Zusammenfassung
Carbendazim wurde als Fungizid häufig zur Bekämpfung von Pilzkrankheiten in der Land- und Forstwirtschaft sowie in der Tiermedizin eingesetzt. In dieser Studie wurde die akute und Reproduktionstoxizität von Carbendazim anhand eines Modells von Caenorhabditis elegans (C. elegans) bewertet, um die potenziellen Risiken dieses Fungizids in der landwirtschaftlichen Produktion und Anwendung vorläufig zu bewerten. Die Ergebnisse zeigten, dass das Wachstum von C. elegans durch 0,01 µg /L Carbendazim gehemmt wurde. Die Behandlung mit 0, 1 µg / l Carbendazim führte zu einer signifikanten Abnahme des Fortbewegungsverhaltens und zu einer signifikanten Schädigung des Fortpflanzungs- und Antioxidationssystems, wodurch die Lebensdauer der Nematoden drastisch verkürzt wurde. Diese Ergebnisse liefern ein besseres Verständnis des Umweltrisikos von Carbendazim und werfen neue Sicherheitsbedenken auf.
1. Einführung
Pestizide, eine Art chemische oder biologische Reagenzien, werden in der Landwirtschaft häufig zur Regulierung des Pflanzenwachstums und zur Bekämpfung von Krankheiten und Insektenschädlingen eingesetzt, wodurch das Pflanzenwachstum gefördert und der Ernteertrag verbessert werden kann . Der weit verbreitete Einsatz von Pestiziden führt jedoch zu unterschiedlich hohen Rückständen in Kulturpflanzen oder Lebensmitteln und beeinträchtigt somit die menschliche Gesundheit . Die Probleme der Pestizidrückstände haben nicht nur große Aufmerksamkeit der Verbraucher auf sich gezogen, sondern sind auch zu einem der Schlüsselfaktoren für die Lebensmittelsicherheit geworden .
Carbendazim wurde als Breitbandfungizid zur Bekämpfung von Pilzkrankheiten in der Land- und Forstwirtschaft sowie in der Tiermedizin eingesetzt . Carbendazim wird jedoch von der Weltgesundheitsorganisation in die gefährliche Kategorie der Chemikalien eingestuft und von der Europäischen Kommission in die Prioritätenliste der endokrin wirksamen Chemikalien aufgenommen . In den letzten Jahren ist es offensichtlich, dass die weit verbreitete Verwendung von Carbendazim mit Überreichweite und Überdosierung und die Tatsache, dass Carbendazim schwer abgebaut werden kann, beide zum Problem der Carbendazim-Rückstände in der Landwirtschaft führen . Obwohl die toxische Wirkung von Carbendazim seit den 1980er Jahren berichtet wurde, wird die Toxizität von Carbendazim aufgrund der zunehmenden Besorgnis über endokrine Disruptoren in der Umwelt zu einem heißen Thema . Carbendazim wurde in mehreren Ländern wegen seiner negativen Auswirkungen auf Umwelt und Gesundheit wie Entwicklungs- und Fortpflanzungsstörungen, Toxizität und Mutagenität verboten . Die nachteiligen Wirkungen von Carbendazim auf die biochemischen, histopathologischen und hämatologischen Parameter in Leber, Niere und endokrinen Drüsen sowie deren Hormonspiegel wurden bei Ratten veranschaulicht . Darüber hinaus bedarf es weiterer Untersuchungen zu niedrigen Konzentrationen aufgrund der Rückstände von Carbendazim.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) wird als wichtiges Forschungsmodell häufig zur Beurteilung verwendet. Nach Amrit et al. , C. elegans hat viele Vorteile, wie geringe Größe, schnelle Generationszeit, einfache Kultivierung im Labor und kurze Lebensdauer für Erwachsene. C. elegans wurde in dieser Studie als Modellorganismus ausgewählt, um die Toxizität niedriger Carbendazim-Konzentrationen zu bewerten, die als Referenzwert für die Anwendung von Carbendazim in der Landwirtschaft angesehen werden können.
2. Materialien und Methoden
2.1. Chemikalien und Stämme
Carbendazim (Reinheit ≥ 99%; Aladdin® Biochemical Technology Co., LTD, Shanghai, China) wurde in N, N-Dimethylformamid (DMF; Sinopharm Chemical Reagent Co., LTD, Shanghai, China) zur Herstellung von 1 g/L Carbendazim Originallösung. Die Konzentrationen von DMF betrugen 0,1% in endgültigen Expositionslösungen (0.01, 0.1, 1, 10, 100 µg/l). 0,1% DMF ohne Carbendazim war die Kontrollgruppe. C. elegans (Wildtyp N2) wurde ursprünglich vom Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, MN, USA) erhalten. Die Nematoden wurden auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platten kultiviert, die wie beschrieben bei 20°C mit Escherichia coli OP50 ausgesät wurden. L1-Larven von C. elegans wurden durch Waschen der graviden Nematoden mit einer Bleichmischung (1 M NaOH, 10% NaHOCl) gesammelt.
2.2. Letalität
Carbendazim-Originallösungen (1 g/ l) wurden mit einem flüssigen Medium verdünnt (1,12 g K2HPO4, 5,92 g KH2PO4 und 5,85 g NaCl wurden mit 1 L Wasser verdünnt), um die endgültigen Carbendazim-Konzentrationen von 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, und 1 mg/l, die 0,1% DMF enthielten. S flüssiges Medium mit 0,1% DMF war die Kontrollgruppe. Für jede Konzentration wurden 30 Nematoden (L4) in 96-Well-Platten getestet. Das Überleben der Nematoden wurde nach 24-stündiger Kultivierung im Inkubator unter dem Mikroskop gezählt. Das Verfahren des Tests basiert auf der Methode von Xiang et al. . Drei parallele Experimente waren erforderlich.
2.3. Locomotion Behavior
Mindestens 10 C. elegans (L4) wurden zufällig aus jeder Konzentration ausgewählt, um das Lokomotivverhalten zu bestimmen, das sowohl durch die Kopf-Thrash-Frequenz als auch durch die Körperbiegezeiten aufgezeichnet wurde . Die Anzahl der Head-Thrash-Frequenzen wurde durch Änderungen der Biegerichtung am Mittelkörper von C. elegans in 1 min gezählt. Die Messung der Körperbiegung wurde definiert als die Zeiten der Richtungsänderungen des in NGM kultivierten Teils der Nematoden ohne E. coli OP50 in den 30 s.
2.4. Wachstums- und Entwicklungstests
C. elegans, das 24 h Carbendazim ausgesetzt war, wurde analysiert. Die Körperlänge von Nematoden, die Carbendazim ausgesetzt waren, wurde mit der Image J-Software bewertet. Die Nachkommen jedes C. elegans von L4-Larven bis Tag 1 wurde im L3-Stadium aufgezeichnet, nachdem sie jeden Tag einzeln auf eine neue Platte übertragen wurden, bis die Fortpflanzung aufhörte . Es wurden mindestens drei parallele Tests durchgeführt.
2.5. Lebensdaueranalyse
Alle auf Lebenszeit getesteten C. elegans wurden im gleichen Zustand bei 20°C kultiviert. Die synchronisierten C. elegans wurden in NGM-Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen von Carbendazim bis Tag 4 kultiviert. Die getesteten Nematoden würden dann alle 2 Tage in neue NGM-Platten überführt. Überlebende und Tote C. elegans wurden täglich (beginnend am ersten Tag des Erwachsenenalters) aufgezeichnet, bis alle Nematoden für jede Konzentration gestorben waren . Es wurden mindestens drei parallele Tests durchgeführt.
2.6. Bestimmung der oxidativen Schädigung
Intrazellulärer ROS wurde mit 2′,7′-Dichlordihydrofluorosceindiacetat (H2DCFH-DA) gemessen, der mit Abstand gebräuchlichsten und empfindlichsten reaktiven Sauerstoffnachweissonde. Die Wildtyp-N2 C. elegans wurden in M9-Puffer gewaschen und anschließend mit Ultraschall aufgeschlossen. Der Überstand wurde gemäß den Anweisungen des ROS-Kits auf ROS-Niveau analysiert. Die endgültige Arbeitskonzentration von H2DCHE-DA betrug 10 μΜ. Die Anregungs- und Emissionsabsorptionswellenlängen betrugen 485 nm bzw. 535 nm. Es wurden mindestens drei parallele Tests durchgeführt.
Die intrazelluläre Gesamtsuperoxiddismutase (T-SOD) wurde gemäß den Anweisungen des T-SOD-Kits bestimmt, das vom Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute gekauft wurde. Nach dreimaligem Waschen mit M9 wurden die untersuchten Nematoden mit Ultraschall aufgeschlossen und mit einem T-SOD-Kit zur Reaktion gebracht. Die Extinktionswellenlänge betrug 550 nm. Zusätzlich wurde der Überstand verwendet, um den Proteingehalt für jede Konzentration nachzuweisen, bei der die Absorptionswellenlänge 595 nm betrug. Es wurden mindestens drei parallele Tests durchgeführt.
2.7. Datenanalyse
Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) unter Verwendung einer Einweg-ANOVA angegeben. Diagramme wurden mit Origin 8.5 und GraphPad Primer 7 dargestellt, und statistische Analysen wurden mit der SPSS 19.0-Software durchgeführt. Das statistische Signifikanzniveau wurde mit und durchgeführt .
3. Ergebnisse
3.1. Bestimmung des Fortbewegungsverhaltens von C. elegans after Carbendazim Acute Exposures
LC50C. elegans were exposed to carbendazim for 24 hours to assess its acute toxic effects. Data are represented as shown in Table 1, and the obtained linear fitting equation was y = 2.180x − 0.223 through data analysis. The obtained LC50 is 0.867 mg/L.
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Next, we assayed the determination of the locomotive behavior of C. elegans nach Carbendazim akuten Expositionen durch Analyse der Daten über Kopf-Thrash-Frequenz und Körperbiegezeiten von Nematoden (Abbildungen 1 (a) und 1 (b)). Beide zeigten signifikante Abnahmen bei Carbendazimkonzentrationen im Bereich von 0,01 µg/l bis 100 µg/l (). Darüber hinaus verringerten sich die Kopfschläge von Nematoden, die 100 µg / l ausgesetzt waren, auf 68,27%. Für den Körperbiegungstest hatte Carbendazim bei Konzentrationen von 10 µg / l und 100 µg / l eine signifikante Hemmwirkung auf die Körperbiegungen von C. elegans um 36,77% bzw. 35,48% im Vergleich zur Kontrolle.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. Bestimmung des Wachstums und der Entwicklung von C. elegans nach Carbendazim-Akutexpositionen
Im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildungen 1 (c) und 1(d)) waren die Körperlänge und die Körperoberfläche in den Expositionsgruppen signifikant () von 0,01 µg / l auf 100 µg / l reduziert. Beide waren bei der Behandlung von 0,01 µg / l im Vergleich zur Kontrollgruppe um 19,16% bzw. 22,15% verringert. Die Konzentration von 10 µg / l zeigte die negativsten Auswirkungen, und die Körperlänge und die Körperoberfläche von C. elegans waren im Vergleich zur Kontrollgruppe um 35, 21% bzw. 65, 22% verringert.
3.3. Bestimmung der Brutgrößen von C. elegans nach Carbendazim-Akutexposition
Gemäß Abbildung 2 hatten die Brutgrößen von Nematoden in den Behandlungsgruppen eine signifikante Abnahme () von 0,1 µg / l auf 100 µg/ L. Die Brutgrößen von C. elegans nahmen am signifikantesten ab, die bei der Behandlung von 10 µg / l im Vergleich zur Kontrollgruppe auf 43,71% abnahmen.
3.4. Bestimmung der Lebensdauer von C. elegans nach akuter Carbendazim-Exposition
Die Lebensdauer von C. elegans wurde gemäß der in Abbildung 3 gezeigten Lebensdauerkurve um 0,01 µg / l bis 100 µg/ l carbendazim signifikant gehemmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Lebensdauer von C. elegans unter Behandlung mit 0, 01 µg / l Carbendazim von 24 auf 20 Tage verringert wurde. Die Lebensdauer von Nematoden, die mit 0,01 µg / l Carbendazim behandelt wurden, wurde um 20,00% reduziert. Bei einer Carbendazim-Expositionskonzentration von 100 µg / l verringerte sich die Lebensdauer von C. elegans am stärksten um 45,83%.
3.5. Auswirkungen einer akuten Carbendazim-Exposition auf das antioxidative System von C. elegans
Die ROS-Werte von Kontroll- und behandeltem C. elegans bei Carbendazim-Exposition unterschiedlicher Konzentrationen sind in Abbildung 4 (a) dargestellt. Es wurde gezeigt, dass der intrazelluläre ROS-Spiegel im Bereich von 0,01 µg / l bis 100 µg / l Carbendazim signifikant erhöht war (). Verglichen mit der Kontrolle war der ROS-Spiegel bei der Behandlung von 10 µg / l höchstens um 70,60% erhöht.01 µg/l bis 100 µg/l Carbendazim (Abbildung 4(b)). Der SOD-Spiegel war bei 0,1 µg / l Carbendazim im Vergleich zur Kontrollgruppe um 10,70% erhöht.
(ein)
(ein)
(ein)
(b)
4. Diskussion
Carbendazim wird als Fungizid in der Landwirtschaft häufig verwendet, um das Wachstum von Pilzen zu hemmen. Carbendazim ist verboten worden, um in Australien, in den meisten der Europäischen Union und in den USA wegen seiner strengen Toxikologie und hartnäckigen Natur zu verwenden. Für diese Studie war es das erste Mal, C zu verwenden. elegans als Modellorganismen zur Bewertung der Auswirkungen von Carbendazim auf Lokomotivverhalten, Wachstum und Entwicklung, Reproduktion, Lebensdauer und antioxidative Systeme. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass es einen negativen Einfluss auf C. elegans hatte.
Gemäß der 24 h-LC50 beträgt die akute Toxizitätskonzentration von C. elegans, die verschiedenen Konzentrationen von Carbendazim ausgesetzt ist, 0,867 mg / L. Die 96-h-LC50 von Carbendazim als Reaktion auf Zebrafisch wurde mit 1,75 mg / L dargestellt . Die Eier der preußischen Karpfen Carassius gibelio hat die Toxizität Effekte bei einer Konzentration von 0,036 mg/l gezeigt. Studien zeigten, dass das Wachstum und die Entwicklung von Navicula sp. wird durch Carbendazim mit einem 24 h-EC50-Wert von 2,18 mg / l gehemmt. Obwohl die Algenwachstumsrate nach 72-stündiger Exposition wieder hergestellt wird, bleibt der Chlorophyll-a-Gehalt signifikant verringert, wenn die Behandlung mit Carbendazim über 0,5 mg / l lag. In dieser Studie wurden C. elegans, die einer niedrigen Konzentration von Carbendazim ausgesetzt waren, ausgewählt, um ihre Wirkungen in Abhängigkeit von der tatsächlichen Konzentration der täglichen Exposition des Menschen zu bewerten. Niedrige Konzentrationen von Carbendazim bedeuten nicht, dass es sicher ist. Carbendazim zeigt in einigen Studien negative biologische Auswirkungen bei viel niedrigeren Dosen.
Das Verhalten der Lokomotive wurde ausgewertet, um die Neurotoxizität von C. elegans (L4-Larve) nach 24-stündiger Carbendazim-Exposition zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigten, dass Carbendazim negative Auswirkungen auf das Verhalten der Lokomotive durch den Nachweis von Kopfdrücken und Körperbeugen von C. elegans haben könnte, die beide bei der höheren Expositionsgruppe empfindlicher waren. Das Bewegungsverhalten von Zebrafischembryonen, die Carbendazim ausgesetzt sind, ist empfindlich . Frühere Studien haben gezeigt, dass Fische ein abnormales Verhalten zeigen, wenn die subletalen Konzentrationen von Carbendazim 0,22–0,43 mg / l betragen.
Entwicklungsfehlbildungen könnten auch ein Grund für abnormale Fortbewegung sein . Das Wachstum und die Entwicklung von C. elegans wurden in unserer Studie untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Körperlänge und die Körperfläche von C. elegans bei der Behandlung von mehr als 0,01 µg / L Carbendazim signifikant verengt waren. Das normale Wachstum von Wirbeltieren hängt mit der metabolischen Homöostase des Schilddrüsenhormons zusammen . In: Williams et al. haben gezeigt, dass Carbendazim Spermienverlust nach Implantation, fetale Missbildung und langsames Wachstum und Entwicklung verursachen kann.
Die Reproduktionstoxizität von Carbendazim wurde nachgewiesen, dass Carbendazim die Mikrotubuli-Polymerisation von Pilz- und Säugetierzellen hemmen kann, wodurch die Mikrotubuli-Assemblierung durch Einwirkung von β-Tubulin gestört wird, was zu einer Beeinträchtigung der Chromosomensegregation bei der Zellteilung führt . Die Bildung von Mikrotubuli durch nichtkovalente Bindungen von α- und β-Tubulin ist für die Chromosomensegregation im Prozess der Mitose und Meiose verantwortlich . Die Brutgröße von C. elegans nimmt bei 0,1 µg / l Carbendazim-Konzentration signifikant ab. Es wurde festgestellt, dass Carbendazim die Fortpflanzungssysteme bei japanischen Wachteln und Hamstern beeinflusst . Basierend auf unserer Studie wurde der Schluss gezogen, dass die Lebensdauer von C. elegans mit einer Carbendazim-Konzentration von ≥0,01 µg / l signifikant verringert war. Studien haben gezeigt, dass Carbendazim zu Unfruchtbarkeit und Entwicklungstoxizität geführt hat und Embryotoxizität, Keimzellapoptose und Teratogenese bei verschiedenen Säugetierarten manifestiert .
Apoptose ist ein komplexer programmierter Zelltod, ein stark reguliertes Phänomen, das durch eine Reihe zellulärer Prozesse gekennzeichnet ist . Viele Studien haben gezeigt, dass die durch oxidativen Stress induzierte Produktion von ROS mit dem apoptotischen Zelltod zusammenhängt . Unsere Studie ergab, dass Carbendazim einen signifikanten Anstieg der ROS-Werte und einen geringen Anstieg der SOD-Werte bewirken kann. Oxidativer Stress, der durch Umweltverschmutzung verursacht wird, induziert die erhöhte Expression von ROS und schädigt anschließend das antioxidative Abwehrsystem . SOD ist verantwortlich für die Entgiftung toxischer freier Radikale und ihrer Aktivitäten, die zur Bewertung des oxidativen Stressniveaus und des zellulären Antioxidansstatus verwendet werden . Metalloenzym SOD beschleunigt die Umwandlung von endogenen zytotoxischen Superoxidradikalen in H2O2, und die Erhöhung der SOD-Expressionsniveaus kann zur Verbesserung der Enzymaktivitäten beitragen, um die durch Carbendazim induzierten Superoxidradikale zu eliminieren und das Auftreten von Zellfunktionsstörungen während der Exposition von Carbendazim zu verhindern . Höhere Carbendazim-Expositionskonzentrationen können schweren oxidativen Stress verursachen, der anschließend das Gleichgewicht der Zellhomöostase zerstört und die Apoptose fördert . Carbendazim in geringen Konzentrationen könnte jedoch nach unseren Ergebnissen das Fortpflanzungssystem immer noch erheblich schädigen.
5. Schlussfolgerung
Soweit wir wissen, wurde in der vorliegenden Studie die Sicherheit von Carbendazim untersucht, das zum ersten Mal C. elegans ausgesetzt war. Es zeigte sich, dass Carbendazim eine schädliche Wirkung auf das motorische Verhalten, die Entwicklung und das Wachstum, die Fortpflanzung, die Lebensdauer und das antioxidative System von C. elegans haben könnte. Hoffe, dass es mehr Aufmerksamkeit auf die Anwendung von Carbendazim basierend auf den Ergebnissen zahlen muss. Darüber hinaus muss die Sicherheit von Carbendazim zur Anwendung weiter bewertet werden, insbesondere die Bioakkumulationstoxizität und mögliche genotoxische Wirkungen.
Datenverfügbarkeit
Alle Daten, die während dieser Studie generiert oder analysiert wurden, sind in diesem Artikel enthalten.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Danksagung
Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (31501569) unterstützt.
