Die systemische agonistische Krebsimmuntherapie induziert eine differentielle Expansion von CD4- und CD8-T-Lymphozyten in lymphoiden und peripheren Organen

Es wurde gezeigt, dass die Kombination von Anti-CD40 mit IL-2 ein verzögertes Wachstum und eine Regression in mehreren murine Tumormodelle . Ähnlich wie veröffentlichte Daten mit Zelllinien-Tumormodellen führte die Behandlung des Mammary intraepithelial neoplasia-Outgrowth (MIN-O) -Modells , einer Gewebetransplantationslinie, mit Anti-CD40- und IL-2-Immuntherapie (IT) zu signifikanten Antitumorantworten (P = 0,0057) einschließlich Regression in >50% der behandelten Mäuse (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1A). Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Antitumorantworten auf CD8-T-Zellen zurückzuführen sind, daher haben wir den T-Zell-Phänotyp in der Milz sowie im Tumor und in der Lunge (eine häufige Metastasierungsstelle für viele verschiedene Tumormodelle) untersucht. Während wir feststellten, dass die Therapie im Allgemeinen eine CD8-Expansion in allen Organen induzierte, stellten wir einige Unterschiede im CD8-T-Zell-Gedächtnisphänotyp zwischen den Organstellen fest (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1B-C).

Wir und andere haben bereits gezeigt, dass starke immunstimulierende Therapien gegen Krebs eine starke Proliferation von Gedächtnis- (CD44high) CD4- und CD8-T-Zellen in Milz und Lymphknoten induzieren . Es wurde auch beobachtet, dass CD4, aber nicht CD8, T-Zellen auch aktivierungsinduzierten Zelltod in einer Interferon (IFN) -γ-abhängigen Weise erfahren, was zu einer unbedeutenden Gesamtausdehnung der CD4-T-Zellen durch Zahlen in denselben Organen im Vergleich zur Baseline führt . Diese Daten wurden unter Verwendung lymphoider Organauslesungen generiert. In Anbetracht der Phänotypen, die in den mit MIN-O2, Immuntherapie behandelten Mäusen beobachtet wurden, können die Expansion, Aktivierung und Apoptose aktivierter T-Zellen in den peripheren Geweben jedoch unterschiedlich beeinflusst werden. Daher haben wir versucht, die T-Zell-Aktivierung in peripheren Organen (wo sich der Primärtumor und / oder die metastasierten Läsionen befinden können) und sekundären lymphoiden Organen (die häufig während immuntherapeutischer Studien untersucht werden) weiter zu charakterisieren und zu vergleichen Wirkungsmechanismen). Wir untersuchten CD8- und CD4-T-Zell (Foxp3neg) Frequenz, Expansion und Apoptose systemisch sowohl in lymphatischen als auch in peripheren Organen. In Übereinstimmung mit früheren Berichten unserer Gruppe, ohne ihre Gesamthäufigkeit signifikant zu verändern (Abb. 1a) führte die Anti-CD40 / IL-2-Immuntherapie zu einer signifikanten Zunahme der Gesamtzahl der CD8-T-Zellen in Milz und Lymphknoten (Abb. 1b). In Übereinstimmung mit dem Anstieg der Gesamt-CD8-Zahlen war die Häufigkeit von CD8-T-Zellen, die Bromodeoxyuridin (BrdU) in vivo inkorporierten, signifikant erhöht, und der Anteil apoptotischer Zellen, der anhand der extrazellulären Annexin-V-Expression beurteilt wurde, unterschied sich nicht signifikant von den Kontrollen (Abbildung C-D). Im Gegensatz dazu verringerte sich die gesamte CD4-T-Zellfrequenz und die Anzahl änderte sich nicht signifikant im Vergleich zu Kontrollen innerhalb derselben Organe (Abb. 1a-b). Während CD4-T-Zellen expandierten, wie durch BrdU-Inkorporation beurteilt, durchlief ein signifikanter Teil von ihnen auch Apoptose (Abb. 1c-d), was zu einer geringfügigen Nettoveränderung der Gesamtzahl führt. Diese Daten stimmten mit den zuvor beobachteten überein . Als wir nicht-lymphoide Organe einschließlich Lunge und Leber untersuchten, sahen wir ähnliche Trends sowohl bei CD4- als auch bei CD8-T-Zellen, nämlich dass CD8-T-Zellen in allen folgenden Organen expandierten und überlebten (Abb. 2a-b), während CD4-T-Zellen (Foxp3neg) expandierten und gleichzeitig in ähnlichem Ausmaß Apoptose durchliefen, was zu unbedeutenden Änderungen sowohl ihrer Frequenzen als auch ihrer Anzahl führte (Abb. 2c-d) in der Peripherie.

Die T-Zell-Gedächtnisphänotypen variieren zwischen sekundären lymphoiden Organen und peripheren nicht-lymphoiden Geweben in CD8-T-Zellen, nicht jedoch in CD4-T-Zellen

Bei Mäusen können CD4- und CD8-T-Zellen basierend auf der CD62L- (L-Selektin) und CD44-Expression weiter in Gedächtnis- und Naïve-Phänotypen eingeteilt werden, wobei CD44lowCD62L + -Population als naïv (TN), CD44highCD62L + -Population als Zentralgedächtnis (TCM) und die CD44highCD62Lneg-Population als Effektor und / oder Effektorgedächtnis (TE / EM). Es ist bekannt, dass sich CD4- und CD8-T-Zellen in ihrer Verteilung dieser Teilmengen in lymphoiden und peripheren Organen unterscheiden. Während die Naïve-Frequenzen innerhalb der CD4- und CD8-Populationen relativ ähnlich bleiben, ist die CD44high-Population in CD8-T-Zellen zentraler und in CD4-T-Zellen in einem ruhenden Organismus das Effektorgedächtnis verzerrt . In den peripheren Organen sind jedoch gewebeseitige T-Zellen sowohl innerhalb der CD4- als auch der CD8-T-Zelluntergruppen überwiegend vom Effektorgedächtnisphänotyp .Frühere Studien haben gezeigt, dass Gedächtnisphänotypzellen (CD44high) der Hauptzelltyp sind, der nach stimulierenden Immuntherapien expandierte . Um die Zusammensetzung von CD4- und CD8-T-Zellen in verschiedenen Organen besser zu verstehen, bewerteten wir ihren Gedächtnisphänotypstatus in jedem darauf folgenden Organ. In Ruhe war die CD44high-Population von CD8-T-Zellen in den lymphoiden Organen überwiegend TCM (>90%), während sie in den peripheren Organen eine Kombination mit ~ 60% TCM war (Abb. 3a, c, e,-f). Im Allgemeinen führt dies zu einer Gesamterweiterung der CD44high-Frequenz über alle Organe hinweg. Die TCM-Frequenzen waren entweder unverändert oder leicht erhöht, während die TE/EM-Populationen signifikant expandierten (Abb. 3e-f) von ~ 10% bis 30% in den lymphatischen Organen und eindrucksvoll von ~ 30-85% in den peripheren Organen.

Innerhalb der CD44high-Population der CD4-T-Zellen waren ruhende Mäuse mit etwa 60-70% im lymphoiden und 75-95% im peripheren Gewebe stärker zum TE / EM-Phänotyp geneigt (Abb. 3b, d). Wie bei den CD8-T-Zellen expandierte danach der CD44high-Anteil, aber aufgrund der Tatsache, dass er in ruhenden Mäusen über alle Organe hinweg so stark zum TE / EM-Phänotyp verzerrt war, waren die Häufigkeiten von CD4 TE / EM in IT-behandelten Mäusen über alle Organe hinweg weitgehend konsistent (Abb. 3e). Die TCM-CD4-Frequenzen blieben relativ niedrig und konsistent über alle Organe, sowohl Pre- als auch Post-IT (Abb. 3f).

Die Expression von Aktivierungsmarkern in CD4- und CD8-T-Zellen ist abhängig von Lokalisation und Gedächtnisphänotyp

Zusätzlich zu Unterschieden in Proliferation und Apoptose haben wir auch routinemäßig festgestellt, dass CD4- und CD8-T-Zellen die Aktivierung und die darauf folgenden inhibitorischen Moleküle unterschiedlich hochregulieren. Das bemerkenswerteste Beispiel dafür ist PD-1, das auf der Grundlage von Studien, die sich auf sekundäre lymphoide Organe (Milz und LN) konzentrierten, bevorzugt auf CD4 und nicht auf CD8-T-Zellen hochreguliert wurde und wahrscheinlich an dem bevorzugten AICD-Prozess beteiligt war, der in CD4 auftrat, aber nicht CD8 T Zellen danach . Ein anderes Beispiel wäre die bevorzugte Hochregulierung von NKG2D auf CD8-T-Zellen, aber nicht auf CD4, die eine durch Zuschauer induzierte lytische Fähigkeit nach starker Zytokinexposition gegenüber der Speicher-CD8-Teilmenge verleiht. Frühere Studien unseres Labors sowie Daten in Abb. 3 haben gezeigt, dass sowohl unter CD4- als auch unter CD8-T-Zellen die primären Zellen, die sich aktiv vermehren und darauf reagieren, die CD44high-Memory-Phänotypzellen sind . Daher haben wir uns als nächstes auf diese Population konzentriert.In der CD44high-Population wurde gezeigt, dass die proliferierenden CD8-T-Zellen Marker, die mit der Aktivierung durch einen Antigen-spezifischen Stimulus wie CD25 und PD-1 übereinstimmen, nicht hochregulieren, jedoch Marker hochregulieren, die es ihnen ermöglichen, einen Zuschauer-Phänotyp zu erwerben, nämlich NKG2D, was die Fähigkeit verleiht, mehr in einer NK-ähnlichen, Antigen-uneingeschränkten Weise zu wirken. Umgekehrt regulieren CD44high, proliferierende (Foxp3neg) CD4-T-Zellen PD-1 überproportional hoch (im Gegensatz zu CD8-T-Zellen und Foxp3 +, regulatorischen CD4-T-Zellen), was wir vorgeschlagen haben, ermöglicht es ihnen, bevorzugt auf die Induktion von Apoptose abzuzielen . In Übereinstimmung mit diesen früheren Berichten beobachteten wir ähnliche Phänotypen unter Milz- und lymphknotenresidenten, IT-behandelten CD44highCD8 + T-Zellen, die NKG2D signifikant hochregulierten, aber nicht PD-1 (Abb. 4a, c) und CD44highCD4+ T-Zellen, die PD-1 robust hochregulierten, jedoch nicht NKG2D (Abb. 4b, d). Als wir die gleichen phänotypischen Marker in den T-Zellpopulationen untersuchten, die in peripheren, nicht-lymphoiden Organen residierten, unterschied sich der CD44highCD8 + T-Zell-Phänotyp erheblich von dem derjenigen, die in den sekundären lymphoiden Organen residierten. Während CD44highCD8 + T-Zellen in Lunge und Leber noch NKG2D + CD25neg waren (Abb. 4a, c) schien die Häufigkeit von NKG2D + -Zellen in dieser Population von 20-30% in den lymphatischen Organen auf 40-50% in den peripheren Organen anzusteigen (Abb. 4a). Im Gegensatz zu lymphoiden Organen, in denen die PD-1-Expression unverändert war, war die PD-1-Expression in der CD44highCD8 + -Population sowohl in der Lunge als auch in der Leber signifikant erhöht (Abb. 4c). Umgekehrt war der CD44highCD4-T-Zell-Phänotyp allen Milz- und Lymphknoten-CD4-T-Zellen in allen Organen bemerkenswert ähnlich (Abb. 4b, d) mit vergleichbarer Expression von PD-1 und minimaler Hochregulation von NKG2D. CD25 wurde in CD4- oder CD8-T-Zellen an keiner Stelle hochreguliert (Daten nicht gezeigt). Dies war unerwartet, da wir zuvor vorgeschlagen haben, dass die differentielle Expression von PD-1 wahrscheinlich der zugrunde liegende Mechanismus der differentiellen Induktion der Apoptose zwischen CD4- und CD8-T-Zellen nach starken, immunstimulierenden IT-Regimen ist. In den peripheren Organen sind CD4-T-Zellen jedoch weiterhin überproportional von Apoptose betroffen, obwohl die PD-1-Expression zwischen CD4- und CD8-T-Zellen vergleichbar ist. Dieses Muster war auch deshalb interessant, weil die erhöhte Aktivierungsmarkerexpression in der Peripherie direkt mit der TE / EM-Vorherrschaft korrelierte, insbesondere im Fall von PD-1.

Kürzlich wurde gezeigt, dass zirkulierende TE / EM-Zellen erhöhte PD-1-Spiegel in Ruhe exprimieren Menschen . Daher stellten wir die Hypothese auf, dass CD8 + TE / EM-Zellen diese Aktivierungsmarker gegenüber CD8 + TCM bevorzugt exprimieren können, was zu unterschiedlichen Frequenzen von CD44highCD8 + T-Zellen führt, die Aktivierungsmarker in sekundären lymphoiden und peripheren Organen exprimieren. Daher untersuchten wir die NKG2D- und PD-1-Expression auf CD8 + CD44highCD25neg TE / EM- und TCM-Zellen in allen Organen in Ruhe- und IT-behandelten Mäusen. In Kontrollmäusen wurden sowohl NKG2D (Abb. 5a) und PD-1 (Fig. 5c) wurden in der TE/EM-Untergruppe der CD8+CD44highCD25- Population häufiger exprimiert. Die Gesamthäufigkeit der TE / EM-Population unter CD8 + T-Zellen in ruhenden Mäusen ist jedoch im Vergleich zur TCM relativ gering (Kreisdiagramme Abb. 5a) ist daher insgesamt die Expression sowohl von PD-1 als auch von NKG2D überwiegend gering (Fig. 4) da TCM die Mehrheit der CD8 + T-Zellen im Ruhezustand ausmacht. In den mit Immuntherapie behandelten Mäusen waren sowohl die NKG2D- als auch die PD-1-Expression über alle Organe hinweg erhöht (Abb. 4). Wiederum werden sowohl NKG2D (Fig. 5b) und PD-1 (Fig. 5d) wurden auf den TE/EM CD8+T-Zellen stärker exprimiert als auf den TCM CD8+T-Zellen. In den lymphatischen Organen, in denen die TE / EM-Population im Vergleich zur Kontrolle expandierte, war sie immer noch signifikant geringer als bei CD8 + TCM-Zellen (Kreisdiagramme, Abb. 5b), was zu weniger signifikanten Ausdehnungen an diesen Stellen führt. Im Gegensatz zu lymphoiden Organen machten CD8 + TE/EM-Zellen den Großteil der untersuchten peripheren Organe aus (Kreisdiagramme, Abb. 5b), wodurch die Gesamtexpression von NKG2D und PD-1 an diesen Stellen signifikant erhöht wird. Auch hier ist es wichtig zu beachten, dass in den lymphatischen Organen von Immuntherapie-behandelten Mäusen die Gesamtexpression beider Aktivierungsmarker signifikant niedriger war als in den peripheren Organen aufgrund der TCM-Schiefe in den Lymphgefäßen über die Peripherie in der CD8-Population. Die Expressionsniveaus variierten nicht stark zwischen TE / EM aus verschiedenen Organen (es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen lymphoiden und peripheren Organen) innerhalb derselben Behandlungsgruppen, nahmen jedoch im Allgemeinen bei der IT-behandelten im Vergleich zur Kontrolle zu, ein Trend, der bei NKG2D signifikanter ausgeprägt war als bei PD-1 (Abb. 5). Im Gegensatz dazu blieb die TCM-Aktivierungsmarkerexpression nicht nur zwischen Organen von Mäusen innerhalb einer Behandlungsgruppe relativ konstant, sondern auch zwischen Kontroll- und IT-behandelten Gruppen (Abb. 5a-b). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die Konstitution des gedächtnis / aktivierten Pools (TCM vs. TE / EM) den Phänotyp der aktivierten T-Zellpopulation stark beeinflusst, insbesondere bei CD8-T-Zellen, da ihre Konstitution zwischen lymphoiden und nicht-lymphoiden Organen stark variiert.

Beurteilung von T-Zellen von Patienten, die eine hochdosierte systemische immunstimulatorische Therapie erhalten

Weiter wir wollten beurteilen, ob diese Ergebnisse in menschliche Patienten übersetzt werden, die immunstimulierende Therapien gegen Krebs erhalten. Derzeit gibt es keine Studien zur Bewertung der Kombination agonistischer Anti-CD40 mit rekombinantem humanem IL-2 Wir haben unsere Kombinationstherapie jedoch routinemäßig mit anderen systemischen immunstimulatorischen Behandlungen einschließlich hochdosierter TLR-Agonisten und hochdosierter systemischer Zytokintherapien verglichen und ähnliche phänotypische und funktionelle Veränderungen an T-Zellen gezeigt, wie sie in unserem präklinischen Modell beobachtet werden . Um zu beurteilen, ob Patienten in der Klinik ähnliche Veränderungen in der Oberflächenmarkerexpression zeigten, sammelten wir periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) von metastasierten Melanompatienten, die sich einer systemischen Hochdosis-IL-2-Therapie unterziehen. Die Patienten erhielten alle 8 h 6×10 ^ 5 IE / kg für insgesamt 14 Dosen. PBMC-Proben wurden einen Tag vor Therapiebeginn (Baseline) oder am Tag 8 des ersten Therapiezyklus (Tag 8) zur Beurteilung des T-Zell-Phänotyps entnommen. Beim Vergleich von Baseline- und Tag-8-Proben zeigte sich nach einer hochdosierten IL-2-Therapie ein signifikanter Anstieg der PD-1 + -Gedächtnisphänotyp-Zellen (CD45RO +) sowohl in der CD4- als auch in der CD8-T-Zell-Untergruppe (Abb. 6a-c). Als diese Population zum Zeitpunkt von Tag 8 weiter in Zentralspeicher (CD62L +) und Effektor / Effektorspeicher (CD62L-) zerlegt wurde, exprimierte die Effektor / Effektor-Speicher-Teilmenge eine signifikant höhere PD-1-Expression als die zentrale Speicher-Teilmenge (Abb. 6d-e). Zusammen korrelieren diese Daten mit dem, was in murinen Studien beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass diese Daten auf Humanstudien anwendbar sind und ein Indikator dafür sein können, was lokal vorkommt.