Ergebnisse

Wir haben zunächst untersucht, ob sich CD63 und die H,K-ATPase in Magenbelietalzellen im selben subzellulären Kompartiment befinden. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Parietalzellen von Ratten hohe CD63-Spiegel exprimieren (22). Die Immunfluoreszenzmikroskopie an gefrorenen Abschnitten des Rattenmagens zeigt, dass CD63 in den meisten Zellen des Rattenmagens, einschließlich der Belegzellen, vorhanden ist (Abb. 1A). CD63 kolokalisiert teilweise mit dem HKa in Belegzellen. Zusätzlich analysierten wir ein hochgereinigtes TVE-Präparat aus Schweinemagen (ein freundliches Geschenk von C. T. Okamoto). H,K-ATPase trägt ≈50% zum Proteingehalt in ähnlichen Präparaten bei (23). Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass CD63 in dieser gereinigten Zubereitung von TVEs reichlich vorhanden ist (Abb. 1B).

Um eine mögliche in situ Wechselwirkung zwischen CD63 und der H,K-ATPase zu untersuchen, führten wir Pull-down Experimente mit biotinyliertem Tomatenlektin durch. Frühere Studien haben gezeigt, dass dieses Lektin spezifisch und einzigartig an das HKß in Magenpräparaten bindet (24-27). Wir blotteten ein TVE-Präparat mit Anti-HKß-mAb und biotinyliertem Tomatenlectin, um zu bestätigen, dass das Lektin spezifisch mit dem glykosylierten HKß assoziiert ist (Abb. 1C). Wir verwendeten dann biotinyliertes Tomatenlektin, um Proteine zu isolieren, die mit dem HKß in der TVE-Präparation interagieren. Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass CD63 durch Tomatenlectin ausgefällt wird (Abb. 1D), was zeigt, dass CD63 und die H,K-ATPase in situ assoziieren und darauf hindeutet, dass diese Assoziation physiologisch relevant sein kann. Eine Vorbehandlung der TVE-Präparation mit 4% SDS, gefolgt von einer 20-fachen Verdünnung in Lysepuffer, reduzierte signifikant die Menge an CD63, die ausgefällt wurde. Die Menge des ausgefallenen HKß wurde durch diese Behandlung nicht verändert (Daten nicht dargestellt). Diese Daten legen nahe, dass das Vorhandensein von CD63 im Pull-Down auf seine Assoziation mit dem HKß und nicht auf eine direkte Assoziation zwischen CD63 und Tomatenlektin zurückzuführen ist.

Um die funktionelle Bedeutung der Wechselwirkung zwischen CD63 und dem HKß weiter zu untersuchen, transfizierten wir COS-7-Zellen mit einer cDNA, die für HKß kodiert, entweder einzeln oder zusammen mit einer cDNA, die für ein FLAG-markiertes CD63-Konstrukt (CD63-FL) kodiert. Wir haben gezeigt, dass sich das HKß nicht mit dem HKa ansammeln muss, um die Zelloberfläche in transfizierten COS-Zellen zu erreichen (20). Wir haben ein CD63-Konstrukt verwendet, das ein FLAG-Epitop-Tag an seinem N-Terminus trägt, da der C-Terminus von CD63 ein Tyrosin-basiertes Motiv enthält, das für den intrazellulären Transport dieses Tetraspanins erforderlich ist (13).

COS-Zellen, die mit dem HKß und CD63-FL kotransfiziert wurden, wurden einer Immunpräzipitation unter Verwendung eines Anti-FLAG-pAb unterzogen. Die Western-Blot-Analyse des immunpräzipitierten Materials zeigt, dass das HKß mit CD63 copräzipitiert (Abb. 2, HKß + CD63-FL). Die CD63-FL- und HKß-Proteine coimmunopräzipitieren in einer Vielzahl von Detergenzien, einschließlich 2% CHAPS, 1% Brij 96 und 1% Triton X-100. Die Assoziation zwischen CD63 und dem HKß stellt einen der wenigen beschriebenen Tetraspaninkomplexe dar, der die Solubilisierung in Triton X-100 überlebt und somit wahrscheinlich eine direkte Wechselwirkung darstellt (28). Die β-Untereinheit hat zwei Formen: ßm (reif), das mit komplexen Kohlenhydraten modifiziert ist, und ßc (Kern), das mit Kohlenhydraten mit hohem Mannosegehalt modifiziert ist (29). Beide Formen kopräzipitieren mit CD63, obwohl das Verhältnis von ßc zu ßm im Niederschlag in Abhängigkeit von den Solubilisierungsbedingungen variiert.

Das HKß wurde in den FLAG-Immunpräzipitationen, die an mit dem HKß allein transfizierten Zellen durchgeführt wurden, nicht nachgewiesen, was zeigt, dass das FLAG pAb nicht mit der β-Untereinheit interagiert (Abb. 2, HKß). Das HKß fällt nicht mit FLAG pAb aus einer Mischung (50:50, vol / vol) von Lysaten zusammen, die aus Zellen hergestellt wurden, die einzeln mit CD63-FL und der β-Untereinheit transfiziert wurden, was bestätigt, dass die Wechselwirkung in vivo auftritt (Abb. 2, zweite Spur). Proben, die mit FLAG pAb inkubiert wurden, fällen das lysosomale Protein Lamp-1 nicht aus, was darauf hinweist, dass die Wechselwirkung zwischen CD63-FL und dem HKß spezifisch ist und kein Artefakt einer unvollständigen Solubilisierung des CD63-Kompartiments (Abb. 2).

Wir haben dann untersucht, ob die Wechselwirkung zwischen dem HKß und CD63 die subzelluläre Lokalisation der β-Untereinheit beeinflusst. In transient transfizierten COS-Zellen liegt das HKß an der Zelloberfläche vor (Abb. 3 A-C). Es gibt eine ausgeprägte Umverteilung der β-Untereinheit zu intrazellulären CD63-haltigen Vesikeln, wenn COS-Zellen sowohl mit dem HKß als auch mit CD63-FL kotransfiziert werden (Abb. 3 D-F). Um auszuschließen, dass diese veränderte Lokalisation ein unspezifischer Effekt der CD63-Überexpression sein könnte, untersuchten wir den Effekt der CD63-Expression auf die Verteilung von AQP4. AQP4 ist ein Wasserkanal, der in den basolateralen Plasmamembranen von Belegzellen vorhanden ist. Es unterliegt keiner regulierten Endozytose und Exozytose mit der H,K-ATPase (30, 31). Dieser Kanal coimmunopräzipitiert nicht mit CD63-FL in einem Triton X-100-Lysat von cotransfizierten COS-Zellen (Abb. 4A). Wenn cotransfizierte Zellen durch konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden, ist AQP4 nicht im CD63-haltigen Kompartiment vorhanden (Abb. 4B), was darauf hinweist, dass die CD63-induzierte Umverteilung zu intrazellulären Vesikeln spezifisch für Proteine ist, die mit diesem Tetraspanin interagieren.

Um die Mechanismen der CD63-vermittelten Umverteilung des HKß zu untersuchen, nutzten wir neuere Arbeiten, die den intrazellulären Transport von CD63 charakterisiert haben. Rous et al. (13) zeigten, dass das Tyrosin-basierte Motiv, das am äußersten C-Terminus von CD63 vorhanden ist, mit den Adapteruntereinheiten μ2 und μ3 interagiert. Das μ2-Protein ist ein Mitglied des heterotetrameren AP-2-Komplexes. Dieser Komplex ist an der Plasmamembran vorhanden und verbindet Frachtproteine mit der Clathrinhülle, wodurch ihre Endozytose vermittelt wird (14). Das μ3-Protein ist ein Mitglied des heterotetrameren AP-3-Komplexes. Dieser Komplex ist am lysosomalen Targeting beteiligt und befindet sich sowohl im Trans-Golgi-Netzwerk als auch in einem vesikulären Kompartiment, das teilweise mit Endosomen kolokalisiert ist (12). Wenn das YEVM-Tyrosin-basierte Motiv von CD63 zu AEVM mutiert ist, kann CD63 weder mit μ2 noch mit μ3 interagieren und wird hauptsächlich auf der Zelloberfläche exprimiert (13). Wenn das HKß mit dem FLAG-markierten CD63-AEVM-Konstrukt coexprimiert wird, werden sowohl CD63-AEVM als auch die β-Untereinheit auf der Zelloberfläche verteilt (Abb. 3 G-I). Somit wird die intrazelluläre Verteilung des HKß durch Handelssignale beeinflusst, die in den CD63-zytoplasmatischen Schwanz eingebettet sind.

Wenn die YEVM-Sequenz im Schwanz von CD63 zu YEVI mutiert ist, interagiert das modifizierte Motiv weiterhin mit μ3, assoziiert sich aber nicht mehr mit μ2 (13). CD63-YEVI ist hauptsächlich im späten endosomal–lysosomalen Kompartiment lokalisiert, höchstwahrscheinlich, weil sich das veränderte Tetraspaninprotein nach seiner anfänglichen biosynthetischen Passage durch den Golgi direkt in dieses Kompartiment bewegt (13). Die kleine Population von CD63-YEVI, die die Plasmamembran erreicht, zeigt eine gestörte Internalisierung, da sie nicht mehr mit μ2 interagieren kann (13). Wenn das HKß und ein FLAG-markiertes CD63-YEVI-Konstrukt in COS–Zellen coexprimiert werden, ist ein Großteil des CD63-YEVI im späten endosomal-lysosomalen Kompartiment lokalisiert; Die β-Untereinheit verbleibt jedoch auf der Zelloberfläche und wird nicht in ein intrazelluläres Kompartiment umverteilt (Abb. 3 J-L). Die Coimmunpräzipitationsanalyse bestätigt, dass das HKß sowohl mit CD63-YEVI als auch mit CD63-AEVM assoziiert sein kann (Daten nicht gezeigt). Diese Daten legen nahe, dass diese Proteine an der Zelloberfläche interagieren und als Komplex endozytiert werden müssen, damit das HKß in ein CD63-positives intrazelluläres Kompartiment verteilt werden kann.

Um festzustellen, ob das in intrazellulären Vesikeln nachgewiesene HKß einem Protein entspricht, das von der Oberfläche der Zelle endozytiert wurde, beobachteten wir die Internalisierung der β-Untereinheit in Gegenwart und Abwesenheit exogener CD63-Expression. COS-Zellen wurden mit dem HKß und CD63-FL kotransfiziert. Die Zellen wurden dann auf 4 °C gekühlt, um die Endozytose zu stoppen, und mit dem HKß-mAb markiert. Die markierten Zellen wurden 40 min bei 37 °C inkubiert, damit die Endozytose wieder aufgenommen werden konnte. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf 4°C abgekühlt und mit Cy5-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG oberflächenmarkiert. Die Zellen wurden fixiert und mit Anti-FLAG-pAb inkubiert und dann sowohl mit Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG als auch mit Rhodamin-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG markiert. So wurde das auf der Oberfläche verbliebene HKß auf dem Cy5-Kanal, internalisiertes HKß auf dem Fluoresceinisothiocyanatkanal und CD63-FL auf dem Rhodaminkanal visualisiert. Diese Analyse zeigte, dass internalisierte β-Untereinheit mit CD63 kolokalisiert, was darauf hindeutet, dass der Pool des mit CD63 kolokalisierten HKß durch Endozytose von der Zellmembran abgeleitet wird (Abb. 5 E-H). Zellen, die CD63 nicht überexprimieren, zeigen nach einer 40-minütigen Inkubation eine viel weniger internalisierte β-Untereinheit (Abb. 5 A-D).

Um die Internalisierung des HKß zu quantifizieren und weiter zu verifizieren, dass das HKß und CD63 an der Oberfläche der Zelle assoziieren, führten wir Zelloberflächen-Biotinylierungsexperimente durch. Im ersten Versuch wurden COS-Zellen mit der β-Untereinheit allein transfiziert und bei 4°C mit Biotin-SS-N-Hydroxysuccinimidester biotinyliert. Anschließend wurden die Proben bei 37°C für verschiedene Zeiträume inkubiert, damit die Endozytose wieder aufgenommen werden konnte. Die Zellen wurden auf 4 °C zurückgeführt, und eine Platte von jedem Zeitpunkt wurde durch Einwirkung des membrandichten Reduktionsmittels MesNa vom verbleibenden Zelloberflächen-Biotin befreit. Die Zellen wurden lysiert und mit Streptavidin-Beads inkubiert. Proteine, die mit den Streptavidin-Beads assoziiert waren, wurden durch SDS/PAGE getrennt und die Membranen mit dem HKß-mAb untersucht (Abb. 6A). Der Anteil der β-Untereinheit an der Zelloberfläche ändert sich mit fortschreitender 37°C-Internalisierung nicht merklich. Nach den ersten 10 min wird ein kleiner Anteil des oberflächenmarkierten HKß innerhalb der Zelle sequestriert, und das Verhältnis von Oberfläche zu internalisiertem HKß bleibt hoch. Diese Daten legen nahe, dass die β-Untereinheit, die nicht mit CD63 assoziiert ist, entweder sehr langsam internalisiert oder internalisiert wird, aber schnell wieder an die Oberfläche zurückgeführt wird, ähnlich wie der Transferrinrezeptor.

Als nächstes haben wir versucht, das Verhalten des HKß zu charakterisieren, das mit CD63 assoziiert ist. COS-Zellen wurden mit dem HKß und CD63-FL kotransfiziert. Die Zellen wurden wie oben beschrieben biotinyliert und gestrippt. Zur Isolierung der Population des mit CD63 assoziierten HKß wurde das Zelllysat mit FLAG pAb und Protein A-konjugierten Agarosekugeln inkubiert. Das immunpräzipitierte Material wurde mit einer kleinen Menge Puffer enthaltend 3% SDS eluiert, mit 1% Triton X-100 30fach verdünnt und mit Streptavidin-Beads inkubiert. Proteine, die mit den Streptavidin-Beads assoziiert waren, wurden mittels SDS/PAGE abgetrennt und mit dem HKß-mAb untersucht (Abb. 6B). Für Zellen, die keinem Strippprotokoll unterzogen wurden, repräsentiert das in diesem Western Blot detektierte Signal den gesamten Pool an oberflächenmarkierten β-Untereinheiten, die mit CD63 assoziiert sind, einschließlich Komplexen, die sich noch an der Plasmamembran befanden, und Komplexen, die in Vesikeln internalisiert worden waren. Für Zellen, die einem Strippprotokoll unterzogen wurden, repräsentiert das Signal die Population der β-Untereinheit, die mit CD63 assoziiert ist, die während der Biotinylierung an der Zelloberfläche vorhanden war und anschließend internalisiert und vor dem MesNa-Streifen geschützt wurde.

Zum 0-min-Zeitpunkt wird biotinyliertes HKß leicht in Anti-FLAG-Immunpräzipitaten aus ungestreiften Zellen nachgewiesen, was zeigt, dass HKß und CD63 an der Zelloberfläche zur Assoziation fähig sind. Das gesamte zum 0-min-Zeitpunkt gewonnene biotinylierte HKß ist empfindlich gegenüber dem MesNa-Streifen. Die Menge an CD63-assoziierter, biotinylierter β-Untereinheit, die vor dem MesNa-Reagenz geschützt ist, nimmt zu, wenn man die Zellen bei 37 ° C inkubieren lässt. Tatsächlich ist die Menge des auf der Oberfläche vorhandenen und mit CD63 assoziierten HKß bei 0 min ungefähr gleich der Menge an HKß, die mit CD63 assoziiert und vor dem Strippen bei 45 min geschützt ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die mit CD63 assoziierte β-Untereinheit internalisiert ist und nicht zur Zelloberfläche zurückkehrt.