Verbindungen

ALDH1A1-Inhibitoren wurden kürzlich beschrieben30. LDHA-Inhibitoren wurden zuvor in Rai et al.29. IDH1-Inhibitoren wurden zuvor in Urban et al. und Davis et al.24,36. Andere in der Studie verwendete Verbindungen waren Methotrexat (MedChem Express, HY-14519), Panobinostat (Selleck Chem, S1030), AG-221 (MedChem Express HY-18690), Isofagomin (Toronto Research Chemicals # I816010), Lumacaftor (BioVision # 2857) und LY2857785 (Medchem Express, HY12293). Für qHTS wurden Verbindungen in der Mechanism Interrogation Plate (MIPE) in 11 Punkten (Intraplatte, 1: 3 Verdünnungsfaktor) getestet. Die Kinase-Inhibitor-Sammlung mit 977 Kinase-Inhibitoren wurde in 7-Punkt-Dosen (Interplate, 1:5 Verdünnungsfaktor) getestet. In allen Fällen wurde DMSO als Fahrzeug verwendet.

Klonen

pcDNA3.1-based vectors were created for N- and C-terminal tagging by linearizing pcDNA3.1(+) with NheI and EcoRI and inserting the peptide tag using an oligonucleotide duplex and In-Fusion reagents (Clontech). For the C-terminal tag, the duplex was: Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCAACTAACGGATCCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAA GGCGCGCCGAATTCTGCAGATAT-3′ and Antisense: 5′- ATATCTGCAGAATTCGGCGCGCCTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGGATCCgttagttGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. Notably, the first amino acids of the peptide tag (Gly-Ser) were encoded using GGATCC, which is a BamHI site and facilitated downstream cloning steps. For the N-terminal fusion tag, the duplex was Sense: 5′-ACCCAAGCTGGCTAGCCACCATGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGATCCAACTAACAATAGCGTTATCGAATTCTGCAGATATC-3′ and Antisense: 5′- GATATCTGCAGAATTCGATAACGCTATTGTTAGTTGGATCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCATGGTGGCTAGCCAGCTTGGGT-3′. In this case, a BamHI site encodes the final two amino acids of the peptide tag. Offene Leserahmen (ORFs) der interessierenden Gene wurden unter Verwendung von BamHI/EcoRI (N-terminal)- oder NheI/BamHI (C-terminal) -Stellen durch PCR-Amplifikation der kodierenden Region mit infusionskompatiblen Oligonukleotiden, die in der ergänzenden Tabelle S1 detailliert definiert sind, in die Akzeptor-Backbones kloniert. IDH1-, LDHA-, DHFR-, GC- und ALDH1A1-Konstrukte wurden durch GeneArt-Gensynthese (ThermoFisher) in pcDNA3.1 (+) hergestellt. Für das Gateway-Klonen (nur IDH2-Konstrukte) wurde ein Zielvektor mit dem 86b-Tag erstellt, indem das V5-Tag in pcDNA3.2-V5/DEST ersetzt wurde. The plasmid was digested with PmeI and SacII and an oligo duplex inserted by InFusion. The oligo was: Sense: 5′- TGATCTAGAGGGCCCGCGGGGCAGCGTGAGTGGCTGGCGACTGTTCAAGAAGATCAGCGGCAGCTAAGTTTAAACGGGGGAGGCTA-3′ and Antisense: TAGCCTCCCCCGTTTAAACTTAGCTGCCGCTGATCTTCTTGAACAGTCGCCAGCCACTCACGCTGCCCCGCGGGCCCTCTAGATCA-3′. The Gateway strategy leaves an additional C-terminal ’scar‘ after the final amino acid of the ORF, which encodes „LPTFLYKVVDLEGPR“ prior to the 86b tag.

Zellkultur

HEK293T-, LN18-, OV-90-, HeLa-, 22RV1-, MDA-MB-468- und HT-29-Zellen wurden aus ATCC (CRL-1573, CRL-2610, CRL-11732, CCL2, CRL-2505, HTB-132 bzw. HTB-38) erhalten. HuCC-T1 und CC-LP-1 waren ein freundliches Geschenk von Dr. N. Bardeesy (Massachusetts General Hospital, Boston). HEK293T-Zellen wurden in DMEM (4,5 g/l Glucose) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 6 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 50 U/ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin kultiviert. LN18-, HT-29-, CC-LP-1- und HeLa-Zellen wurden in dem obigen Medium ohne Natriumpyruvat kultiviert. OV-90 Zellen wurden in einer 1:1 Mischung aus MCDB 105 Medium (Cell Applications Inc.) und M199-Medium (Hyklon, GE), ergänzt mit 15% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin (Life Technologies) und einer Endkonzentration von 1,85 g/L Natriumbicarbonat (Hyklon, GE). 22RV1-, HuCC-T1- und MDA-MB-468-Zellen wurden in RPMI 1640 gezüchtet, ergänzt mit 10% FBS, 6 mM L-Glutamin, 100 Einheiten / ml Penicillin, 100 µg / ml Streptomycin. Alle Zellen wurden bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO2 gezüchtet und mit einem MycoAlert Detection Kit (Lonza) negativ auf Mykoplasmen getestet.

Rekombinante Protein- und Peptidproduktion und -reinigung

11S- und 86b-Proteine wurden durch GenScript hergestellt. Für das rekombinante 11S-Fragment wurde die kodierende DNA-Sequenz mit einem 6x His-Tag fusioniert, um die nachgeschaltete Reinigung zu erleichtern, und die Sequenz wurde in einen E. coli-Expressionsvektor subkloniert. BL21 Star (DE3) Zellen wurden mit rekombinanten Plasmiden transformiert und eine einzelne Kolonie wurde in ein IPTG enthaltendes Medium zur Induktion der Proteinexpression inokuliert. SDS-PAGE- und Western-Blot-Analysen wurden verwendet, um die Expression zu überwachen und den optimalen Erntezeitpunkt auszuwählen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und die Pellets durch Ultraschall lysiert. Nach der His-Tag-Reinigung wurden die Fraktionen durch einen 0,22 µm Filter sterilisiert. Proteine wurden mittels SDS-PAGE und Western Blot unter Verwendung von Standardprotokollen und einem Maus-Anti-His-mAb (GenScript, Kat.-Nr.A00186) analysiert. Die Konzentration an gereinigtem Protein wurde unter Verwendung eines Bradford-Protein-Assays mit BSA als Standard bestimmt. Protein wurde in 1X PBS, 10% Glycerin, pH 7,4 gelagert, und die Reinheit betrug ungefähr 90%, wie durch densitometrische Analyse des Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gels unter reduzierenden Bedingungen geschätzt. Das Peptid der Aminosäure 15 86b wurde in ultrapure dH2O gespeichert und war durch HPLC 99,9% rein.

CETSA-Komplementationstest mit niedrigem Durchsatz (96-Well-PCR-Platten oder -Streifen)

Zellen wurden in 6-Well-Schalen unter Verwendung eines reversen Transfektionsverfahrens transfiziert, wobei 1,25 ml Komplexe (6,25 µL Lipofectamin 2000 und 3 µg DNA pro Well) mit 1,25 ml HEK293T-Zellsuspension (1 × 106 / ml, insgesamt 1,25 × 106 Zellen) kombiniert wurden. Für CDK9 wurden 2 µg DNA pro Well verwendet. Nach 24 h (48 h für CDK9) wurden die Zellen durch Trypsinisierung geerntet und mit 1 × 106 Zellen / ml (sofern nicht anders angegeben) in CETSA-Puffer, der DPBS (mit CaCl2 und MgCl2) plus 1 g / L Glucose, 1X Halt-Proteaseinhibitorcocktail (ThermoFisher) und 0,5% DMSO enthielt, resuspendiert (DMSO wurde für Experimente, die eine nachfolgende Verbindungs- und Vehikelbehandlung erhielten, nicht zugegeben). Für Temperaturbereichsexperimente (ohne Verbindung oder Einzeldosis) wurden Proben mit 30 µL pro Röhrchen auf PCR-Streifen aliquotiert. Die Verbindung wurde zugegeben und die Zellen wurden 1 h bei 37 ° C inkubiert. Die Proben wurden dann 3 h erhitzt.5 min unter Verwendung eines vorgeheizten Thermocyclers, ließ auf Raumtemperatur äquilibrieren und gab 6 µL 6% iges NP40 in jede Vertiefung. Für Gefrier-Tau-Experimente wurden Röhrchen 3 min lang in einen Aluminium-PCR-Block auf ein Trockeneis / Ethanol-Bad gestellt, gefolgt von 3 min Inkubation bei 37 ° C, 3 sec Vortexen und dreimaligem Wiederholen dieser Schritte. 11S (GenScript) und Furimazinsubstrat (von Nano-Glo Luciferase Assay System, Promega) wurden bei Endkonzentrationen von 100 nM und 0 zugegeben.5X und Proben wurden mit einem ViewLux-Hochdurchsatz-CCD-Imager (Perkin Elmer), der mit klaren Filtern ausgestattet war, auf Lumineszenzintensität analysiert.

384-Well-CETSA-Assay

Zellen wurden in T75-Flaschen unter Verwendung eines reversen Transfektionsverfahrens transfiziert, wobei 9 ml Komplexe (45 µL Lipofectamin 2000 und 22,5 µg DNA) mit 10 ml HEK293T-Zellsuspension (1 × 106 Zellen / ml, insgesamt 10 Millionen Zellen) kombiniert wurden. Nach 24 h wurden Zellen durch Trypsinisierung geerntet, wie oben beschrieben mit 1× 106 Zellen/ml resuspendiert und mit einem Multidrop Combi (ThermoFisher) in 384-Well-PCR-Platten (Roche) dispensiert (15 µL Zellen/well). Verbindungen (63 nL) oder DMSO Vehicle Control (63 nL) wurden anschließend mit einem Pin-Tool (GNF) gepinnt und 1 h bei 37 ° C inkubiert. Die Platten wurden versiegelt und 3,5 min auf die angegebene Temperatur erhitzt und mit einer qPCR-Maschine (Roche) unter Verwendung einer Rampengeschwindigkeit von 1,5 ° C / s für die Heizphase und einer maximalen Rampenrate für die Abkühlphase auf 25 ° C abgekühlt. Drei µL 6% iges NP40 wurden pro Vertiefung zugegeben und für 30 min inkubiert, um eine Zelllyse zu ermöglichen, gefolgt von der Zugabe von 11S und Furimazine Substrat (bei Endkonzentrationen von 100 nM bzw. 0,5X). Die Proben wurden mit einem ViewLux-Reader auf Lumineszenzintensität analysiert.

1.536-Well-CETSA-Assay

Die Zellen wurden wie oben transfiziert und geerntet (384-Well-Protokoll). Zellen wurden (5 µL Zelle/Well) in 1.536-well weiße Platten (Aurora, cyclic Olefin polymer, cat#EWB041000A) unter Verwendung eines Multidrop Combi dispensiert. Die Verbindungen (23 nL) wurden anschließend mit einem Pin-Tool (Wako Automation) gepinnt und 1 h bei 37 ° C inkubiert. Die Platten wurden mit einem Heizblock (siehe unten) auf die angegebene Temperatur und Zeit erhitzt und auf 25 ° C abgekühlt. Pro Vertiefung wurde ein µL 6% iges NP40 zugegeben und die Platten wurden 30 min inkubiert, um eine Zelllyse zu ermöglichen, gefolgt von der Zugabe von 3 µL 11S (Endkonzentration 100 nM) und Furimazinsubstrat. Die Platten wurden zentrifugiert und unter Verwendung eines ViewLux-Readers auf Lumineszenzintensität analysiert. Für die LDHA- und CDK9-Bildschirme eine Endkonzentration von 0,5X und 0.Es wurde jeweils 25X Furimazin verwendet. Normalisierungskontrollen umfassen DMSO- und GSK2837808A-behandelte Proben oder unbeheizte Proben für LDHA bzw. CDK9. Der CDK9-Gegenscreen wurde wie oben mit den folgenden Unterschieden durchgeführt: 5 µL nicht transfizierte HEK293T-Zellen (1 × 106 / ml in CETSA-Puffer) wurden in 1.536-Well-Platten dosiert, gefolgt von Verbindungszugabe, 37 ° C Inkubation, Erhitzen und Lyseschritten wie oben. Anschließend wurden 500 pM (final) 86b zu den Vertiefungen gegeben, gefolgt von der Zugabe von 100 nM 11S und 0,25X furimazine Substrat (final).

Der Aluminiumblock zum Erhitzen einer 1.536-Well-Platte wurde durch Messen einer Platte entworfen, um die Abmessungen des Bereichs zu bestimmen, der von eingeformten Verstärkungsrippen in X und Y begrenzt wird, und der unteren Well-Fläche und der unteren Flanschfläche in Z. Dann wurde ein aus 6061 T6-Aluminiumplatte zu bearbeitender Block geformt, der ein freier Sitz mit ungefähr 0,5 mm Abstand für die Platte in allen Achsen wäre. Der Block wurde mit einer manuellen Vertikalfräsmaschine, Schaftfräsern und einem Planfräser bearbeitet. Für Ofenheizungsexperimente wurden Platten in das mittlere Gestell des Konvektionslaborofens (ThermoFisher) gelegt und mit Metalldeckeln abgedeckt, um die Verdampfung zu minimieren.

CETSA in zellulären Lysaten

Zellen wurden in CETSA-Puffer bei 1,0 × 106 Zellen / ml (wie oben beschrieben) gesammelt und NP40 wurde zu einer Endkonzentration von 0,4% hinzugefügt. Nach End-over-End-Rotation der Proben für 30 min (Raumtemperatur) wurden die Lysate durch Zentrifugation bei 20.000 ×g für 10 min (4 oC) geklärt. Dem geklärten Lysat wurde Cofaktor (z.B. NAD+) zugesetzt. Für Temperaturansprechexperimente wurden 25 µL Lysat in PCR-Röhrchen überführt und 3,5 min auf verschiedene Temperaturen erhitzt. Für isotherme Dosis-Wirkungs-Experimente wurden 5 µL geklärtes Lysat unter Verwendung einer BioRAPTR FRD-Workstation auf 1536-Well-Platten dosiert und Proben auf einem Aluminiumblock erhitzt. Die Proben wurden auf Raumtemperatur äquilibriert und Substrat zugegeben (Endkonzentration: 100 nM 11S, 0,5X Furimazin). Die Lumineszenz wurde mit einem ViewLux-Imager wie oben beschrieben erfasst.

Western Blots

Die Proben wurden wie im Abschnitt Komplementationstest mit niedrigem Durchsatz beschrieben unter Verwendung von Gefrier-Tau-Zyklen zur Lyse verarbeitet. Lysate wurden bei 15.200 × g für 20 min bei 4 °C zentrifugiert. Die Proben wurden auf einem 4-12% igen Bis-Tris-NuPAGE-Gel (ThermoFisher) unter Verwendung von MOPS-Puffer laufen gelassen und unter Verwendung eines iBlot 2-Transfersystems bei 25 V für 7 min auf eine PVDF-Membran übertragen. Membranen wurden mit einer 5%igen Milchlösung (50 mM Tris HCl, pH6; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20) blockiert und Primärantikörper über Nacht bei 4°C in Blockierlösung inkubiert. Antikörper waren: anti-IDH1 (, Zellsignalisierung # 8137, 1:500), Anti-IDH1 (R132H) (Millipore #MABC171, 1:500), Anti-LDHA (, Zellsignalisierung # 3582, 1:1000). Anti-rabbit/mouse-HRP (rabbit = Cell Signaling 7074; mouse = Cell Signaling #7076) wurde bei 1:2500 zugegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Chemilumineszenzsignal wurde mit Supersignal West dura solution (ThermoFisher) erzeugt und mit einem Biorad Chemidoc System erfasst. Die densitometrische Analyse wurde mit der Photoshop-Software (Adobe) durchgeführt.

2-HG-Assay

HEK293T-Zellen wurden in 24 Well-Schalen durch Zugabe von 2 reverse transfiziert.5 × 105 Zellen auf Transfektionskomplexe (0,75 µg Plasmid-DNA, 1,5 µL Lipofectamin 2000 pro Well). Zellkulturmedium wurde nach 72 h gesammelt und 15 µL wurden auf 384-well opake Platte übertragen. Jede Vertiefung wurde mit 1,5 µL 660 mM HCl versetzt und die Proben 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zu jeder Vertiefung wurden 1,5 µL 720 mm Tris-HCl-Base gegeben. Anschließend wurden 52 µL 2-HG-Detektionslösung (100 mM HEPES (pH 8,0), 100 µM NAD+, 1 µg/ml aktive rekombinante D-2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase (D2HGDH; Biovision, Kat: P1001), 5 µM Resazurin, 0,03 mg/ml Diaphorase (Sigma, Kat: D5540) zugegeben und die Platte bei Raumtemperatur inkubiert. Eine 2-HG-Standardkurve wurde in 100 mM HEPES (pH 8,0) hergestellt. Fluoreszenz wurde an einem ViewLux Reader mit Ex:525, Em: 598/25 Filtern gemessen.

Biochemische Assays

Der biochemische LDHA-Assay wurde wie zuvor beschrieben29 durchgeführt. Kurz werden 3 µL humane Lactatdehydrogenase 5 (2 nM final) (Nr. A38558H, Meridian Life Science, Inc.) in LDH-Assaypuffer (200 mM Tris HCl, pH 7,4, 100 µM EDTA und 0,01% Tween-20) auf eine schwarze 1536-Well-Assayplatte mit festem Boden (Greiner Bio-One) gegeben. Nach Verbindungsstifttransfer (23 nL) wurde 1 µL Substratlösung enthaltend NADH (0,06 mm final) und Natriumpyruvat (0,2 mM final) (Sigma-Aldrich) in LDH-Assaypuffer zur Initiierung der Reaktion dosiert. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurde in jede Vertiefung 1 µL Nachweisreagenz gegeben. Die Platten wurden sofort auf einen ViewLux-Reader übertragen und die resultierende Resorufin-Fluoreszenz wurde gemessen (ex 540 nm, em 590 nm) bei 0 und 10 min. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung enzymfreier und DMSO-behandelter Kontrollbrunnen auf jeder Platte normalisiert.

Der biochemische ALDH1A1-Assay unter Verwendung von unmarkiertem Protein wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt31,37. Kurzzeitig wurden 3 µL 20 nM gereinigtes humanes ALDH1A1 in Assaypuffer (100 mM HEPES pH 7,5 mit 0,01% Tween 20) in eine 1.536-well Solid-bottom black Plate (Greiner Bio One) dosiert. Dreiundzwanzig NL Compounds oder Control Bay 11-7085 wurden über Pin Tool (Wako Automation) übertragen. Die Proben wurden 15 min lang (Raumtemperatur, lichtgeschützt) inkubiert, gefolgt von einer 1 µL Substratzugabe von NAD+ und Propionaldehyd (Endkonzentrationen von 1 mM bzw. 80 µM). Die Platten wurden zentrifugiert und im kinetischen Modus auf einem ViewLux-Imager gelesen, der mit 340-nm-Anregungs- und 450-nm-Emissionsfiltern für 5 min ausgestattet war. Die Änderung der Fluoreszenzintensität über die 5 min wurde unter Verwendung enzymfreier und DMSO-behandelter Kontrollbrunnen auf jeder Platte normalisiert.

Der TR-FRET Lanthascreen Eu Kinase Binding Assay für CDK9/Cyclin K wurde von ThermoFisher bezogen und gemäß Herstelleranweisungen durchgeführt. Kurz wurden 4 µL eines Mastermixes enthaltend 4 nM CDK9/Cyclin K (Invitrogen #PV4335), 2 nM Biotin Anti-His Ab, 2 nM Eu-Streptavidin und 10 nM Kinase Tracer 236 Lösung in 1X Kinase Puffer in Greiner 1,536-well White Medium Bindungsplatten unter Verwendung einer BioRAPTR FRD Workstation dispensiert. Dreiundzwanzig nL der Verbindung und Kontrollen (DMSO und LY2857785 bei einer Endkonzentration von 6 µM) wurden sofort über Pin-Tool-Transfer an die Assay-Platten geliefert. Die Platten wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubieren gelassen und anschließend die TR-FRET-Fluoreszenz mit einem PerkinElmer EnVision Multilabel-Plattenreader gemessen (Bsp: 317/20; Em 1: 620/12; Em 2: 665/12; Verzögerungszeit 100 µs; Integrationszeit 200 µs).

Lactatproduktionstest

HEK293T-Zellen wurden wie oben beschrieben kultiviert. Die Zellen wurden mit PBS gespült, trypsinisiert und in phenolfreiem DMEM (Life Technologies) ohne Zusätze resuspendiert. Die Zellen wurden sofort mit 250 Zellen pro Well in 4 µL Volumen auf 1536-well Black clear Bottom Plates (Corning) plattiert. Compound- oder Vehikelkontrolle wurde über Pin-Tool-Transfer in Wells gegeben und die Zellen wurden 1 h bei 37 ° C inkubiert. Zu jeder Vertiefung wurden zwei µL Lactat-Reaktionsgemisch (Biovision K607-100) gegeben und die Platten wurden abgedeckt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit einem ViewLux Microplate Imager gemessen, der mit Ex/Em 528/598 nm Filtern ausgestattet war.

Aldefluor-Assay

Zur initialen Bestimmung der 86b-markierten ALDH1A1-Aktivität wurden Zellen mittels eines reversen Transfektionsverfahrens transfiziert, wobei 1 ml Komplexe (6 µL Lipofectamin 2000 und 3 µg DNA) mit 1 ml LN18-Zellsuspension (5 × 105/ml) kombiniert und 100 µL/ well Mischung in schwarze, klare 96-Well-Platten (Corning) dosiert wurden. Nach 24 h wurden Medien entnommen und durch 100 µL/well Aldefluor-Puffer (STEMCELL Technologies) enthaltend BAAA-Substrat und Hoechst 33342 (ThermoFisher, Endkonzentrationen von 500 nM bzw. 0,5 nM) ersetzt. Anschließend wurde Vehikel DMSO oder DEAB (1 µM final) zugegeben und die Platten für 30 min bei 37 °C inkubiert, um die Umwandlung von BAAA in BAA zu ermöglichen. Die Zellen wurden gewaschen und 100 µL / well Aldefluor-Puffer wurde vor der Bildgebung auf einer IN Cell 2200 (GE Healthcare) abgegeben. Für Hochdurchsatz-Assays wurden LN18-Zellen in T75-Kolben unter Verwendung eines Reverse-Transfektionsverfahrens transfiziert, wie oben für Hochdurchsatz-HEK293T-CETSA-Assays beschrieben. Nach 16 h wurden Zellen geerntet und plattiert (1.000 Zellen/Well/5 µL) in schwarze, optische Qualität klare, TC-behandelte 1.536-Well-Platten (Aurora Microplates) unter Verwendung eines Multidrop-Kombi-Dispensers und über Nacht bei 37 ° C inkubiert. Der High-Content-Aldefluor-Assay wurde anschließend an transfizierten LN18-Zellen oder untransfiziertem OV-90 wie zuvor beschrieben31 durchgeführt. Die Bilder wurden wie beschrieben mit dem Canned Multi-Target Analysis Algorithm (GE Healthcare) der Analysesoftware IN Cell Investigator v1.6.2 analysiert.

Membrane thermal Integrity Assay

30.000 HEK293T-Zellen wurden in 30 µL CETSA-Puffer hergestellt, der 1X Proteaseinhibitorcocktail (ThermoFisher) enthielt, ergänzt mit 0,5% DMSO (insgesamt 1,5% DMSO). Für das DMSO-Toleranzexperiment wurde DMSO zu 0, 1, 2 oder 3% zu DPBS gegeben. Zellsuspensionen wurden für 3,5 min bei 42 bis 74 ° C unter Verwendung von 4-Grad-Intervallen erhitzt und dann zu einem Aluminiumblock auf nassem Eis entfernt. Zellsuspensionen wurden mit gleichen Teilen Trypanblau (LONZA) (= 0,2% Trypanblau) gemischt und sofort mit einem C-Chip-Hämozytometer (iNCyto, Korea) gezählt. Trypan positiv (permeabilisiert) und negativ (intakt) wurden gezählt, mit n = 2 bei jeder Temperatur. Für weitere Zelllinien wurden eine Million Zellen in 100 µL phenolrotfreiem DMEM mit 1% DMSO präpariert. Die Zellen wurden für 3 min über 42 bis 90 ° C in 4-Grad-Intervallen erhitzt, dann zu einem Aluminiumblock auf nassem Eis entfernt. Die Membranintegrität wurde wie oben beschrieben bewertet.

PAMPA

Die von pION Inc. (Billerica, MA) wurde verwendet, um die Verbundpermeabilität wie zuvor beschrieben38 zu messen. Die Verbindungen wurden in Donor- und Akzeptorlösungen verdünnt, die auf pH7,4 gepuffert waren, und die DMSO-Konzentration betrug 0,5%. Permeabilitätsberechnungen wurden mit Pion Inc. durchgeführt. Software.

qHTS-Analyse

Die Daten aus jedem Assay wurden plattenweise auf die entsprechenden Kontrollen normalisiert, wie zuvor beschrieben39. Die gleichen Kontrollen wurden auch für die Berechnung des Z‘-Faktors für jeden Assay verwendet. Die prozentuale Aktivität wurde mithilfe einer internen Software ermittelt (http://tripod.nih.gov/curvefit/). Alle Konzentrations-Ansprechkurven wurden angepasst und AC50 wurden mit der GraphPad Prism Software berechnet; kurven wurden wie zuvor beschrieben klassifiziert27. Die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde unter Verwendung der Trapezregel berechnet, um die Fläche zwischen der Ansprechkurve und der x-Achse über den Konzentrationsbereich hinweg zu approximieren. Äquivalente Konzentrationsbereiche wurden für alle Verbindungen innerhalb eines Experiments verwendet. Zur Klassifizierung von Wirkstoffen wurde ein Wirksamkeits-Cutoff von 3 σ gegenüber dem Mittelwert (der Vehikelkontrolle) verwendet.