Dies ist der erste Teil einer dreiteiligen Serie über die Transformation von E.coli. Am Ende sollten Sie ein Experte für die E. coli-Transformation sein und wissen, welche Stämme Sie für verschiedene Anwendungen auswählen sollten. Wenn Sie bereits ein Experte sind, hoffe ich, dass es eine angenehme Auffrischung für Sie sein wird. In jedem Fall kommentieren Sie bitte unten, wenn Sie etwas hinzufügen möchten.

Verwendung von Elektrizität zur Transformation

Fremde DNA kann durch Elektroporation oder chemische Transformation in die E.coli eingebracht werden. Bei der Elektroporation legen Sie einen elektrischen Strom über die Zelle an. Es wird angenommen, dass der Strom momentane „Poren“ in den Zellmembranen erzeugt, die die negativ geladene DNA durch einen Elektrophorese-Effekt in die Zellen zwingen. Um elektrokompetente E.coli herzustellen, waschen Sie die Zellen gründlich, um alle mittleren Salze zu entfernen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Ladung nicht durch das Medium geleitet wird. Führen Sie die Elektroporation auch bei 0 ° C durch, um Wärmeschäden an den Zellen zu minimieren.

Chemikalien: Sie arbeiten auch

Um chemisch kompetente Zellen herzustellen, resuspendieren Sie E.coli in einer CaCl2-Lösung bei 0° C. Unter diesen Bedingungen wird angenommen, dass das Ca2 + -Ion Poren in der Membran erzeugt, die Bindung der DNA an die Zellmembran unterstützt und die negative Ladung auf der DNA maskiert. Zusammen erleichtern diese den Durchgang von DNA durch die hydrophobe Zellmembran. Zwingen Sie die DNA in die Zellen, indem Sie einen kurzen Hitzeschock von 42 ° C anwenden, der zu einem thermischen Strom führt, der die DNA in die Zellen fegt.

Die Vor- und Nachteile jeder

Elektroporation ist weniger umständlich als die chemische Umwandlung und ergibt im Allgemeinen höhere Transformationseffizienzen (gemessen in Kolonien, die pro Mikrogramm DNA gebildet werden). Es ist jedoch teurer. Es erfordert eine spezielle Vorrichtung, um die Ladung und Küvetten zu liefern, um die Ladung auf die Zellsuspension zu übertragen. Elektroporation ist empfindlich gegenüber Salz – Sie können wertvolle Proben verlieren, wenn überschüssiges Salz in die Küvette übertragen wird.

Ich persönlich bevorzuge die chemische Umwandlung. Obwohl es etwa eine halbe Stunde länger dauert, finde ich, dass die Ergebnisse vorhersehbarer sind und ich mag die Tatsache, dass ein größeres Volumen an DNA hinzugefügt werden kann, wenn die Konzentration zu niedrig ist. Sie können das DNA-Volumen mit Elektroporation nicht erhöhen, da die Gefahr besteht, dass der Lösung zu viel Salz zugesetzt wird. Obwohl der häufig zitierte Nachteil der chemischen Transformation die geringere Effizienz ist, können Sie jetzt ultrakompetente Zellen wie XL10-gold von Stratagene kaufen, sodass dies kein Problem mehr darstellt.

Artikel in dieser Serie:

• E.coli Elektroporation vs Chemische Transformation (dieser Artikel)
• Kompetente E.coli: Kaufen oder nicht kaufen?
• Auswahl eines kompetenten E.coli-Stammes

Ursprünglich veröffentlicht am 18.September 2007. Überarbeitet und aktualisiert am 11.Juli 2016.