Tiere

Zebrafische wurden bei 28,5 ° C in einem 14-Stunden-EIN- / 10-Stunden-AUS-Lichtzyklus in Danieau-Lösung gehalten . Die kombinatorische Kristallmutante (albb4/b4;nacrew2/w2; roya9/a9) wurde durch sequentielle Kreuzung von drei verschiedenen Einzelmutantenstämmen, nämlich nacrew2/w2 (Ref. 9), roya9/a9 (Ref. 4) und albb4/b4 (Ref. 18) Mutanten. Wichtig ist, dass sowohl Larven als auch adulte Kristallzebrafische lebensfähig sind und keine sichtbaren morphologischen, funktionellen oder Verhaltensauffälligkeiten außer dem Pigmentierungsphänotyp aufweisen. Die Casper-Mutante wurde durch Kreuzung von nacrew2/w2- und roya9/a9-Mutanten erhalten, wie zuvor beschrieben4. Die AB-Linie wurde verwendet, um Wildtyp-Zebrafische zu erhalten. Zu den in dieser Studie verwendeten transgenen Linien gehören Tg (elavl3: GCaMP5G) 21 und Tg (elavl3: GCaMP6f)28. Konfokale funktionelle Bildgebungsexperimente wurden an der Perlmutt-Mutante durchgeführt. Light-Sheet-Imaging-Experimente wurden in Perlmutt-, Casper- und Kristallmutanten durchgeführt. Zwei-Photonen-funktionelle Bildgebungsexperimente wurden in Kristalllarven durchgeführt. Um Zebrafischlarven mit PTU zu behandeln, folgten wir Standardverfahren8, speziell Larven wurden in 200 µM PTU (Sigma) in Danieau-Lösung von 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) gezüchtet. Tg (elavl3: GCaMP5G) -Larven, die für die konfokale funktionelle Bildgebung visuell evozierter neuronaler Aktivität im optischen Tektum verwendet wurden, wurden mit 200 µM PTU von 24 hpf bis 3 dpf behandelt und bei 4 dpf abgebildet. Diese Arbeit wurde von der örtlichen Tierschutz- und Ethikprüfungsstelle (King’s College London) genehmigt und in Übereinstimmung mit dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 unter Lizenz des United Kingdom Home Office (PPL70 / 8057) durchgeführt.

Bildgebung

Ganztier-In-vivo-Mikroskopie

Ganztierbilder von adulten Zebrafischen wurden mit einer digitalen Spiegelreflexkamera Nikon D7000 aufgenommen, die mit einem Sigma 150 mm Makroobjektiv ausgestattet war. Erwachsene Zebrafische wurden mit betäubt 0.2% Tricain (MS222, Sigma) in Fischfazilitätswasser und in eine 90 mm Petrischale gegeben, die Fischfazilitätswasser enthält. Die Bildgebung der Larven wurde mit einem ZEISS Axioskop-Mikroskop durchgeführt, das mit EXi Blue CCD-Kameras (Retiga) und der Volocity-Erfassungssoftware (PerkinElmer) verbunden war. Zebrafischlarven wurden mit 0,02% Tricain in Danieau-Lösung betäubt und in 1% niedrigschmelzender Agarose (Sigma) auf Objektträgern immobilisiert.

Konfokale Kalziumbildgebung

Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen Mikroskop ZEISS LSM 710 durchgeführt, das mit einem Spektraldetektions-Scankopf und einem 20X/ 1 ausgestattet war.0 NA Wasser-Immersionsobjektiv (Carl Zeiss). Funktionelle Zeitreihen visuell evozierter Calciumreaktionen in retinalen Ganglienzellen (RGCs) wurden mit einer Rate von 4,1 Hz und einer Auflösung von 0,415 × 0,415 µm (256 × 256 Pixel) und einer Lochblende von 1 AU erfasst. Anregungslicht wurde von einem 488 nm Mehrlinienlaser bereitgestellt. Nicht anästhesierte Tg (elavl3: GCaMP5G) -Larven wurden in 2% iger niedrigschmelzender Agarose (Sigma), die in Danieau-Lösung hergestellt wurde, immobilisiert und dorsal nach oben auf einer erhöhten Glasplattform montiert, die in einer maßgeschneiderten Danieau-gefüllten Kammer platziert wurde. Die Agarose reichte aus, um die Larven zurückzuhalten, so dass keine Narkose erforderlich war. Die Bildgebung wurde am Nachmittag (1-8 pm) durchgeführt.

Lichtblattbildgebung

Die Ganzhirn-Lichtblattbildgebung wurde unter Verwendung eines ZEISS Lightsheet Z.1-Mikroskops durchgeführt, das mit zwei 10X / 0,2 NA-Beleuchtungsobjektiven und einem 20X / 1,0 NA-Wasser-Immersions-Detektionsobjektiv (Carl Zeiss) ausgestattet war. 488-nm-Laseranregungslicht wurde verwendet, um GCaMP6f-Fluoreszenz auszulösen, und ein 505-545-BP-Filter wurde zur Detektion von emittiertem Licht verwendet. Der Pivot-Scanner (Carl Zeiss) wurde eingesetzt, um eine homogene Ausleuchtung zu liefern und somit Schatten entlang der Beleuchtungsachse zu vermeiden. Die Dicke des Lichtblattes betrug 5,39 µm in der Mitte und 10,8 µm an den Rändern des Gesichtsfeldes. Die Belichtungszeit betrug 29,97 ms. Die Größe der volumetrischen Bilder betrug 623 × 798 × 283 µm3 (1500 × 1920 × 490 Pixel) mit einer Auflösung von 0,415 × 0,415 × 0,631 µm. 4 dpf nacre, casper und crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) Larven wurden zunächst für 10-15 Minuten in α-Bungarotoxin (1 mg/ml; Biotium), hergestellt in Danieau-Lösung, gelähmt. Anschließend wurden Larven in 2%iger niedrigschmelzender Agarose (Sigma) immobilisiert und in eine Glaskapillare (20 µl Volumen, 701904; Marke) gegeben. Anschließend extrudierten wir den Abschnitt des Agarosenzylinders, der den Kopf der Larve enthielt, aus der Kapillare und orientierten die Larven so, dass die dorsale Seite des Kopfes dem Detektionsobjektiv und die Augen den beiden Beleuchtungsobjektiven zugewandt waren. Die Ganzhirn-Lichtblattbildgebung von Casper-Mutantenlarven wurde mit einem maßgeschneiderten Lichtblattmikroskop durchgeführt, das von Dr. Martin Meyer (King’s College London) gebaut und mit einem 20X / 1.0 NA-Wasser-Immersions-XLUMPlanFLN-Detektionsobjektiv (Olympus) ausgestattet wurde.

Zwei-Photonen-Calcium-Bildgebung

Die Zwei-Photonen-Funktionsbildgebung in der Netzhaut wurde unter Verwendung eines Nikon A1R MP-Mikroskops durchgeführt, das mit einem 4-Kanal-GaAsP-NDD und einem Apochromat 25X /1,1 NA-Wasser-Immersionsobjektiv (Nikon) ausgestattet war. Die Anregung erfolgte durch einen auf 930 nm abgestimmten Chameleon Ultra II modengekoppelten Titan-Saphir-Laser (kohärent). Zeitreihen visuell evozierter Calciumreaktionen wurden mit einer Rate von 4 Hz und einer Auflösung von 0,248 × 0,248 µm (512 × 256 Pixel) erfasst. Nach Aktivierung des Laserscannings warteten wir 60 Sekunden, bevor wir mit der visuellen Stimulation begannen, um sicherzustellen, dass sich die Netzhaut an das durch den Multiphotonenlaser verursachte Hintergrundlicht anpasste. 4 dpf crystal Tg(elavl3:GCaMP6f) Larven wurden zunächst für 10-15 Minuten in α-Bungarotoxin (1 mg/ml; Biotium), hergestellt in Danieau-Lösung, gelähmt. Anschließend wurden die Larven in 2% iger Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Sigma) immobilisiert und auf einer erhöhten, maßgeschneiderten Glasplattform mit der dorsalen Seite nach oben (45 ° Winkelneigung) und einem Auge zu einem LCD-Bildschirm (siehe visuelle Stimulation) montiert wurde unter einer maßgeschneiderten Danieau-gefüllten Kammer platziert. Die Bildgebung wurde am Nachmittag (1-8 pm) durchgeführt.

Visuelle Stimulation

Moving Bars in der konfokalen Präparation

Moving Bars Stimuli wurden wie zuvor beschrieben22,33 erzeugt. Ein Diffusionsfilter (3026, Firma Rosco) wurde an eine Seite der Kammer geklebt, um als Projektionsfläche zu dienen. Die Agarose vor dem der Projektionsfläche zugewandten Auge wurde entfernt, so dass eine ungehinderte Sicht auf das projizierte Bild an der Seite der Kammer möglich war. Die Larven wurden 3 cm vom Bildschirm entfernt positioniert und das projizierte Bild füllte ein Gesichtsfeld von ~ 97 ° × 63 ° aus. Visuelle Reize bestanden aus hellen (56 cd/m2) oder dunklen Balken (8 cd/m2) (175% bzw. 25% der mittleren Leuchtdichte) auf einem mittleren grauen Hintergrund (32 cd/m2). Da keine qualitativen Unterschiede zwischen hellen und dunklen Balken festgestellt wurden, wurden die mit den beiden Stimuli erhaltenen Daten kombiniert. Jeder Balken hatte eine Breite von 10 ° und bewegte sich mit einer Geschwindigkeit von 20 ° / s und war um 30 ° vom vorhergehenden Balken getrennt, sodass mehr als ein Balken gleichzeitig auf dem Bildschirm angezeigt werden konnte. Die langen Achsen der Stäbe waren orthogonal zur Bewegungsrichtung. Jede der 12 Bewegungsrichtungen wurde einmal (3 Sekunden) in einer pseudozufälligen Reihenfolge dargestellt, die für jede Scheibe in jedem abgebildeten Tier einzigartig ist. Jedes Intervall zwischen den Epochen betrug 10 Sekunden, damit die GCaMP5G-Signale zur Grundlinie zurückkehren konnten. Eine leere Bildschirm-Null-Bedingung von 2 Sekunden wurde ebenfalls verschachtelt. Visuelle Experimente wurden mit speziell geschriebenem Labview- und MATLAB-Code (MathWorks) generiert und gesteuert, auf einem ViSaGe Stimulus Presenter (Cambridge Research Systems) implementiert und über einen DLP-Pico-Projektor (Optoma) geliefert.

Moving gratings in two-photon preparation

Moving gratings Stimuli in der Zwei-Photonen-Präparation wurden mit PsychoPy39 erzeugt und gesteuert und über einen LCD-Bildschirm (SKD5VA-3, GoodWell Technology) geliefert, der sich unter einer maßgeschneiderten Plexiglaskammer befindet. Ein Langpass-Rotglasfilter (FGL610, Thorlabs) wurde zwischen dem LCD-Bildschirm und der Kammer positioniert, um eine gleichzeitige Bildgebung und visuelle Stimulation zu ermöglichen. Die Larven wurden 2 cm vom Bildschirm entfernt positioniert und das Bild auf dem LCD-Bildschirm füllte ein Gesichtsfeld von ~ 140 ° × 100 ° aus (mittlere Hintergrundleuchtdichte 30,4 cd / m2). Visuelle Reize bestanden aus Rechteckgittern (100% Kontrast, Ortsfrequenz 1,66 Zyklen / cm, zeitliche Frequenz 1 Zyklen / s). Jeder Gitterstab war 8,5 ° breit und die Längsachsen der Stäbe waren orthogonal zur Bewegungsrichtung. Jede der 12 Bewegungsrichtungen wurde einmal (6 Sekunden) mit einem Epochenintervall von 10 Sekunden dargestellt, damit die GCaMP6f-Signale zur Grundlinie zurückkehren konnten. Eine leere Bildschirm-Null-Bedingung von 6 Sekunden wurde ebenfalls verschachtelt. TTL-Trigger (0-5-0 Volt) zur Aufzeichnung von Epochenereignissen, die über ein LabJack-USB-Datenerfassungsgerät (U3-LV, LabJack Corporation) generiert wurden. Nach Aktivierung des Laserscannings warteten wir 60 Sekunden, bevor wir mit der visuellen Stimulation begannen, um sicherzustellen, dass sich die Netzhaut an das durch den Multiphotonenlaser verursachte Hintergrundlicht anpasste.

Optomotor response Assay

Einzelne 5 dpf Larven wurden in einer 35 mm Petrischale mit Danieau Lösung positioniert. Der LCD-Bildschirm eines iPhone 5 (Apple), der von einem MacBook Pro (Apple) über Duet Display (Kairos Technologies) gesteuert wurde, wurde verwendet, um schwarze und weiße Rechteckgitter (85% Kontrast, Ortsfrequenz 0,33 Zyklen / mm, zeitliche Frequenz 3,5 Zyklen / s) anzuzeigen, die sich in 4 Richtungen (90 ° Winkelabstand) am Boden der Petrischale bewegten. Visuelle Reize wurden in Keynote (Apple) generiert. Jede Larve wurde insgesamt 5 Mal getestet (jeder Versuch dauerte 6 s, gefolgt von 10 s statischen Gittern) und gemäß den Versuchen bewertet, auf die sie reagierte (d. H. Fisch dreht sich und schwimmt in Richtung der sich bewegenden Gitter). Das Verhalten der Larven wurde mit einem Stereomikroskop M165 FC (Leica) visuell überwacht.

Analyse

Funktionsanalysen

In vivo Calcium-Bildgebungsdaten wurden wie zuvor beschrieben analysiert22,33. Zusammenfassend wurden funktionale Zeitreihen vor der Analyse wie folgt verarbeitet: Zeitreihenbilder aus jedem Experiment wurden mit einem Starrkörperalgorithmus (SPM12; http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/) auf Bewegung korrigiert, median mit einer Kerngröße von 1 Voxel gefiltert, um Dunkel- und Schussrauschen zu entfernen, und räumlich geglättet mit einem 2D Gaußschen Kernel = 2 Voxel zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses. Eine Basislinie (B), die niederfrequente Drifts korrigiert, wurde unter Verwendung eines Kubisch-Spline-Algorithmus bestimmt, der zwischen Knoten extrapoliert wurde, die aus 5 s der Interepochenintervalldaten gemittelt wurden. Beide relativen Signalintensitätsänderungen (ΔF = F-B; wobei F = rohe Fluoreszenz) und normalisierte Signalintensitätsänderungen wurden an jedem Voxel berechnet. ΔF wurde für Populationsfunktionsdaten (voxelweise Analyse) verwendet, während % ΔF / F0 für manuell definierte Regionen von Interesse (ROIs) verwendet wurde. Für jedes Voxel oder ROI wurde die integrale Antwort über das Epochenintervall berechnet, um eine einzelne Antwortmetrik für jede dargestellte Richtung der Stimulusbewegung bereitzustellen. Das Integral innerhalb jedes Epochenfensters ist eine zusammenfassende Metrik, die resistenter gegen Sättigungseffekte der Calciumsonde ist als die maximale Signaländerung. Ein Schwellwert für jedes Voxel innerhalb einer Aufnahmebildsequenz wurde aus der Varianz von ΔF-Änderungen während der Intervalle zwischen den Epochen und der Nullbedingung, Schwellwert = 5 × SDs, bestimmt. Alle Voxel, die innerhalb von mindestens zwei visuellen Präsentationsepochen überschwellig waren, wurden als visuell ansprechend angesehen und einer weiteren Charakterisierung unterzogen.

Zur Analyse der Richtungs- und Orientierungsselektivität visuell ansprechender Voxel wurden richtungs- und orientierungsselektive Indizes (DSI und OSI)40, basierend auf angepassten von-Mises- oder Gauß-Profilen 41, zusammen mit einer Schätzung ihrer Passgenauigkeit R2 berechnet. Der DSI wurde definiert als (Rpref−Rnull) / (Rpref + Rnull), wobei Rpref, die Antwort auf die Vorzugsrichtung, die integrale Antwort über das Epochenintervall der Vorzugsrichtung war. Rnull wurde ähnlich berechnet wie die Integralantwort, die durch die der Vorzugsrichtung entgegengesetzte Richtung hervorgerufen wird. Der OSI wurde definiert als (Rpref−Rorth) / (Rpref + Rorth), wobei Rpref, die Antwort auf die bevorzugte Orientierung, die integrale Antwort über das Epochenintervall der bevorzugten Orientierung war. Rorth wurde ähnlich berechnet wie die integrale Antwort, die durch die orthogonale Orientierung hervorgerufen wird. Um Übersprechen und Überanpassung im Zusammenhang mit DSI- und OSI-Metriken zu minimieren, wurde ein strenger Ansatz verfolgt. Damit ein Voxel als richtungsselektiv (DS) oder orientierungsselektiv (OS) angesehen werden kann, wurden sich gegenseitig ausschließende Kriterien verwendet: DS if DSI > 0.5 und OSI < 0.5; und OS, wenn OSI > 0.5 und DSI < 0.5. In beiden Fällen musste die Anpassungsgüte (R2) für DSI bzw. OSI >0,8 betragen; somit erklärten die angepassten Kurven mindestens 80% der Integralantworten. Eine einzelne von-Mises-Verteilung wurde verwendet, um die Antworten von DS-Voxeln anzupassen und ihren bevorzugten Bewegungsrichtungswinkel von der Mitte der angepassten Kurve abzuschätzen. Die Summe zweier Von-Mises (180 ° Winkelabstand voneinander) wurde verwendet, um die Reaktionen der OS-Voxel anzupassen und ihre bevorzugte Ausrichtung der Bewegungswinkel aus den Zentren der angepassten Kurven abzuschätzen. Die zirkuläre Varianz wurde auch zum Vergleich als alternative Metrik der Orientierungsselektivität berechnet (Zirkuläre Varianz < 0.4)41.

Morphologische Analysen

Zur Bestimmung des in 4 dpf nacre, casper und crystal Tg(elavl3) abgebildeten Hirnvolumens:GCaMP6f) Zuerst haben wir die Anzahl der GCaMP6f+ Voxel in jedem volumetrischen Bild berechnet, indem wir die adjust>threshold Funktion gefolgt von der analyse>histogram>list Befehl in ImageJ42. Anschließend wurden die erhaltenen Werte mit dem Volumen eines einzelnen Voxels multipliziert (0,415 × 0,415 × 0,631 µm3 = 1,086 × 10-1 µm3).

Statistische Analysen

Statistische Testergebnisse werden in Zahlen und Legenden dargestellt. Statistische Analysen und Tests wurden mit Prism 6 (GraphPad) oder MATLAB R2014b (MathWorks) durchgeführt. Vor der Durchführung statistischer Tests wurden deskriptive Statistiken (z. B. Normalitätstests, um festzustellen, ob Werte aus einer Gaußschen Verteilung stammen, oder F-Test zum Vergleich von Varianzen) verwendet, um den geeigneten statistischen Test auszuwählen (in Abbildung 1 zusammen mit den Testergebnissen angegeben). Das Kriterium für die statistische Signifikanz wurde auf p < 0,05 gesetzt.