Zusammenfassung
Cystein-Cathepsine sind eine Gruppe von Enzymen, die normalerweise in den Endolysosomen vorkommen, wo sie hauptsächlich am intrazellulären Proteinumsatz beteiligt sind, aber auch eine entscheidende Rolle bei der MHC II-vermittelten Antigenverarbeitung und -präsentation spielen. Bei einer Reihe von Pathologien wurde jedoch festgestellt, dass Cystein-Cathepsine stark hochreguliert und in das extrazelluläre Milieu sezerniert sind, wo sie eine Reihe von extrazellulären Proteinen abbauen. Eine wichtige Rolle bei der Modulation von Cathepsin-Aktivitäten spielen Glykosaminoglykane, die nicht nur ihre autokatalytische Aktivierung auch bei neutralem pH-Wert erleichtern, sondern auch ihre Aktivitäten kritisch modulieren, wie im Fall der kollagenolytischen Aktivität von Cathepsin K. Die Wechselwirkung zwischen Cathepsinen und Glykosaminoglykanen wird ausführlicher diskutiert.
1. Einleitung
Cystein-Cathepsine sind Mitglieder der Papain-ähnlichen Cystein-Peptidase-Familie . Trotz der Tatsache, dass die elf im Menschen vorkommenden Cystein-Cathepsine nur einen kleinen Teil des menschlichen proteolytischen Repertoires ausmachen, haben diese Enzyme aufgrund ihrer vielfältigen Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, die vom unspezifischen Proteinumsatz innerhalb des endolysosomalen Weges bis hin zu hochspezialisierten Funktionen in der Gewebehomöostase reichen, viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Kürzlich wurden eine Reihe hervorragender Übersichten veröffentlicht, die die strukturellen und funktionellen Eigenschaften von Cysteinkathepsinen bei Gesundheit und Krankheit zusammenfassen .
Alle Cathepsine teilen sich das gleiche strukturelle Gerüst, auch Papain-ähnliche Falte genannt. Die Struktur besteht aus zwei Subdomänen, die aufgrund ihrer Position als L- und R-Domänen bezeichnet wurden, wenn das Molekül in der Standardorientierung dargestellt wird (Abbildung 1). Der aktive Zentrum-Spalt befindet sich an der Spitze des Moleküls zwischen den L- und R-Domänen und enthält die konservierte katalytische Dyade Cys-His (markiert durch gelbe und blaue Kugeln in Abbildung 1, bzw.). Im Allgemeinen können Papain-ähnliche Peptidasen als Endo- oder Exopeptidasen wirken. In einer typischen Endopeptidase ist die primäre Spezifitätsdeterminante die S2-Stelle und gut bestimmte Stellen auf dem Enzym interagieren mit den Resten P3 bis P2’des Substrats . Fünf der elf menschlichen Mitglieder der Familie (Cathepsine F, K, L, S und V) sind ausschließlich Endopeptidasen, Cathepsin B ist auch eine Peptidyldipeptidase, Cathepsin X ist eine Carboxypeptidase, Cathepsin H ist eine Aminopeptidase und Cathepsin C ist eine Dipeptidylpeptidase. Die proteolytische Aktivität der verbleibenden zwei Mitglieder, Cathepsine O und W, muss noch bestimmt werden . Die meisten Cystein-Cathepsine werden im menschlichen Körper ubiquitär exprimiert, während einige (Cathepsine K, S, V und W) in eingeschränkteren Mustern exprimiert werden . Cathepsin K wird reichlich in Osteoklasten und Synovialfibroblasten exprimiert, kommt aber auch in anderen Zellen der hämatopoetischen, epithelialen und Fibroblastenlinien vor . Die höchsten Expressionsniveaus von Cathepsin S werden in Antigen-präsentierenden Zellen gefunden , Cathepsin V wird überwiegend in Thymus und Hoden exprimiert , und die Expression von Cathepsin W ist auf CD8 + -Lymphozyten und natürliche Killerzellen beschränkt .
2. Regulation der Cystein-Cathepsin-Aktivität
Die Zymogenaktivierung ist eines der wichtigsten Mittel zur Regulation der Cathepsinaktivität. Alle Cathepsine werden nämlich als inaktive Zymogene synthetisiert und im sauren Milieu der endolysosomalen Vesikel aktiviert. Der molekulare Mechanismus ihrer Aktivierung war lange Zeit rätselhaft. Die kritische Information kam aus der Kombination von Strukturstudien von Procathepsinen B, K und L, die zeigten, dass das Propeptid durch das aktive Zentrum von Cathepsinen in die entgegengesetzte Richtung des Substrats läuft, wodurch die Spaltung des Propeptids im Molekül ohne enorme und energetisch ungünstige Strukturbewegungen des Propeptids ausgeschlossen wird , wodurch der ursprünglich vorgeschlagene unimolekulare Mechanismus eliminiert wird, und detaillierte kinetische Studien, die eindeutig zeigten, dass die Aktivierung von Cathepsin B ein bimolekularer Prozess ist . Das aktuelle Modell, das größtenteils auf den Cathepsin-B-Studien basiert, legt nahe, dass das Propeptid im Cathepsin-Zymogen zwischen zwei Konformationen wechselt, den sogenannten „geschlossenen“ und „offenen“.“ In der „geschlossenen“ Konformation, bevorzugt bei neutralem bis schwach saurem pH-Wert, blockiert das Propeptid das aktive Zentrum und verhindert die Substrathydrolyse, während in der „offenen“ Form, bevorzugt bei saurem pH-Wert unter pH 5,0, das Propeptid aus dem aktiven Seitenspalt entfernt wird, was zu einer geringen katalytischen Aktivität des Zymogens führt. Diese Aktivität reicht aus, um ein weiteres Cathepsin-Zymogen in einem oder mehreren Schritten zu aktivieren, wodurch die Kettenreaktion gestartet wird, bei der ein solches voll aktives reifes Cathepsin B die Mehrheit der Zymogenmoleküle verarbeitet .
Die anderen Hauptregulatoren von Cystein-Cathepsinen sind makromolekulare Inhibitoren, die an das aktive Zentrum binden und dadurch die Assoziation der Peptidase mit ihrem Substrat verhindern. Sie gehören zu mehreren verschiedenen Familien, einschließlich der Cystatine, der Thyropine und der Serpine, die neben Serinproteasen auch mehrere Cathepsine hemmen können .
3. Glykosaminoglykane als Hauptregulatoren der Cystein-Cathepsin-Aktivität
Glykosaminoglykane (GAGs) sind Heteropolysaccharide, die aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten mit einer hohen negativen Ladung bestehen. Dies ist ein Ergebnis der Anwesenheit mehrerer Carboxylgruppen und Sulfatsubstitutionen. Die meisten GAGs sind sulfatiert, einschließlich Chondroitinsulfate (CS), Keratansulfat (KS), Dermatansulfat (DS), Heparansulfat (HS) und Heparin, während Hyaluronan (HA) der einzige nicht sulfatierte GAG ist. In den letzten Jahren haben sich GAGs als wichtige Regulatoren von Cystein-Cathepsinen mit vielfältigen Auswirkungen auf ihre Ziele herauskristallisiert. Traditionell wurden Cysteinkathepsine als lysosomale Proteasen angesehen und es war bekannt, dass sie wie andere lysosomale Enzyme durch intralysosomale GAGs im ruhenden Lysosom gehemmt werden . Heute sind Cystein-Cathepsine jedoch als Hauptakteure bei der extrazellulären Proteolyse etabliert . Ihre Wirkung in der Glykosaminoglycan-reichen extrazellulären Umgebung warf Fragen zum Zusammenspiel zwischen Cystein-Cathepsinen und GAGs außerhalb des Lysosoms auf. Die zwei Gruppen von endogenen menschlichen Cystein-Cathepsinen, die am häufigsten mit extrazellulärer Proteolyse assoziiert sind, sind Cathepsin-L-ähnliche Proteasen (Cathepsine K, L, S und V beim Menschen) und Cathepsin B. Die in den letzten zwei Jahrzehnten gesammelten Daten zeigen, dass das Zusammenspiel zwischen diesen Peptidasen und GAGs in beide Richtungen verläuft; Cysteinkathepsine sind in der Lage, Proteoglycan-Kernproteine zu spalten und dadurch GAGs aus ihrer Unterstützung freizusetzen, während GAGs wiederum sowohl die Aktivität als auch die Stabilität von Cysteinkathepsinen im extrazellulären Raum beeinflussen.
Die Regulation von Papain-ähnlichen Cysteinpeptidasen durch GAGs wurde erstmals für Cathepsin L beschrieben. In diesen frühen Arbeiten wurde festgestellt, dass GAGs und verschiedene negativ geladene Oberflächen die Aktivierung des Cathepsin-L-Zymogens in die reife Form erheblich beschleunigen, auch bei pH-Werten nahe dem Neutralen, wie sie auch im extrazellulären Milieu bei verschiedenen Krankheitszuständen vorkommen. Dies wurde für mehrere andere Cathepsine bestätigt, die wichtigsten sind Cathepsine B und S , und sogar für a T. congolense Parasit Homolog Congopain , was darauf hindeutet, dass GAGs und andere negativ geladene Oberflächen eine wichtige Rolle bei der extrazellulären Cathepsinaktivierung bei Krankheiten spielen können. Jüngste Befunde mit Cathepsin S in hoher GAG-Konzentration legen jedoch nahe, dass sich dieses Enzym unter solchen Bedingungen etwas anders verhalten kann, wobei Chondroitin-4-sulfat (C4S) sogar eine verzögernde Wirkung zeigt . Nichtsdestotrotz wurde die Erleichterung der autokatalytischen Aktivierung von Cathepsinen durch das negativ geladene Polysaccharid Dextransulfat auch zu einer Routinemethode bei der Herstellung von rekombinanten Cathepsinen .
Der Großteil der Informationen über den molekularen Mechanismus der GAG-assistierten Cathepsinaktivierung stammt aus einer Studie von Cagliani et al. verwendung von menschlichem Cathepsin B als Modell . Wie gezeigt, scheinen GAGs auf zwei Arten zur Verarbeitung beizutragen. Erstens scheinen sie bei der Bindung das Cathepsinzymogen in ein besseres Substrat umzuwandeln. Zweitens begünstigt die Bindung von GAGs offenbar die offene Konformation des Zymogens, wodurch die Aktivierung nicht nur bei saurem pH-Wert, sondern auch bei pH-Werten, die näher an neutral liegen, gefördert wird. Dies scheint bei den meisten GAGs der Fall zu sein und hängt nicht entscheidend von der Ladungsdichte der GAGs ab, da auch HA die Aktivierung beschleunigen konnte, wenn auch in geringerem Maße, was für eine Protein-GAG-Interaktion ungewöhnlich ist. Darüber hinaus war bereits ein Tetrasaccharid ausreichend für eine deutliche Beschleunigung der Cathepsin-B-Autoaktivierung, die wesentlich geringer ist als bei einer Reihe anderer GAG-vermittelter Reaktionen . Die Wechselwirkung wird durch ionische Wechselwirkungen vermittelt; es scheint jedoch keine konservierte GAG-bindende Oberfläche auf den Zymogenen zu geben, da völlig unabhängige Reste in den Procathepsinen L und B, die sich größtenteils auf den Prodomänen befanden, die Interaktion steuern .
Die andere wichtige Rolle von GAGs bei der Regulation der Cathepsinaktivität ergab sich aus den Studien zu Papain, dem archetypischen Vertreter der Familie . Diese Art der Regulierung erhielt schnell mehr Aufmerksamkeit mit der Entdeckung, dass Chondroitinsulfat aus Knorpel die kollagenolytische Aktivität von Cathepsin K prominent erhöhte. Diese spezielle Peptidase war einige Jahre zuvor als einzige Protease entdeckt worden, die für den Kollagenabbau beim Knochenumbau verantwortlich ist, und wurde sofort als potenzieller Wirkstoffkandidat für die Behandlung metabolischer Knochenerkrankungen wie Osteoporose erkannt . Die Wechselwirkung von Cathepsin K mit Chondroitinsulfat und anderen Glykosaminoglykanen wurde später sowohl aus struktureller als auch aus funktioneller Sicht eingehend untersucht, und Glykosaminoglykane wurden als die ersten bekannten allosterischen Regulatoren einer Cystein-Cathepsin-Peptidase erkannt , wie in den folgenden Abschnitten ausführlich beschrieben. Parallel dazu wurden funktionell relevante Wechselwirkungen mit Glykosaminoglykanen auch für andere Mitglieder der Cystein-Cathepsin-Familie dokumentiert. Zusammengenommen wurde festgestellt, dass Glykosaminoglykane sowohl die Aktivität als auch die Stabilität von Cystein-Cathepsinen beeinflussen. Kinetische Profile stimmen normalerweise mit hyperbolischen Mechanismen überein, was auf Wechselwirkungen mit Enzymen außerhalb des aktiven Zentrums hinweist, möglicherweise über allosterische Mechanismen. Die stabilisierende Wirkung ist insbesondere wegen der relativen Instabilität von Cysteinkathepsinen bei neutralem pH-Wert in der extrazellulären Matrix wichtig.
4. Regulation der Cathepsin-K-Aktivität und Stabilität
Von allen Papain-ähnlichen Peptidasen wurde Cathepsin K als das Cathepsin etabliert, das am engsten mit Glykosaminoglykanen verbunden ist. Es wurde ursprünglich als Protease identifiziert, die vorwiegend in Osteoklasten exprimiert wird, und es wurde gezeigt, dass seine gestörte Aktivität zu schweren Knochenerkrankungen führt . Cathepsin K ist eine Kollagenase mit einzigartiger Aktivität unter Säugetierpeptidasen , die spezifisch durch Glykosaminoglykane über allosterische Mechanismen moduliert wird . Aufgrund seiner zentralen Rolle beim Knochenumsatz gilt Cathepsin K derzeit als eines der vielversprechendsten Targets zur Behandlung von Osteoporose . Neben dem Knochenumbau ist Cathepsin K an verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt (für eine aktuelle Übersicht siehe ). Es kann eine Reihe von extrazellulären Substraten, einschließlich Proteoglykanen, spalten, um aktive Glykosaminoglykane freizusetzen , die wiederum seine Aktivität modulieren. Im Knorpel baut Cathepsin K sowohl Typ-I- als auch Typ-II-Kollagene ab und trägt so zur Entstehung verschiedener entzündlicher Gelenkerkrankungen bei . Darüber hinaus wurde Cathepsin K mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Fettleibigkeit, Schizophrenie und Krebs in Verbindung gebracht .
Die Wechselwirkung von Cathepsin K mit verschiedenen Glykosaminoglykanen wurde eingehend untersucht. Obwohl mehrere Aspekte dieser Wechselwirkungen schwer fassbar bleiben, deuten die gesammelten Daten darauf hin, dass die Wechselwirkungen heterogen und vielfältig sind und wahrscheinlich mehrere Bindungsstellen am Enzym beinhalten. Chondroitin-4-sulfat (C4S) wurde ursprünglich als das GAG mit der dramatischsten Wirkung auf Cathepsin K identifiziert, während die Wirkungen von Chondroitin-6-sulfat (C6S), Dermatansulfat (DS) und Hyaluronan (HA) schwächer waren. Alle getesteten GAGs erhöhten die Stabilität von Cathepsin K über einen breiten pH-Bereich. C4S hatte den stärksten Effekt auf den Abbau von Kollagenen der Typen I und II durch Cathepsin K , während seine Wirkung auf die Hydrolyse eines synthetischen Substrats praktisch identisch mit der von C6S und DS war und zu einer zweifachen Erhöhung der Werte der Spezifitätskonstante führte . In einer späteren Studie wurde festgestellt, dass Keratansulfat (KS) und C6S eine stimulierende Wirkung auf Cathepsin K haben, ähnlich der von C4S, während Heparin und HS eine begrenzte Wirkung auf die kollagenolytische Aktivität von Cathepsin K hatten . Frühe Experimente haben auch vorgeschlagen, dass die Komplexbildung mit CS für die kollagenolytische Aktivität von Cathepsin K notwendig ist ; Neuere Erkenntnisse haben jedoch gezeigt, dass Kollagen vom Typ I auch in Abwesenheit von Glykosaminoglykanen effizient abgebaut werden kann . Nichtsdestotrotz wurde gezeigt, dass knochenresidente GAGs die kollagenolytische Aktivität von Cathepsin K potenzieren und endogene GAG-Konzentrationen im Knochen waren ausreichend für eine maximale Wirkung auf die Cathepsin-K-Aktivität .
Der kinetische Mechanismus der Wirkung von CS, DS und Heparin (HP) auf Cathepsin K wurde auch bei einem physiologischen Plasma-pH-Wert von 7,4 eingehend untersucht. Unter diesen Bedingungen wurden CS und DS als nicht-essentielle Aktivatoren mit vorherrschender Wirkung auf die Affinität zum Substrat charakterisiert . DS war effektiver als CS, was auf seine größere Flexibilität aufgrund weniger intramolekularer Wasserstoffbrücken zurückzuführen war . Intrinsische Fluoreszenz zeigte, dass die Bindung von GAGs die Konformation von Cathepsin K beeinflusst. Im Gegensatz zu Experimenten, die bei pH 5,5 durchgeführt wurden, wirkten CS und DS als Inhibitoren des Kollagenabbaus bei physiologischem Plasma-pH. Im Gegensatz dazu war der kinetische Mechanismus von Heparin zweiphasig, was auf eine Wechselwirkung mit zwei verschiedenen Stellen des Enzyms hinweist. Insgesamt war Heparin ein starker Aktivator von Cathepsin K bei physiologischem Plasma-pH und erhöhte sowohl seine kollagenolytischen als auch seine elastinolytischen Aktivitäten. Darüber hinaus hatte Heparin unter diesen Bedingungen eine starke stabilisierende Wirkung auf Cathepsin K, was zu einer mehr als 5-fachen Verlängerung der Halbwertszeit des Enzyms führte .
5. Strukturelle Grundlage für die Wechselwirkung zwischen Cathepsin K und GAGs
Die Kristallstruktur von Cathepsin K und C4S ergab die strukturelle Grundlage für die Wechselwirkung . Die Bindungsstelle befindet sich auf der Rückseite von Cathepsin K und interagiert mit drei Disaccharideinheiten von CS in der Kristallstruktur (Abbildung 2(a)). Wie üblich wird die Glykosaminoglycan/Protein-Wechselwirkung meist durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der negativ geladenen GAG-Kette und positiv geladenen Resten auf dem Enzym vermittelt. Die Bindung von Chondroitinsulfat verursacht keine signifikanten Konformationsänderungen in Cathepsin K im Vergleich zum CS-freien Cathepsin K. Umgekehrt wird die CS-Kette bei der Bindung an Cathepsin K gebogen (Abbildung 2 (b)). Der Großteil der Konformationsänderung kann auf die Wechselwirkung mit einer kurzen helikalen Region Arg8-Lys9-Lys10 zurückgeführt werden, die mit vier negativ geladenen Gruppen auf CS interagiert (Abbildung 2 (c)). Weitere enge Kontakte sind Asp6, Ile171, Gln172, Asn190, Lys191 und Leu195 sowie einige zusätzliche wasservermittelte Kontakte .
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Das kinetische Verhalten von DS war analog zu dem von CS: Es wurde daher vorgeschlagen, dass es mit Cathepsin K in der gleichen Weise wie CS interagiert. Heparin hingegen wurde vorgeschlagen, entsprechend seinem kinetischen Profil an zwei Stellen an Cathepsin K zu binden. Während die erste Bindungsstelle als identisch mit der für CS / DS vorgeschlagen wurde, wurde die zweite Bindungsstelle am Boden des Moleküls durch chemische Vernetzungsexperimente und Computermodellierung vorhergesagt . Aus struktureller Sicht ist die vorhergesagte Bindungsstelle eine Fortsetzung der CD / DS-Bindungsstelle und besteht aus mehreren basischen Resten (Lys10, Lys40, Lys41, Arg108, Arg111, Arg127 und Lys214), die in einer ringförmigen Struktur organisiert sind (Abbildung 2 (d)). Kinetische Experimente haben bestätigt, dass Heparin gleichzeitig an beide Stellen gebunden werden kann . Es bleibt jedoch zu bestimmen, ob dies eine HP-Kette erfordert, die gleichzeitig mit beiden Stellen interagiert, oder zwei separate HP-Ketten. Dies ist auch für die Interaktion anderer GAGs mit der zweiten HP-Bindungsstelle nicht klar.
6. Wechselwirkungen von GAGs mit Cathepsinen S und B
Neben Cathepsin K wurde gezeigt, dass zwei andere humane Papain-ähnliche Peptidasen, Cathepsine S und B, durch Glykosaminoglykane in ihren reifen Formen reguliert werden . Cathepsin S, der nächste Verwandte von Cathepsin K, ist unter Cystein-Cathepsinen ungewöhnlich, da es bei neutralem pH-Wert stabil ist. Cathepsin S spielt eine wichtige physiologische Rolle in Antigen-präsentierenden Zellen als wichtigste Protease bei der Antigenverarbeitung und wurde kürzlich von C4S reguliert . Im Gegensatz zu dem bei Cathepsin K beobachteten Aktivierungseffekt wirkte C4S als Inhibitor des Kollagenabbaus vom Typ IV durch Cathepsin S. Eine Hemmung wurde auch bei HS beobachtet, während HP, DS, C6S und HA die proteolytische Aktivität von Cathepsin S unter Verwendung von Kollagen vom Typ IV als Substrat leicht erhöhten. C4S, C6S und HS hemmten auch die Hydrolyse von Z-Phe-Arg-AMC über einen partiellen, gemischten Mechanismus. Ähnlich wie bei Cathepsin K wurden bei der C4S-Bindung durch intrinsische Fluoreszenzspektroskopie subtile Konformationsänderungen in Cathepsin S beobachtet. Drei Bindungsstellen für C4S wurden auf Cathepsin S durch molekulares Andocken vorhergesagt (Abbildung 3 (a)). Eine der vorgeschlagenen Stellen ist die aktive Stelle, welche, jedoch, stimmt nicht mit dem beobachteten gemischten Hemmungsprofil von C4S überein; die zweite befindet sich auf der unteren rechten Seite des Moleküls und entspricht der kürzlich identifizierten allosterischen Stelle in Cathepsin K , während sich die dritte am Boden des Moleküls befindet und ungefähr der in Cathepsin K identifizierten sekundären Heparin-Bindungsstelle entspricht .
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Cathepsin B ist einzigartig unter den Cystein-Cathepsinen, da es sowohl eine Endopeptidase als auch eine Peptidyldipeptidase ist, abhängig von der Konformation der Okklusionsschleife, einer Cathepsin B-spezifischen Struktur, die einen pH-spezifischen Schalter zwischen beiden Aktivitäten bereitstellt . Im Lysosom beschränkt der niedrige pH-Wert die Protease auf eine geschlossene Exopeptidase-Konformation, während der nahezu neutrale pH-Wert der extrazellulären Umgebung die Endopeptidaseaktivität von Cathepsin B fördert. Extrazelluläres Cathepsin B ist am häufigsten mit Krebs und verschiedenen Arten von Arthritis assoziiert . Die Protease lokalisierte sich in mehreren Studien an der Zelloberfläche und war sowohl unter physiologischen als auch unter pathologischen Bedingungen an der Zellmigration beteiligt . Auf molekularer Ebene wurde gezeigt, dass es eine Reihe von extrazellulären Substraten spaltet, einschließlich Laminin, Kollagen Typ IV und Fibronektin . Kürzlich wurde auch vorgeschlagen, dass Cathepsin B eine β-Sekretase ist, die Amyloid-β-Peptide in sekretorischen Vesikeln neuronaler Chromaffinzellen produziert . Es wurde jedoch auch gezeigt, dass es Amyloidablagerungen in einem Tiermodell abbaut, und es wurde vorgeschlagen, dass das Gesamtergebnis durch das Gleichgewicht zwischen Cathepsin B und seinem endogenen Inhibitor Cystatin C bestimmt wird.Es wurde gezeigt, dass die Bindung von HP oder HS die Stabilität des ansonsten instabilen Enzyms bei alkalischem pH-Wert (8,0) erhöht, während die Aktivität des Enzyms entlang des gesamten pH-Profils des Enzyms geringfügig verringert wird . Computersimulationen haben vorhergesagt, dass Heparin die Konformation des Moleküls unter diesen Bedingungen stabilisiert und zwei mutmaßliche GAG-Bindungsstellen vorhergesagt hat (Abbildung 3 (b)), eine auf jeder Seite des Enzyms . Die mutmaßliche Bindungsstelle in der L-Domäne besteht aus fünf basischen Resten (Arg85, Lys86, Lys130, Lys141 und Lys144), während die in der R-Domäne nur zwei enthält (Lys158 und Arg235). Die Autoren haben vorgeschlagen, dass die Bindungsstelle in der R-Domäne eine höhere Affinität für kürzere GAG-Fragmente aufweist, wie das Heparin-Disaccharid, das in ihren Andocksimulationen verwendet wird, während die in der L-Domäne wahrscheinlich relevanter für die Bindung längerer GAG-Fragmente ist .
7. Wechselwirkungen von GAGs mit anderen Papain-ähnlichen Peptidasen
Interessanterweise wurde auch gezeigt, dass Papain mit GAGs interagiert. Obwohl diese Wechselwirkungen keine physiologische Relevanz haben, weisen sie auf evolutionär konservierte Regulationsmechanismen innerhalb der Familie hin. HP hemmte Papain durch einen hyperbolischen Mischmechanismus und beeinflusste seine Konformation . In Papain wurde eine klassische Heparin-bindende Konsensussequenz in Form der Sequenz 187-Ile-Arg-Ile-Lys-Arg-Gly-192 identifiziert. Strukturell befindet sich diese Sequenz auf der rechten Seite des Moleküls (Abbildung 3(c)) in einer Region, die zwischen beiden in Cathepsin K bekannten allosterischen Stellen liegt.
Darüber hinaus wurden einige Beispiele für Proteasen aus Protozoenparasiten beschrieben, die mit GAGs interagieren, was auf die Möglichkeit ihres Einflusses auf Wirt-Parasit-Wechselwirkungen hindeutet. Es wurde festgestellt, dass das Cathepsin L-Homolog Brucipain, ein entscheidender Virulenzfaktor des Protozoenparasiten Trypanosoma brucei, durch HS allosterisch moduliert wird. Die Wirkung von HS in dieser Studie war subtil und hatte die Fähigkeit, die Substrathemmung durch ein kleines Dipeptidsubstrat (Z-Phe-Arg-AMC) umzukehren . Eine stärkere Wirkung von HS wurde für Cruzipain aus dem verwandten Parasiten Trypanosoma cruzi beobachtet. In diesem Fall war HS ein Aktivator der Peptidase, der eine signifikante (bis zu 6-fache) Erhöhung der Aktivität der Peptidase verursachte, gemessen mit einem synthetischen Substrat. Darüber hinaus erhöhte HS die Freisetzung von Kinin aus hochmolekularem Kininogen durch Cruzipain in vitro sowie durch lebende Trypomastigoten und verringerte die inhibitorischen Eigenschaften von Kininogen gegenüber Cruzipain . In ähnlicher Weise wurde kürzlich gezeigt, dass HP die Aktivität der Cathepsin-L-ähnlichen Peptidase rCPB2.8 aus Leishmania mexicana moduliert . In diesem Fall hemmten HP und HS, aber nicht CS oder DS, die Hydrolyse von Z-Phe-Arg-AMC durch einen hyperbolischen Mischmechanismus und beeinflussten die Konformation des Proteins . Insgesamt zeigen diese Beispiele, dass Interaktionen mit GAGs nicht auf endogene Cystein-Cathepsine beschränkt sind, sondern auch vielfältige Rollen in Wirt-Pathogen-Interaktionen spielen können und entweder als Teil der körpereigenen Abwehr gegen eindringende Pathogene oder als Faktoren wirken können, die zu den invasiven Mechanismen des Pathogens beitragen.
8. Pharmakologisches Targeting
Cathepsin K stellt derzeit das attraktivste Wirkstoffziel unter den Cathepsinen dar, obwohl Cathepsin S auch ein relevantes Ziel bei Krankheiten ist, die mit einer erhöhten Immunantwort verbunden sind, wie Bronchialasthma und Psoriasis . Derzeit werden mehrere Cathepsin-K-Inhibitoren entwickelt, die auf das aktive Zentrum des Enzyms abzielen (gesammelt in ). Der derzeit vielversprechendste Inhibitor ist Odanacatib (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), einem Nitrilsprengkopf-haltigen Inhibitor, hochselektiv für Cathepsin K. Die klinischen Phase-III-Studien mit Odanacatib wurden erfolgreich abgeschlossen und die Anträge auf Zulassung werden voraussichtlich in Kürze gestellt. Im Falle einer Zulassung wird sich das Medikament auf dem Markt gegen andere Medikamente der neuen Generation positionieren, wie den Anti-RANK-Ligand-Antikörper Denosumab (Amgen, Inc., Thousand Oaks, CA, USA) und das Teriparatid, eine rekombinante Form des Parathormons (Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN, USA), sowie die etablierten Bisphosphonate. Die Ausrichtung auf die Cathepsin-K / Chondroitinsulfat-Wechselwirkung würde eine Alternative zu diesen Behandlungen darstellen. Endogenes Chondroitinsulfat reicht aus, um eine maximale Aktivierungswirkung auf Cathepsin K zu zeigen, und seine Verdauung reduziert die Aktivität von Cathepsin K um 40% . Eine Verringerung des Knochenumsatzes in dieser Größenordnung würde wahrscheinlich für die Behandlung von Patienten mit weniger schwerer Knochendichtereduktion ausreichen. Ein zusätzlicher Vorteil wäre, dass die Cathepsin-K-Aktivität an sich sowie die Lebensfähigkeit und Zellzahl von Osteoklasten und Osteoblasten ungestört bleiben würden.
Interessenkonflikt
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt bezüglich der Veröffentlichung dieses Artikels besteht.
Anerkennung
Die Arbeit wurde durch Zuschüsse der slowenischen Forschungsagentur (P1-0140 und J1-3602) an Boris Turk unterstützt.
