Abstract
Bestehende Chemotaxis—Assays erzeugen keine stabilen chemotaktischen Gradienten und messen somit – über die Zeit – funktionell nur unspezifische Zufallsbewegungen (Chemokinese). Im Vergleich dazu hat die Mikrofluidiktechnologie die Fähigkeit, eine streng kontrollierte Mikroumgebung zu erzeugen, die über längere Zeiträume stabil aufrechterhalten werden kann und daher für die Analyse der Chemotaxis angepasst werden kann. Wir beschreiben hier ein neuartiges mikrofluidisches Gerät zum sensitiven Assay der zellulären Migration und zeigen seine Anwendung zur Bewertung der Chemotaxis glatter Muskelzellen in einem Chemokin-Gradienten.
1. Einleitung
Die gerichtete Zellmigration spielt eine entscheidende Rolle bei entzündlichen Erkrankungen, Gefäßerkrankungen, Wundheilung und Tumormetastasen . Es wurden eine Reihe von In-vitro-Ansätzen zur Quantifizierung der Zellmigration entwickelt, einschließlich des Verschlusses von Monoschicht-Wunden („Scratch Assay“) und der Boyden-Kammer . Diese derzeitigen Verfahren sind jedoch relativ unempfindlich. Darüber hinaus können solche Ansätze tatsächlich messen nur Chemokinese, das heißt, erhöhte zufällige Bewegung, anstatt Chemotaxis—gerichtete Zellmigration.
Tatsächlich ist der Nutzen des Scratch Assays und der Boyden Chamber Transwells durch ihr methodisches Design begrenzt.
Für den Scratch-Assay wird eine definierte „Wunde“ (Scratch) in einer konfluenten Zellmonoschicht hergestellt; Zellen an den Rändern des Defekts füllen dann progressiv die Lücke aus, und die Zeit bis zur wiederhergestellten Konfluenz wird quantifiziert. Eine schnellere Reparatur des Kratzers wurde interpretiert, um eine verbesserte „Chemotaxis“ aufgrund von Zellmanipulation oder der Art der dem Medium zugesetzten löslichen Mittel widerzuspiegeln. Während das Experiment konzeptionell unkompliziert und technisch einfach durchzuführen ist, werden die Zellen in einer einheitlichen Wirkstoffkonzentration gebadet, und während des gesamten Experiments gibt es keinen Konzentrationsgradienten für Chemoattraktoren; Die Bewegung, die die Lücke füllt, stellt daher nur einen „zufälligen Spaziergang“ dar.“ Somit ist die „Migration“ in einem Scratch-Assay weitgehend eine Funktion nur einer erhöhten Chemokinese. Darüber hinaus umfasst das Schließen einer Kratz— „Wunde“, wie es typischerweise — insbesondere über mehrere Stunden eines längeren Assays – durchgeführt wird, wahrscheinlich auch eine wesentliche Komponente der Zellproliferation.Die andere gebräuchlichste Methode zur Messung der „Chemotaxis“ beinhaltet die Verwendung von Boyden Chamber Transwells. Unterschiedliche Konzentrationen spezifischer Chemokine werden im unteren Kompartiment des Geräts platziert, während die zu untersuchenden Zellen im oberen Einsatz inkubiert werden; Eine mikroporöse Membran trennt die beiden Kammern und bildet eine Unterstützung für das Zellwachstum und eine partielle Barriere für die Migration. Zellen, die an der Unterseite der Membran gezählt werden oder die sich in der unteren Kammer ansammeln, werden typischerweise an einem einzigen festen Endpunkt bewertet. Dieser Assay hat den Vorteil einer scheinbaren gerichteten Migration, d.h. von der oberen zur unteren Kammer, ist aber dennoch problematisch. Erstens gibt es keinen „Gradienten“ von Chemokinen von oben nach unten, sondern nur eine einzige Schrittfunktion von niedrigen zu hohen Konzentrationen. Zweitens gibt es keine Möglichkeit, das Chemokindifferential von der oberen zur unteren Kammer aufrechtzuerhalten . Anfänglich ist die Chemokinkonzentration im unteren Kompartiment größer, aber innerhalb von Minuten bis Stunden gleichen sich die Konzentrationen aufgrund der Diffusion aus, an welchem Punkt die spezifische Chemotaxis aufhört. Stattdessen spiegeln Langzeitmessungen eher ein signifikantes Element der Chemokinese wider. Sobald Zellen durch die Membran in die untere Kammer fallen, besteht keine Möglichkeit für eine umgekehrte Migration. Schließlich ist die Boyden-Kammer auch begrenzt, weil die Zellzählung die Beendigung des Experiments erfordert; Ein zeitlicher Verlauf erfordert daher mehrere Geräte.
Die Mikrofluidiktechnologie kann diese Einschränkungen überwinden, indem sie einen langzeitstabilen und kontrollierbaren Gradienten löslicher Faktoren erzeugt, der im Laufe der Zeit kontinuierlich überwacht werden kann . Unter Verwendung von Zellen, die behandelt wurden, um die Proliferation zu blockieren, ermöglicht ein solches Gerät eine echte fortlaufende Bewertung von Chemotaxis versus Chemokinese. Abbildung 1 zeigt eine solche Vorrichtung, bei der die Quell- und Senkenkonzentrationen aufrechterhalten werden, indem entsprechende Vertiefungen erzeugt werden, deren Volumen im Verhältnis zum diffusiven Fluss durch den Verbindungshydrogelkanal groß sind. Im Steady State bildet sich zwischen diesen beiden Vertiefungen ein linearer Konzentrationsgradient aus. Obwohl die interstitielle Strömung durch den Hydrogelbereich den Gradienten stören kann, wenn die hydrostatischen Drücke in den beiden Vertiefungen nicht gleich sind, werden Druckgradienten eliminiert, indem die Quellen- und Senkenkanäle mit zusätzlichen Kanälen und Reservoirs verbunden werden, die als niederohmige Wege für den Fluidfluss und den Druckausgleich dienen. Gradienten können somit über mehrere Tage aufrechterhalten und zur sensitiven und spezifischen Untersuchung der Zellmigration mit einer Vielzahl von Zelltypen verwendet werden. Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt die Verwendung solcher Geräte zur Beurteilung der Chemotaxis für Primärkulturen glatter Muskelzellen und zum Vergleich mit Scratch- und Boyden-Kammertechniken für die Empfindlichkeit.
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Device design and stability of concentration gradients as a function of time. (a) Die unteren 3 Vertiefungen sind Zell- und / oder Quellschächte für Chemokine, und die oberen 3 Vertiefungen dienen als Reservoire, um äquivalente Drücke in den unteren Vertiefungen aufrechtzuerhalten. Je nach Versuchsaufbau können die Seitentöpfe oder die zentrale Vertiefung als Quellentöpfe dienen; Zellen in einer zentralen Vertiefung können auf beiden Seiten zu verschiedenen Chemokin-Stimuli wandern, oder verschiedene Zellpopulationen in den Seitentöpfen können zu einem zentralen Chemokin-Stimulus wandern. (b, c) Konzentrationsgradienten sind schematisch nach Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffindikators mit niedrigem Molekulargewicht zu der Quellwanne und dem Quellreservoir entweder nach 2 Stunden (b) oder nach 72 Stunden (c) dargestellt. (d) Grafische Darstellung der Konzentrationsgradienten von 0 h bis 72 h nach Zugabe von Fluoreszenzfarbstoff zu Quellbrunnen und Reservoir.
2. Materialien und Methoden
2.1. Primäre glatte Muskelzellen (SMC) -Kultur
Aorten wurden von 8 Wochen alten C57 / B6-Mäusen (Charles River, Wilmington, MA) mit einer sterilen Sezierschere geerntet. Anhaftendes Fett wurde entfernt und Aorten wurden für 20 min bei 37 ° C in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Invitrogen, Grand Island, NY) inkubiert, das 1% Penicillin / Streptomycin, 2% fetales Rinderserum und 5 mg / ml Kollagenase Typ II (Invitrogen) enthielt. Aorten wurden in kaltem DMEM gespült und die Adventitia vorsichtig seziert; sie wurden dann in kleine Stücke geschnitten und 30 min bei 37 ° C in DMEM inkubiert, das 1 mg / ml Kollagenase Typ I (Invitrogen) und 0,125 mg / ml Elastase Typ III (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) enthielt. Nach wiederholtem Pipettieren zur Dissoziation des Gewebes wurde die resultierende Zellmischung in frischem „SMC-Medium“ (DMEM mit 10% fetalem Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin; 2% nichtessentiellen Aminosäuren, 1% L-Glutamin; alle Reagenzien von Invitrogen) suspendiert und bei 37°C in einem 5%igen CO2-Inkubator auf mit 1 mg/ml Fibronektin beschichteten Platten 30 Minuten lang gezüchtet. Sobald die Zellkultur etabliert ist (typischerweise nach der ersten Passage), werden SMC auf unbeschichteten Kunststoffflaschen (Corning Incorporated, Corning, NY) gezüchtet.
SMC wurden von den Passagen 2 bis 7 verwendet und waren 99.5% rein, wie durch Durchflusszytometrie nach Färbung für α-Aktin der glatten Muskulatur beurteilt. Zur Färbung werden Zellen geerntet und mit 1% Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert. FITC-konjugierter antismooth Muscle α-actin Antikörper (Sigma-Aldrich) bei 1 :100 Verdünnung in 10X BD perm/Waschpuffer (BD Pharmingen, San Jose, Kalifornien) wurde für 10 min bei Raumtemperatur appliziert. Die Zellen werden zweimal mit 1% fetalem Rinderserum in PBS und einmal mit 1% fetalem Rinderserum in PBS mit 1% Formaldehyd gewaschen und sofort durchflusszytometrisch analysiert (FACScalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). Der FITC-konjugierte Maus-IgG1-Isotyp (BD Pharmingen) wird als Isotypenkontrolle verwendet. Zellen für chemotaktische Assays wurden geerntet, wenn sie Konfluenz erreicht hatten.
2.2. Mitomycin-C-Behandlung
Die Zellen wurden 2 min bei 37°C trypsinisiert (0,25% Trypsin-EDTA; Invitrogen), mit SMC-Medium gewaschen und anschließend als Einzelzellsuspension in 40 µg/ml Mitomycin-C (MMC) inkubiert; Sigma-Aldrich) in SMC-Medium für 30 min bei 37°C. Nach zwei weiteren Wäschen in PBS wurden die Zellen auf Lebensfähigkeit, Proliferation oder Migrationskapazität untersucht. Für den Wound Healing (Scratch) Assay wurde die MMC-Behandlung nach dem SMC-Plating durchgeführt und wenn die Zellen zu 100% konfluent waren; Die Zellen wurden in 40 µg / ml MMC in SMC-Medium für 30 min bei 37 ° C inkubiert und dann vor dem Assay zweimal in PBS gewaschen.
2.3. SMC-Proliferationshemmungsassay
Nach MMC-Behandlung oder Kontrollinkubation in SMC-Medium wurden SMC in 6-Well-Platten (Corning Incorporated) kultiviert. Zellen wurden nach 1 h, 24 h oder 48 h durch Trypsinisierung gewonnen und Zellzahlen und Lebensfähigkeit wurden durch Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers und Trypanblauausschlusses beurteilt.
2.4. Wound Healing/Scratch Assay
SMC wurden in 12-Well-Platten (Corning Incorporated) bis zur Konfluenz kultiviert und anschließend mit MMC behandelt. Nach dem Waschen wurde frisches SMC-Medium zugegeben und die Zellmonoschicht mit einer sterilen 200 µL Pipettenspitze reproduzierbar zerkratzt. Unterschiedliche Konzentrationen des Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktors (PDGF; R&D Systems, Minneapolis, MN) in SMC-Medien wurden zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Der Abstand zwischen den Kanten des Wunddefekts wurde gemessen und von fünf getrennten Punkten nach 3, 6 und 9 h oder bis zum Schließen des Wunddefekts gemittelt.
2.5. Boyden Chamber Transwell Assay
100 µL SMC–Suspensionen mit 1,0–1,5 × 105 Zellen / ml (1,0-1,5 × 104 Gesamtzellen) wurden in die oberen Transwell-Inserts (Costar, Corning Incorporated) geladen und 600 µL SMC-Medien mit unterschiedlichen Konzentrationen von PDGF wurden in das untere Kompartiment gegeben. Nach 6 h, 12 h oder 24 h Inkubation wurde die Transwell-Membran gemäß Herstellerempfehlung mit Hoechst 33342 (Invitrogen) angefärbt und transmigrierte Zellen auf der Unterseite mit Hilfe der MetaMorph NX Microscopy Automation and Image Analysis Software (BioCompare, South San Francisco, CA) auf einem Fluoreszenzmikroskop gezählt. Im Medium in der unteren Kammer wurden nie Zellen identifiziert. In Experimenten zur Beurteilung, ob die Zellmigration Chemotaxis oder zufällige Chemokinese in Abwesenheit eines Konzentrationsgradienten darstellte, wurde der aus Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktor-BB (PDGF) der unteren Kammer, nur der oberen Einlage oder sowohl der oberen Einlage als auch der unteren Kammer zugesetzt.
2.6. Microfluidic Device Assay
Die Microfluidic Devices (Abbildungen 1(a)-1(c)) werden wie an anderer Stelle beschrieben hergestellt. Wie in Abbildung 1 (d) gezeigt, sind die Gradienten der zugesetzten Reagenzien für mindestens 72 h stabil. Je nach Versuchsprotokoll werden die auszuwertenden Zellen in der zentralen Vertiefung platziert und aus den beiden seitlichen Vertiefungen unterschiedliche chemotaktische Gradienten entwickelt. Alternativ kann die Migration von zwei verschiedenen Zellpopulationen aus den Seitentöpfen ausgewertet werden, wobei identische Konzentrationsgradienten auftreten, die durch in der zentralen Vertiefung platzierte Reagenzien erzeugt werden. Die Zellkonzentrationen betrugen immer 4-5 × 105/ml und 40 µL der Zellsuspensionen (1,6–2,0 × 103 Zellen) wurden in Testschächte geladen.
Zellen wurden in den Geräten für verschiedene Zeitpunkte inkubiert und anschließend mit Hoechst 33342 (Invitrogen) angefärbt. Die Position jeder Zelle wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (Nikon Eclipse TE2000-U; Nikon Instruments, Inc., Melville, NY), und die migrierte Entfernung wurde mit dem Matlab-Programm (MathWorks, Natick, MA) bewertet. „Gesamtmigration“ ist definiert als die Summe der Entfernungen, die von allen Zellen über einen anfänglichen Startort hinaus migriert wurden; Dieser Migrationsindex wird für statistische Analysen verwendet (Abbildung 2).
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Bewertung der Zellmigration in mikrofluidischen Bauelementen. Die Zellen wurden in der zentralen unteren Vertiefung einer mikrofluidischen Vorrichtung plattiert, wobei 50 ng / ml PDGF in SMC-Medium in der linken unteren Vertiefung und SMC-Medium allein in der rechten unteren Vertiefung platziert wurden, gefolgt von einer Inkubation bei 37 ° C für 48 h. (a, b) Phasenkontrastbild der Zellchemotaxis vom zentralen Kanal in Richtung des 50 ng / ml PDGF im linken Kanal; Die Bilder werden entlang des Kanals zwischen der Senke und dem Quellschacht aufgeteilt, so dass die gesamte Länge des Kanals mit einer Vergrößerung dargestellt werden kann, die ausreicht, um eine zelluläre Auflösung zu ermöglichen. (c, d) Phasenkontrastbild der Zellchemokinese vom zentralen Kanal nur in Richtung SMC-Medium. (e, f) Low-Power-Fluoreszenzbild des linken (e) oder rechten (f) Kanals bei 48 h nach Anfärbung mit Hoechst 33342. (g) Hochleistungs-Fluoreszenzbild des linken Kanals in der Tafel (e); Das schwarze Quadrat ohne Zellen in der Nähe der rechten Seite des Bildes (Sternchen) ist ein struktureller Pfosten, der den Startpunkt für die Migration markiert. (h) Beispiel für die Migrationsanalyse. Eine vertikale rote Linie kennzeichnet den Startpunkt; Der Abstand vom Startpunkt zum Zentrum jedes Zellkerns wird gemessen, und die Summe all dieser Einzelmessungen wird mit Matlab zur Gesamtmigrationsentfernung.
Kollagen Typ I (Invitrogen) wird verwendet, um den Kanal zwischen zentralen und seitlichen Vertiefungen zu füllen, und ist das Substrat, durch das Zellen wandern. Es können sowohl 1 mg / ml als auch 2 mg / ml Kollagen verwendet werden. Obwohl 1 mg / ml Kollagen zu einer etwas höheren unspezifischen Hintergrundzellchemokinese führt und die Gelbeladung technisch schwieriger ist als bei 2 mg / ml Kollagen, ermöglicht die niedrigere Kollagenkonzentration eine größere Migration von Primärkulturen von SMC, und die Assayempfindlichkeit ist besser. Sofern nicht anders angegeben, betrug die Kollagenkonzentration in den Migrationskanälen für alle Versuche 1 mg/ml.
2.7. Statistische Analyse
Statistische Vergleiche wurden mit Student’s -Test oder Einweg-ANOVA durchgeführt. Die Bedeutung wurde auf der Ebene definiert.
3. Ergebnisse und Diskussion
Wie in Abbildung 3(a) gezeigt, wird die Zellproliferation durch MMC-Behandlung blockiert. Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Zelllebensfähigkeit zwischen MMC-behandeltem SMC (%) und unbehandeltem SMC (%) für bis zu 48 Stunden nach der Behandlung. Somit stellt die Zellakkumulation in den verschiedenen Migrationsassays eine echte Zellbewegung ohne jegliche Komponente der Zellproliferation dar. Dies ist wichtig, da ohne MMC-Behandlung Migrationsindizes aus Langzeitinkubationen durch koinzidente Zellproliferation verwechselt werden können.
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Zellmigration in Scratch- und Boyden-Kammer-Assays. (a) Mitomycin-C (MMC) Hemmung der SMC-Proliferation. SMC, die mit oder ohne MMC behandelt wurden (40 µg / ml für 30 min bei 37 ° C), wurden in 6-Well-Platten plattiert und anschließend geerntet. Zellzählungen wurden manuell auf einem Hämozytometer nach 1 h, 24 h und 48 h durchgeführt; Zellzählungen werden als Mittelwert ± eine Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt. Der Ausschluss von Trypanblau zeigte keine Unterschiede in der Zelllebensfähigkeit über 48 Stunden (%). Die MMC-Behandlung führt zu einer stabilen Anzahl von Zellen, die nach 24 h und 48 h gesammelt wurden, mit signifikant erhöhter Proliferation in den nicht mit MMC behandelten Populationen (). (b) Kratzprobe; es werden keine Unterschiede im Ausmaß der Migration zwischen Zellen beobachtet, die in keinem Chemokin kultiviert wurden, im Vergleich zu 25-100 ng / ml PDGF; Über die 3-6 Stunden dieses Tests wird kein signifikanter Unterschied zwischen Kontrollzellen und denen, die mit MMC behandelt wurden, beobachtet. (c) Transwell-Assay; Unterschiedliche Konzentrationen von PDGF wurden zur Zeit Null in die untere Kammer der Transwell-Geräte gegeben; Zellen auf der unteren Seite des Transwell-Inserts wurden nach 6 h, 12 h oder 24 h aufgezählt. Im Vergleich zu keinem PDGF in der unteren Kammer gab es nach 12 h signifikant höhere Zellzahlen migrierter Zellen in der 10 ng /ml-, 25 ng /ml- und 50 ng /ml-PDGF-Gruppe (). Nach 24 Stunden unterschieden sich die migrierten Zellzahlen in Transwells mit 5-50 ng / ml PDGF im Vergleich zu Kammern ohne PDGF nicht signifikant. Nach 24 Stunden waren die migrierten Zellzahlen, wenn 100 ng / ml PDGF in der unteren Kammer vorhanden waren, im Vergleich zur Kontrollgruppe von 0 ng / ml PDGF signifikant reduziert. (d) Chemokinese in Transwells; die gleiche 50 ng / ml-Konzentration von PDGF wurde in die untere Kammer, die obere Kammer oder beide unteren und oberen Kammern geladen; Die Zellmigration wurde nach 6 h, 12 h oder 24 h analysiert. Relativ zu keinem PDGF in beiden Kammern war die Zellmigration mit 50 ng / ml in der unteren Kammer nach 12 Stunden signifikant größer (); Nach 24 Stunden gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Kontrollkammern und 50 ng / ml PDGF. Bemerkenswerterweise führte die Zugabe von PDGF in die obere Kammer mit oder ohne PDGF in der unteren Kammer zu einer signifikant erhöhten Migration nach 12 Stunden im Vergleich zu PDGF in der unteren Kammer allein ().
In Scratch-Assays (Abbildung 3(b)) mit primären SMC-Kulturen migrierten Zellen zufällig (Chemokinese), um die Defekte unabhängig von der PDGF-Konzentration mit vergleichbaren Raten auszufüllen, auch in Abwesenheit eines chemotaktischen Mittels. Ohne MMC-Behandlung neigen Wunddefekte dazu, sich etwas früher zu schließen, was auf ein Element der Zellproliferation hindeutet.
Abbildung 3(c) zeigt die Migrationsergebnisse für SMC unter Verwendung des Boyden Chamber Transwell Assays. Der frühe (12 h) Zeitpunkt zeigt eine geringe, aber signifikant erhöhte Migration als Reaktion auf 10-50 ng / ml PDGF im Vergleich zu keinem Chemokin in der unteren Vertiefung. Es gab jedoch keinen unterscheidbaren Unterschied in der Migration über einen 10-fachen Konzentrationsbereich von PDGF, was darauf hindeutet, dass der Assay zumindest für primäre SMC-Kulturen relativ unempfindlich ist. Darüber hinaus gibt es nach 24 Stunden keine Unterschiede zwischen den Konzentrationen von Chemokinen (einschließlich der Medienkontrolle), was darauf hindeutet, dass die Migration zu diesem Zeitpunkt unspezifisch ist, sobald die Zytokinkonzentrationen begonnen haben, sich zwischen den oberen und unteren Vertiefungen auszugleichen.Um formal zu demonstrieren, dass die Migration über die Membran in der oberen Vertiefung nicht notwendigerweise auf gerichtete Chemotaxis zurückzuführen ist, wurde PDGF in die obere Vertiefung mit oder ohne PDGF in die untere Kammer gegeben. Selbst in Abwesenheit eines Chemokingradienten führte PDGF in der oberen Kammer zu einer deutlich erhöhten Transmigration (Abbildung 3 (d)); Dies kann nur auf eine erhöhte Chemokinese zurückgeführt werden.Die Transwell-Experimente legen daher nahe, dass, obwohl anfängliche PDGF-Konzentrationsunterschiede ein gewisses Maß an erhöhter Zellmigration in Richtung höherer Konzentrationen in den unteren Vertiefungen induzieren können, die nachfolgende PDGF-Diffusion zu einer zufälligen Chemokinese führt.
Im Vergleich dazu zeigen Dosis-Wirkungs-Experimente mit den mikrofluidischen Geräten (Abbildung 4) eine signifikante Chemotaxis bei Konzentrationen von nur 2.5 ng / ml PDGF (Abbildung 4(b)) und zeigen einen dosisabhängigen Anstieg der Chemotaxis mit einem Peak von ungefähr 25-50 ng/ ml (Abbildung 4(a)). Interessanterweise führen höhere Konzentrationen von PDGF (z. B. 100 ng / ml) zu einer geringeren Migration, was mit einem hochdosierten Chemotaxis-Arrest übereinstimmt (18). Bemerkenswert ist, dass ohne vorherige MMC-Behandlung der Migrationsindex größer ist (Abbildung 4 (a)), was den nicht unwesentlichen Beitrag der Proliferation zur „scheinbaren“ Chemotaxis bei längeren Assayzeiten hervorhebt. The results demonstrate that the microfluidic device for measuring chemotaxis is substantially more sensitive than the existing scratch or „gold standard“ Boyden chamber approaches.
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Microfluidic device assay. (a) Dosis-Wirkungs-Kurven mit und ohne vorherige MMC-Behandlung. MMC-behandeltes und nicht behandeltes SMC wurden in Seitenzellbrunnen gegeben, wobei unterschiedliche Konzentrationen von PDGF (5 ng / ml, 10 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml und 100 ng / ml) in den zentralen Quellbrunnen vorhanden waren. Die Migration wurde nach Hoechst 33342-Färbung und Fluoreszenzmikroskopie nach 48 h unter Verwendung des Matlab-Programms zur Berechnung der Gesamtmigration gemessen. Kontrollen (nur SMC-Medium) und jede Konzentration von PDGF wurden in Dreifachgeräten ausgewertet. Es sind signifikante Unterschiede von 5 ng / ml bis 100 ng / ml PDGF im Vergleich zur Kontrolle () zu sehen. (b) Chemokinese versus Chemotaxis in mikrofluidischen Geräten. MMC-behandeltes SMC mit oder ohne 2,5 ng / ml PDGF wurde in der zentralen Zellwanne plattiert; 2,5 ng / ml oder 50 ng / ml PDGF wurden zu den Seitenquellwellungen gegeben. Da kein PDGF in der zentralen Zellmulde vorhanden ist, zeigt der Assay nach 48 h eine signifikant größere Gesamtmigration mit 50 ng / ml in der Quellmulde („0-50“) gegenüber 2,5 ng / ml in der Quellmulde („0-2,5“). Das Vorhandensein von 2,5 ng / ml PDGF im zentralen Zellbrunnen führt zu einer signifikant größeren Gesamtmigration, wenn ein Konzentrationsgradient vorliegt („2,5–50“; ), die auf einen lokalen Chemokinese-Effekt zurückzuführen sind. In Abwesenheit eines Gradienten („2,5–2,5“) kommt es zu einer Chemokinese-assoziierten Migration, die signifikant geringer ist als die Migration, die bei Vorliegen eines Gradienten beobachtet wird („0-2,5“; ). (c) Zeitverlaufsexperiment durchgeführt als Panel (b).
Das mikrofluidische Gerät kann nicht nur zur Messung der Chemotaxis verwendet werden, sondern auch die Beiträge von Chemokinese und Chemotaxis zur Migration spezifisch unterscheiden (Abbildung 4(b)). In Abwesenheit eines Chemokin-Gradienten (z.B. 2.5 ng / ml PDGF sowohl in den mittleren als auch in den seitlichen Vertiefungen) spiegelt der Migrationsindex die Chemokinese wider. Im Vergleich dazu spiegelt der Migrationsindex ohne PDGF in der mittleren Vertiefung und 2,5 ng / ml in der seitlichen Vertiefung die gerichtete Chemotaxis wider. Die mikrofluidische Vorrichtung kann die Chemotaxis auch in Gegenwart einer vorhandenen Chemokinese beurteilen, z. B. wenn die mittlere Vertiefung 2,5 ng / ml PDGF und die seitliche Vertiefung 50 ng / ml enthält. Es gibt eine kleine, aber statistisch größere Migration, wenn der Reiz eher ein chemotaktischer Gradient als eine einfache Chemokinese ist.
Da sich der Chemokingradient innerhalb von 2 Stunden einstellt (17) und über mehrere Tage stabil ist, können Zellen den Konzentrationsgradienten im Laufe der Zeit kontinuierlich hochwandern (Abbildung 4(c)). Im Vergleich dazu haben andere klassische Methoden entweder keinen Konzentrationsgradienten (Scratch-Assay) oder nur einen transienten Chemokin—Gradienten, so dass die Chemokinese — und nicht die gerichtete Chemotaxis – zunehmend dazu beiträgt.
Das in dieser Arbeit beschriebene mikrofluidische Gerät ist in vielerlei Hinsicht anderen In-vitro-Ansätzen überlegen, die zuvor zur Untersuchung der Chemotaxis verwendet wurden. Insbesondere die Boyden-Kammer – mit einem Chemokin-Gradienten über eine poröse Membran – ist seit den 1950er Jahren ein chemotaktischer Standardtest. Dieses Gerät weist jedoch erhebliche Einschränkungen auf, da die Gradienten weder stabil noch linear sind und ein anfänglicher starker Konzentrationsschritt auftritt, der sich im Laufe der Zeit zunehmend verschlechtert. In jüngerer Zeit wurden mikroelektromechanische Systeme (MEMS) entwickelt, die mikrofluidische Biochips verwenden, um In-vivo-Bedingungen nachzuahmen; In diesen Geräten sind Zellen ständig Scherkräften unter kontrolliertem Fluss ausgesetzt. Der kontinuierliche Fluss dieser Geräte stellt jedoch eine Herausforderung für die Aufrechterhaltung stabiler Chemokingradienten dar. Obwohl Hydrogele zwischen dem Quell- und dem Senkenkanal lineare Konzentrationsgradienten erzeugen können , können subtile Variationen in den Vertiefungen und Kanälen Druckgradienten erzeugen, die die Gradienten durch interstitiellen Fluss stören ; Darüber hinaus neigt der kontinuierliche Fluss der Vorrichtungen dazu, alle von Zellquellen abgesonderten Chemoattraktanten zu verdünnen. In der neuartigen mikrofluidischen Vorrichtung, die zuvor beschrieben und in dieser Arbeit für die Migration glatter Muskelzellen validiert wurde, halten großvolumige Quellen- und Senk-Wells stabile Chemokingradienten im Verbindungshydrogel aufrecht; Jeder interstitielle Fluss wird eliminiert, indem die Quellen- und Senk-Wells mit zusätzlichen Kanälen und Reservoirs verbunden werden, die als Widerstand-Kondensator-Schaltung dienen. Die Konzentrationsgradienten sind somit über mehrere Tage stabil und linear. Die aktuelle Arbeit hat die Anwendung weiter verfeinert, Einbeziehung der Mitomycin-C-Behandlung zur Verringerung des Störbeitrags der Proliferation und Demonstration, wie Chemotaxis und Chemokinese im selben Versuchsaufbau bewertet werden können.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.
Danksagung
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des BWH-BRI Fund to Sustain Research Excellence-Bridge Research Grant unterstützt. Chen Zhang wurde 18 Monate lang vom China Scholarship Council unterstützt. Ovid C. Amati und Richard T. Lee wurden teilweise vom NSF Science and Technology Center CBET-0939511 unterstützt.
