CRBN wird effizient abgebaut durch VHL-CRBN heterodimerizing PROTACs

Die PROTAC-Technologie nutzt E3-Ligasen, um Zielproteine zu zerstören. Wir haben uns daher gefragt, ob eine E3-Ligase selbst von einer anderen E3-Ligase ubiquitiniert und abgebaut werden kann, wenn zwei verschiedene E3-Ligasen in der Nähe platziert werden. Durch die Aktivierung von HIF1a können VHL-Abbauprodukte möglicherweise Erythropoetin-Substitute sein. Um dies zu entwerfen, haben wir Pomalidomid, ein CRBN-Targeting-Molekül, mit VHL032, einem VHL E3-Ligase-Liganden, verbunden (Abb. 1A). Der Linker verband die Aminogruppe von Pomalidomid und die terminale Acetylgruppe von VH032; Da es sich um lösungsmittelexponierte Regionen handelt, würde eine Verbindung zwischen ihnen wahrscheinlich ihre Bindung an jede E3-Ligase nicht stören. Für die Synthese von VHL-CRBN heterodimerisierenden PROTACs (Fig. 1B und ergänzend Fig. S1A), 4-Fluorthalidomid (1) und VHL-Ligand (5) wurden wie bereits berichtet hergestellt33. 4-Fluorthalidomid (1) wurde mit vier Aminlinkern (2), die eine tert.-butylestergruppe tragen, in Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einem Zwischenprodukt (3) behandelt. Nach Entschützung der tert.-butylgruppe in 3 durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) wurde die Säure (4) mit dem VHL-Liganden (5 oder 7) in Gegenwart von 1-1H-1,2,3-triazolopyridinium-3-oxid-hexafluorphosphat (HATU) und DIPEA zu den PROTACS (6), TD-158, TD-165, TD-343 und TD- 487 (8).

Nach der Behandlung mit diesen Verbindungen untersuchten wir die Konzentrationen von VHL und CRBN durch Western Blot-Analyse. Die Behandlung mit TD-158, TD-165 oder TD-343 verursachte eine konzentrationsabhängige Abnahme des CRBN-Proteinspiegels (Abb. 1C, obere Platte). Die Konzentrationen sowohl der VHL-Langform als auch der VHL-Kurzform nahmen jedoch zu, vermutlich aufgrund der Stabilisierung durch die Chemisch-Protein-Wechselwirkung (Abb. 1C, obere mittlere und untere mittlere Platten)34. Bei der Behandlung mit 10 µM TD-158 wurden die CRBN-Spiegel wiederhergestellt; Dieser „Hook“ -Effekt ist ein typisches Merkmal, das im Zusammenhang mit einem hochdosierten PROTAC-induzierten Proteinabbau auftrett9,35,36,37. TD-487, ein Stereoisomer von TD-165, konnte jedoch keinen CRBN-Abbau induzieren (Abb. 1C). TD-343 besaß eine relativ schwache Aktivität, was bedeutet, dass der Einbau von Sauerstoff in den Linker die PROTAC-Aktivität hemmt. Eine quantitative Analyse der reversen Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zeigte, dass die durch VHL-CRBN-heterodimerisierende PROTACs induzierte Abnahme des CRBN-Spiegels nicht auf Veränderungen der mRNA zurückzuführen war (Ergänzende Abb. S1B). Die 50% Degradationskonzentration (DC50) und maximale Degradation (Dmax) Werte wurden für alle synthetisierten Verbindungen gemessen. Die berechneten DC50- und Dmax-Werte für TD-158 betrugen 44,5 nM und 97 nM.1%, und die entsprechenden Werte für TD-165 waren 20,4 nM und 99,6% (Fig. 1D und ergänzend Fig. S1D). Der kürzere linkerhaltige Degrader TD-156 (DC50 = 100,6 nM, Dmax = 96,9%) zeigte im Vergleich zu TD-165 eine schwächere Aktivität (Ergänzende Fig. S1C). TD-343 (DC50 = 367,8 nM, Dmax = 85,1%) mit Sauerstoff im Linker führte zu einem ineffizienten Abbau von CRBN. Um die Wirkung der Bindung an Thalidomid zu testen, untersuchten wir den Abbau von CRBN durch VHL-CRBN-Heterodimerisierung von PROTACs mit einer anderen Bindung. TD-760 (DC50 = 367.7 nM, Dmax = 82%) mit einer Glykolbindung und TD-033 (DC50 = 2546,1 nM) mit einer Amidbindung zeigten einen reduzierten CRBN-Abbau, während TD-759 (DC50 = 28,8 nM) mit einer Glycinbindung eine ähnliche Wirksamkeit wie TD-165 aufwies. Um festzustellen, ob relative Proteinspiegel zu diesem voreingenommenen Proteinabbau beitragen könnten, behandelten wir Zellen, die VHL, CRBN oder beides mit TD-158 überexprimierten, und analysierten CRBN- und VHL-Spiegel. In allen Fällen wurden die CRBN-Spiegel gesenkt, während die VHL-Spiegel ähnlich blieben oder anstiegen (Abb. 1E). In Zeitverlaufsexperimenten baute TD-158 CRBN innerhalb von 3 h um mehr als 80% und nach 12 h vollständig ab (Abb. 1F). TD-158-induzierter CRBN-Abbau wurde auch in verschiedenen humanen Zelllinien beobachtet (Ergänzende Abb. S2A-D).

Der Abbau von CRBN durch VHL-CRBN-heterodimerisierende PROTACs ist abhängig von CRL2VHL

Um zu verifizieren, dass der CRBN-Abbau durch TD-158 von UPS oder Cullin-RING-Ubiquitin-Ligasen (CRL) abhängig war, testeten wir Bortezomib, einen Proteasom-Inhibitor, und MLN4924, einen Neddylierungsinhibitor. Die gleichzeitige Behandlung mit TD-158 und Bortezomib oder MLN4924 verhinderte den CRBN-Abbau (Abb. 2A und ergänzend Fig. S3A). Erwartungsgemäß nahm die Poly-Ubiquitin-Kettenbildung in Gegenwart von TD-158 deutlich zu (Abb. 2B). Zusätzlich dämpfte der Knockdown von VHL durch Small Interfering RNA (siRNA) den TD-158–induzierten CRBN-Abbau in HEK293T-Zellen (Abb. 2C). Im Gegensatz dazu stellte die Expression von VHL in 786-O-Zellen, einer VHL-defizienten Nierenkarzinomzelllinie, den TD–158-induzierten CRBN-Abbau wieder her (Abb. 2D). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen verhinderte der siRNA-vermittelte Knockdown von Cullin2, einem Gerüstprotein des CRL2VHL-Komplexes, den TD–158-induzierten CRBN-Abbau (Abb. 2E). Zusammenfassend weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass der CRBN-Abbau durch VHL-CRBN-heterodimerisierende PROTACs vom CRL2VHL-Komplex abhängt.

Ein effizienter Abbau durch PROTACs erfordert die Bildung eines ternären Komplexes mit dem Zielprotein und E3 Ligase9,38. Um dies zu testen, führten wir Co-Immunopräzipitationsexperimente durch. Wir fanden heraus, dass exogen exprimierte Flag-markierte CRBN endogene VHL in Gegenwart von TD-158 co-immunpräzipitiert, aber nicht in seiner Abwesenheit (Abb. 2F). GST-Pull-Down-Experimente mit gereinigten Proteinen zeigten, dass CRBN in Gegenwart von TD-158 direkt mit dem VHL-Elongin B / C-Komplex interagierte (Abb. 2G). Darüber hinaus hemmte die Zugabe von überschüssigem Pomalidomid oder VHL-Ligand den TD-158-induzierten CRBN-Abbau (Ergänzende Abb. S3B, C). Exogen exprimiertes CRBN Y384/W386A (AA), eine Pomalidomid-bindende defekte Mutante16, wurde durch TD–158 nicht abgebaut (Ergänzende Fig. S3D). Daher legen diese Daten nahe, dass die Bildung eines ternären Komplexes zwischen CRBN, VHL und TD-158 eine Voraussetzung für den CRBN-Abbau ist.

Eine globale Proteomanalyse zeigt, dass TD-158 den Abbau von CRBN induziert

Um den Abbau von CRBN unvoreingenommen zu untersuchen, haben wir eine quantitative Proteomanalyse durchgeführt. Um die sekundären Effekte des CRBN-Abbaus zu minimieren, behandelten wir Jurkat-Zellen, die CRBN- und Imidazol-Substrate exprimierten, mit TD-158 oder DMSO (Vehikelkontrolle) für 12 h. Die Proteine aus jeder Probe wurden verdaut und die verdauten Peptide wurden für die isobare Markierung markiert, die an die Flüssigkeitschromatographie gekoppelt war-Tandem-Massenspektrometrie. Diese Analyse identifizierte 7.148 Proteine, die mehr als drei nicht redundante, einzigartige Peptide enthielten (ergänzende Tabelle S1). Nur drei Proteine – CRBN, CNIH1 und LMBRD2 — erfüllten die Kriterien eines P-Wertes = 0,05 und einer mehr als 1,5-fachen Veränderung. Unter ihnen war CRBN das einzige Protein, das sich um mehr als das 2-fache veränderte (Abb. 3A). Die Spiegel anderer Komponenten von CRL4CRBN-Komplexen (CUL4A, CUL4B, DDB1 und RBX1) und CRL2VHL-Komplexen (Elongin C, Elongin B, CUL2 und RBX1) blieben jedoch unverändert (Abb. 3B, C). Interessanterweise wurden die Spiegel der zuvor berichteten Neo-Substrate von IMiDs, einschließlich IKZF1, IKZF3, ZFP91, ZNF276 und ZNF653, bei TD-158-Behandlung nicht verändert (Abb. 3B)39,40,41. Diese Ergebnisse wurden durch Immunoblotting in Jurkat und verschiedenen multiplen Myelomzelllinien bestätigt (Abb. 3D und Ergänzende Fig. S2A-D).

Der CRBN-Abbau durch VHL-CRBN-Heterodimerisierung von PROTACs rekapituliert einen CRBN-Mangel

Ein endogenes Substrat von CRL4CRBN ist die Glutaminsynthetase GLUL, die ein Schlüsselenzym in der Biogenese von Glutamin ist. Die Acetyltransferase CBP / p300 acetyliert zwei N-terminale Lysinreste von GLUL unter Bedingungen hoher Glutaminspiegel, und das resultierende acetylierte GLUL wird von CRL4CRBN eingefangen und ubiquitiniert und anschließend von Proteasomen entfernt22. Um die Wirkung von TD-158 auf GLUL-Spiegel zu untersuchen, verhungerten wir Hep3B-Zellen von Glutamin für 48 h und versorgten dann Glutamin in Gegenwart oder Abwesenheit von TD-158. TD-158 induzierte unabhängig vom Glutaminstatus einen CRBN-Abbau, und die GLUL-Spiegel nahmen im Laufe der Zeit in Gegenwart von TD-158 langsamer ab als in Abwesenheit (Abb. 4A, B). Darüber hinaus zeigten In-vivo-Ubiquitinierungsassays, dass die Ubiquitinierung von GLUL in Gegenwart von TD-158 abnahm (Abb. 4C). Wir untersuchten auch, ob die TD-165-Behandlung eine zelluläre Resistenz gegen IMiD verleiht. Zwei IMiD-empfindliche Zelllinien, WSU-DLCL2 und RPMI8226, wurden 24 h lang mit TD-165 oder DMSO vorbehandelt und dann 3 Tage lang mit Pomalidomid, TD-165 oder beiden behandelt. Die Vorbehandlung mit TD-165 reduzierte die antiproliferativen Wirkungen von Pomalidomid in beiden Zelllinien (Abb. 4D, E). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass der CRBN-Abbau durch VHL-CRBN-Heterodimerisierung von PROTACs einen CRBN-Mangel rekapituliert.

Um die in vivo Effekte von VHL-CRBN heterodimerisierenden PROTACs zu untersuchen, haben wir versucht zu bestimmen, ob TD-165 den CRBN-Abbau in Tiermodellen induzieren kann. Obwohl Aminosäurereste in Maus-CRBN (mCRBN), die für die Teratogenität wichtig sind, nicht konserviert sind, wurde mCRBN durch TD-165 in embryonalen Fibroblasten der Maus deutlich, wenn auch in etwas geringerem Ausmaß, abgebaut (Ergänzende Abb. S4A). Anschließend verabreichten wir Mäusen TD-165 intraperitoneal, um festzustellen, ob TD-165 in vivo einen CRBN-Abbau induziert. Die CRBN-Spiegel wurden jedoch in der Milz, in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) oder in der Leber nicht verändert (Ergänzende Abb. S4B). Da die Pharmakokinetik von TD-165 angemessen ist (ergänzende Tabelle S2), könnte dieses Ausbleiben einer Wirkung auf die hohe Plasmaproteinbindung (99,9%) von TD-165 zurückzuführen sein (ergänzende Tabelle S3).

N-terminal verkürztes CRBN wird nicht durch VHL-CRBN-heterodimerisierende PROTACs abgebaut

Um zu bestimmen, welche Domäne von CRBN für den TD-165–vermittelten CRBN–Abbau wichtig ist, haben wir eine Reihe von CRBN-Deletionsmutanten (D1-D4) generiert, wie in Abb. 5A. Zellen, die CRBN in voller Länge oder einzelne Deletionsmutanten exprimieren, wurden entweder mit DMSO oder TD-165 behandelt, und die Zelllysate wurden nach TD-165-Behandlung auf Abbau untersucht. Überraschenderweise wurde keine der vier CRBN-Deletionsmutanten durch TD-165 abgebaut, wohingegen CRBN in voller Länge effizient abgebaut wurde (Fig. 5B). Bemerkenswerterweise waren die VHL-Spiegel vermutlich aufgrund der Stabilisierung der Chemisch-Protein-Interaktion in Gegenwart von TD-165 leicht erhöht, aber nicht durch Expression von abgeschnittenen CRBN-Mutanten in Gegenwart von TD-165 verändert (Abb. 5B). Eine mögliche Erklärung dafür wäre die Unfähigkeit von Deletionsmutanten, einen ternären Komplex zu bilden. Die D1-Mutante bildete jedoch mit TD-165 und VHL einen ternären Komplex (Abb. 5C), und die Ubiquitinierung von D1 nahm in Gegenwart von TD-165 zu (Fig. 5D). Wir stellten dann die Hypothese auf, dass aminoterminale Lysinreste von CRBN für die Ubiquitinierung erforderlich sind. Um diese Idee zu testen, substituierten wir alle drei Lysinreste innerhalb des N-Terminus von CRBN (aa 1-80) einzeln und in Kombination mit Arginin und untersuchten dann Zelllysate auf CRBN-Abbau. TD-158 degradierte effizient alle Mutanten im gleichen Ausmaß wie Wildtyp-CRBN (Abb. 5E), was darauf hinweist, dass die drei Lysinreste am N-Terminus von CRBN nicht für den Abbau benötigt werden, der durch VHL-CRBN-heterodimerisierende PROTACs induziert wird.

Die ungeordnete Region des Zielproteins wird für einen effizienten PROTAC-induzierten Abbau benötigt

Als nächstes wollten wir strukturelle Unterschiede zwischen CRBN in voller Länge und der CRBN-Deletionsmutante D1 bestimmen. Es wurde vorhergesagt, dass der N-Terminus von CRBN (aa 1-80) eine entfaltete oder intrinsisch ungeordnete Region enthält, basierend auf einer IUPred2A-Analyse (Ergänzende Abb. S5A). Diese ungeordnete Region (a.a. 1-48) war in der CRL4CRBN-Kristallstruktur aufgrund ihrer Flexibilität tatsächlich nicht erkennbar (PDB-Eintrag; 6BN7). Es wurde gezeigt, dass die intrinsisch ungeordnete Region eine der Hauptkomponenten des proteasomalen Degrons ist und als Initiator für die proteasomale Proteolysis25 fungiert. Alternativ kann bei globulären Proteinen ohne ungeordnete Region der p97/Valosin-haltige Proteinkomplex (p97/VCP) die Sekundärstruktur entfalten, was den proteasomalen Abbau der Proteine erleichtert. Um die Beziehung zwischen PROTAC-induziertem Proteinabbau und dem p97 / VCP-Komplex zu untersuchen, testeten wir die Wirkung von N2,N4-Dibenzylchinazolin-2,4-diamin (DBeQ), einem p97 / VCP–Inhibitor, auf den TD-165-induzierten CRBN-Abbau. Diese Experimente zeigten, dass der CRBN-Abbau durch die DBeQ-Behandlung nicht beeinflusst wurde (Abb. 6A). Die Spiegel von DNA-Schäden induzierbarem Transkript 3 (DDIT-3; CHOP) und lipidiertem LC-3II, die als Positivkontrollen verwendet wurden, waren nach DBeQ-Behandlung erhöht. Knockdown von p97 durch siRNA- oder DBeQ-Behandlung beeinträchtigte ERAD- und Autophagiewege, was zu einer Hochregulation von CHOP, einem gut etablierten UPR-Marker, und einer Akkumulation von LC-3II, einem repräsentativen Autophagie-Marker, führte (Abb. 6A)42. Um zu untersuchen, ob die ungeordnete Region von CRBN den PROTAC-induzierten Proteasomabbau erleichtert, haben wir die ungeordnete Region (aa1-80) von CRBN an D2-, D3- und D4-Mutanten gebunden und die chimären Proteine auf Abbau untersucht. Alle chimären Proteine, insbesondere die D4-Chimäre, wurden durch TD-165 konzentrationsabhängig abgebaut (Fig. 6B). Die Einführung einer CRBN-gestörten Region entweder an den N- oder C-Terminus von VHL induzierte jedoch keinen Abbau des Fusionsproteins (Abb. 6C), was darauf hinweist, dass die Bindung der ungeordneten Region nicht für alle Zielproteine ausreicht. Um diese Idee auf den durch andere PROTACs induzierten Abbau auszudehnen, testeten wir ARCC4, einen zuvor berichteten Androgenrezeptor (AR) PROTAC43, da AR auch eine entfaltete Region am N-Terminus (a.a. 1-330), wie mit dem Analysetool IUPred2A ermittelt (Ergänzende Abb. S5B). Bei der ARCC4-Behandlung wurde AR ohne die N-terminale ungeordnete Region (ΔN330) weniger effizient abgebaut als das AR in voller Länge. Interessanterweise erhöhte die Anheftung der CRBN-ungeordneten Region (aa 1-80) an AR ΔN330 die Abbaueffizienz (Abb. 6D und ergänzend Fig. S5C). Dementsprechend förderte die Anlagerung der AR-gestörten Region (a.a. 1-170) an die CRBN D1-Mutante auch die Proteolyse durch TD-165 (Abb. 6E und ergänzend Fig. S5D).

Um diese Ergebnisse weiter zu verstärken, wählten wir PROTACs mit hoher Potenz (DC50 < 1 µM) basierend auf einer Literaturrecherche aus und analysierten sie dann mit dem IUPred2A-Tool auf eine intrinsisch ungeordnete Region. Interessanterweise wurde festgestellt, dass zwei Drittel der ausgewählten PROTAC-Zielproteine eine ungeordnete Region von mehr als 40 Aminosäuren entweder an einem ihrer Termini oder intern besitzen (Tabelle 1)44, obwohl die aminosäuresequenzbasierte Vorhersage ungeordneter oder unstrukturierter Regionen andere Faktoren wie Protein-Protein-Interaktion oder posttranslationale Modifikationen nicht berücksichtigt 44,45,46. In Übereinstimmung damit wurde gezeigt, dass VHL-Homo-PROTAC den Abbau der VHL-Langform induziert, die an ihrem N-Terminus eine ungeordnete Region beherbergt, nicht jedoch die VHL-Kurzform47. Somit unterstützt dies unsere Idee, dass die ungeordnete Region von Zielproteinen für einen effizienten Abbau durch PROTACs erforderlich ist.