Beigetragen von Paul Barber
DNA-Extraktion über Chelex
Chelex ist berüchtigt dafür, so wankelmütig wie billig und einfach zu sein. Hier sind einige Tipps für gute Verstärkungen: 1. Manchmal funktionieren Proben am besten, wenn sie sofort verwendet werden, manchmal ist es besser, über Nacht zu warten, bevor Sie sie verwenden. Experimentiere und finde heraus, was für deine Spezies funktioniert. Die Ergebnisse können je nach Taxa variieren.2. Wenn Sie anfängliche PCRs durchführen, führen Sie eine serielle Verdünnung der Vorlage durch.Die Menge einer Chelex-DNA-Extraktion, die in einer PCR verwendet wird, kann so hoch wie die Hälfte des Volumens der PCR oder so niedrig wie 1 Mikroliter einer 1: 10.000-Verdünnung sein. Ich finde, dass 1 Mikroliter eines 1: 1 für die meisten Anwendungen gut ist.3. Wenn Sie beim ersten Mal mit einem Chelex-Extrakt keine Amplifikationen aus Ihrer PCR erhalten, wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren Vortex, Spin, Inkubieren, Vortex, Spin, Sit Overnight. Oft führt dies dazu, dass eine negative PCR funktioniert.
Methode¶
- Sterilisieren Sie mit Bleichmittel einen trockenen Reagenzspatel und einen kleinen Magnetrührstab.
- Herstellung einer 5-10 Gew.-%igen Aufschlämmung von Chelex100-Harz (Biorad-Teil 143- 3832,100-200 mesh Chelex, Natriumform) und UV-sterilisiertes HPLC-Wasser. Der effektivste Weg, dies zu tun, besteht darin, ein steriles 50-ml-Falcon-Röhrchen zu nehmen, es auf eine Waage in einem kleinen Becherglas zu legen und die Waage auf Null zu stellen. Dann fügen Sie 5 Gramm Chelex hinzu und füllen Sie zu 50ml Markierung mit Wasser.
Die Genauigkeit ist nicht kritisch. Sterile Technik ist.
- Sterilen Rührstab in das Röhrchen geben und auf Magnetrührer stellen. Chelex setzt sich schnell ab, so dass, wenn die Aufschlämmung nicht gut gemischt ist, Ihre Konzentrationen und Ergebnisse variabel sind. Halten Sie die Aufschlämmung gut gemischt, aliquotieren Sie 300-500 Mikroliter in 0,6 oder 1,6 ml Eppendorf-Röhrchen (wieder steril) und verschließen Sie sie sofort. Wenn Sie Zugang zu einer Haube mit laminarer Strömung haben, ist dies ein guter Ort, um all dies zu tun. Möglicherweise möchten Sie die Waage und den Rührer vor dem Gebrauch mit einer 10% igen Bleichlösung abwischen und / oder UV-sterilisieren.
- Heizblock einschalten. Auf 95 ° C einstellen Löcher mit Wasser füllen.
- Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette (Flamme über Alkoholbrenner mehrmals zum Sterilisieren) ein kleines Stück Gewebe aus Ihrer Probe. Dieses Stück Gewebe sollte groß genug sein, um sichtbar zu sein, aber nicht so groß, dass es leicht sichtbar ist. Stellen Sie sich vor, Sie schneiden einen 0,2-mm-Abschnitt einer Standardklammer. Das ist reichlich groß. Zu viel Gewebe kann Ihre Reaktionen hemmen.
Pinzette zwischen Proben sterilisieren.
- Wenn Sie fertig sind, führen Sie eine negative Chelex-Kontrolle durch, indem Sie Ihre sterilisierte Pinzette in ein Röhrchen Chelex-Aufschlämmung tauchen.
- Vortex-Probe und Chelex-Slurry für 10-15 Sekunden.
Stellen Sie sicher, dass die Deckel fest verschlossen sind, bevor Sie beginnen.
- Spin-Proben kurz mit hoher Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge
- Proben 20 Minuten bei 95°C inkubieren
*Die Blocktemperatur kann bei diesem Schritt leicht abfallen. Dieser Rückgang ist normal. Überprüfen Sie die Röhrchen während der Inkubation, um sicherzustellen, dass die Deckel nicht abgerissen sind.*
- Proben erneut für 10-15 Sekunden vortexlieren.
Vorsicht, da Dampf den Deckel des Zentrifugenröhrchens platzen lassen kann. Deckel gedrückt halten.
- Schleudern Sie die Röhrchen erneut mit hoher Geschwindigkeit in der Mikrozentrifuge.
- Proben sind gebrauchsfertig.
supernate nur für PCR-Reaktionen verwenden. Chlex Bead wird Taq inaktivieren!
Diese Methode basiert mit Genehmigung auf einem Originalprotokoll, das hier verfügbar ist.
