBI-12-Man-Endozytose aufwiesen (Abbildung 4, A und B). Dies korreliert mit unseren durchflusszytometrischen Daten (Abbildung 2), die zeigten, dass GM-CSF-only-Kultivierungsbedingungen M1-Zellen mit M2-assoziierter Oberflächenmarkerexpression produzieren. Insgesamt zeigen wir, dass diese Zellen die normalen Eigenschaften von Makrophagen besaßen und dass CD206 in der M2-Makrophagen-Population funktionsfähig war.

Nach 14 Tagen in Kultur zeigten M2-Makrophagen auch die Fähigkeit zur Fusion, erreichten eine Größe von über 200 µm und enthielten mehrere Kerne pro Zelle (Abbildung 4C). Diese ähnelten mehrkernigen Riesenzellen (MNGCs), von denen berichtet wurde, dass sie phagozytische und andere Fähigkeiten besitzen (20). Darüber hinaus wurden MNGCs mit Fremdstoffen im Körper, Tuberkulose und Krebs in Verbindung gebracht (20-23). Diese Zellfusion wurde ausschließlich in unseren M2-Makrophagenpopulationen gefunden und war im M2-Phasenzustand weitaus signifikanter. Während die M-CSF-only-Gruppen einige mehrkernige Zellen hatten (Abbildung 4C), waren ihre Größe und Anzahl viel niedriger als die Phased-Gruppe. Angesichts der Fähigkeit dieser Zellen, diese Makrophagen-assoziierte Funktion auszuführen, weisen diese Ergebnisse weiter darauf hin, dass die phasenweisen Kultivierungsbedingungen hochgradig M2-ähnliche Makrophagen produzieren.

Hier haben wir unser neu entwickeltes Phased Protocol für die Makrophagenpolarisation beschrieben. Wir fanden heraus, dass der Einschluss von IL-6 und das Timing der Phasenpolarisationsbehandlung absolut entscheidend für die Erzeugung der meisten M1- und M2-ähnlichen Makrophagen in vitro sind. Dieser Befund wurde im Vergleich zu anderen Polarisationsmethoden streng getestet. Aus diesem Grund glauben wir, dass die Phasenpolarisationsmethode einen wesentlichen Fortschritt darstellt. Dies gibt den Forschern einheitliche experimentelle Standards, um homogene Populationen von Makrophagen zu produzieren, die in vitro verwendet werden können, und die Möglichkeit, ihre Ergebnisse zu vergleichen. Dieses Protokoll bietet zwar eine Reihe von Verbesserungen im Vergleich zu aktuellen Polarisationsstrategien, Wir glauben jedoch, dass zusätzliche Forschung und Optimierung der Expositionszeiten und des Zytokincocktails nützlich wären. Dies wird uns helfen, die komplexen Rollen von M1- und M2-Makrophagen bei verschiedenen Formen des Krankheitsverlaufs weiter zu verstehen und die Entwicklung neuartiger Therapeutika voranzutreiben.