II Effect of Hyperthermia Alone in Vitro
1967 verwendete Harris einen Einzelzell-Klon-Assay, um Wärmeüberlebenskurven von pseudodiploiden Schweinenierenzellen zu erhalten. Die Kurven bestanden aus einer anfänglichen Schulter, gefolgt von einem exponentiellen Rückgang der überlebenden Fraktion, und ähnelten daher Kurven, die durch Strahlentötung von Zellen in Kultur erhalten wurden (Puck und Marcus, 1955). Westra und Dewey (1971) und Palzer und Heidelberger (1973a) haben dieses Phänomen ebenfalls gezeigt. Dies impliziert jedoch keine Ähnlichkeit des letalen Mechanismus der beiden Modalitäten.Ein Arrhenius-Diagramm des Kehrwerts der Inaktivierungsrate, ausgedrückt als Funktion des Kehrwerts der absoluten Temperatur für beide Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) und Schweinenierenzellen ergab eine Aktivierungsenergie von 141 kcal / Mol für beide Typen über den Temperaturbereich von 43,5 ° bis 46,5 ° C (Westra und Dewey, 1971). Die Größe der Aktivierungsenergie ist ähnlich der für mehrere Enzyme und Proteine berichteten (Johnson et al., 1954) und ist signifikant größer als die für DNA gemeldete Aktivierungsenergie (Eigner et al., 1961; Greer und Zambehof, 1962), was darauf hindeutet, dass Proteindenaturierung die tödliche Hitzeläsion sein kann. Die Aktivierungsentropie für die beiden Zelllinien war jedoch unterschiedlich.
Das derzeitige Wissen und Verständnis der Ziele und Mechanismen der Hitzetötung ist begrenzt. Während eine Reihe von hitzeinduzierten Veränderungen der Zellstruktur und des Stoffwechsels beschrieben wurden, wurde keine davon ausschließlich mit dem Zelltod in Verbindung gebracht. Es wurden keine Mittel gefunden, um selektiv subzelluläre Organellen zu erhitzen, um Einblick in das kritische Ziel oder die kritischen Ziele von Wärme zu erhalten. Dennoch wurden mehrere Möglichkeiten vorgeschlagen.
Eine Reihe von Forschern fanden heraus, dass Hitzeschock die Fähigkeit von Zellen verringert, Thymidin in DNA einzubauen (Mondovi et al., 1970; Reeves, 1971; Plagemann und Erbe, 1972). Diese Hemmung des Thymidineinbaus könnte auf eine Schädigung des Thymidintransportmechanismus zurückzuführen sein, von dem angenommen wird, dass er den DNA-Einbau steuert (Plagemann und Erbe, 1972). Es hat sich jedoch gezeigt, dass der markierte Vorläuferpool nicht ausreichend abnahm, um die starke Abnahme des Thymidineinbaus in Schweinenierenzellen zu erklären (Plagemann und Erbe, 1972).
Dewey et al. (1971) fanden heraus, dass Wärme Chromosomenaberrationen in synchronen CHO-Zellen induzierte. Die Aberrationsfrequenz war zu niedrig, um die Zelltötung in M- und G1-Zellen zu erklären (weniger als eine Aberration pro Zelle, wenn das Überleben auf 37% reduziert wurde), könnte aber die Zelltötung von S-Phasen-Zellen erklären. Darüber hinaus töteten Hitze und das Thymidinanalogon Bromodeoxyuridin (BUdR), wenn sie zusammen wirken, Zellen additiv, was darauf hindeutet, dass die gleichen Strukturen durch beide Mittel beschädigt wurden. Es wurde dann angenommen, dass Hitze und BUdR beide Läsionen erzeugen, die als Schäden in der DNA exprimiert werden, aber dass Hitze Schäden im chromosomalen Protein, möglicherweise Reparaturenzyme, und dass BUdR Schäden in der DNA erzeugt. Dann könnte die Schädigung des chromosomalen Proteins entweder mit der BUdR-Schädigung in der DNA interagieren oder zu einer Hemmung der Reparatur von DNA-Schäden führen. Diese Hypothese wird durch die Ähnlichkeit zwischen den Aktivierungsenergien für die Hitzetötung (141 kcal / mol) und der Inaktivierung von Proteinen gestützt (Westra und Dewey, 1971). Der proteinvermittelte DNA-Schaden, der während G1 auftrat, manifestierte sich offenbar nicht als Chromosomenaberrationen, möglicherweise aufgrund der stabilisierteren Assoziation zwischen diesen Komponenten des Chromatins während G1. Es wurde angenommen, dass der Mechanismus der mitotischen Zelltötung die Zerstörung der Spindel ist, die die in diesen Experimenten beobachtete hohe Frequenz tetraploider Zellen verursachte.
Die Wärmeempfindlichkeit variiert erheblich zwischen den Zelllinien. Maus-Prostatazellen wurden bis zu 5 Stunden bei 43 ° C nicht abgetötet, während das Überleben von kohlenwasserstofftransformierten Prostatazellen nach 2 1/2 Stunden Wärmebehandlung 0,37 betrug (Chen und Heidelberger, 1969). Es wurde gezeigt, dass die Anzahl der Wärmeminuten, die erforderlich sind, um das Überleben von L1210-Leukämiezellen und HeLa-Zellen auf dem exponentiellen Teil der Überlebenskurve (D0) auf 37% zu reduzieren, 12 min bzw. 30 min bei 43 ° C beträgt (Palzer und Heidelberger, 1973a). Auch die Hitzeinaktivierungsrate von CHO-Zellen (Westra und Dewey, 1971) war zehnmal größer als die Inaktivierungsrate von Schweinenierenzellen (Harris, 1967).Der Betrag der Teilungsverzögerung nach dem Erhitzen (Westra und Dewey, 1971; Palzer und Heidelberger, 1973b) ist viel länger als die Verzögerung, die durch eine Strahlendosis erzeugt wird, die das Überleben um einen ähnlichen Betrag reduziert (Westra und Dewey, 1971). Dies deutet darauf hin, dass entweder die Läsionen, die für die Teilungsverzögerung verantwortlich sind, oder die Läsionen, die für die Letalität verantwortlich sind, für die beiden Modalitäten unterschiedlich sind.
Durch die Bestimmung der Überlebensreduktion, die durch eine konstante Wärmedosis an synchronisierten Zellen verursacht wird, wurde dies für CHO-Zellen gezeigt (Dewey et al., 1971; Westra und Dewey, 1971), Hefe (Schenberg-Frascino und Moustracchi, 1972), HeLa-Zellen (Palzer und Heidelberger, 1973b) und meristematische Zellen (de la Torre et al., 1971), dass S-Phasen-Zellen (de la Torre et al., 1971; Dewey et al., 1971; Westra und Dewey, 1971; Schenberg-Frascino und Moustacchi, 1972; Palzer und Heidelberger, 1973b) und M-Phasen-Zellen (Westra und Dewey, 1971) waren im Vergleich zu Zellen in anderen Phasen des Zellzyklus am empfindlichsten. Dieser Befund steht in direktem Gegensatz zu Bestrahlungsstudien, bei denen sowohl in vitro (Sinclair, 1968; Dewey et al., 1970) und in vivo (Gillette et al., 1970; Dawson et al., 1973) ist die S-Phase die strahlungsresistenteste Phase. Aufgrund der Zellzyklusspezifität der Hitzetotalität wurde die Induktion einer partiellen Synchronität nach wiederholten Wärmebehandlungen vorgeschlagen (de la Torre et al., 1971) und beobachtet (Martin und Scloerb, 1964).
Mehrere Forscher haben berichtet, dass neoplastische Zellen wärmeempfindlicher sind als normale Zellen (Mondovi et al., 1969; Levine und Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle und Dickson, 1971). Dies kann auf Ernährungsmängel oder andere Faktoren zurückzuführen sein, die das bösartige Gewebe wärmeempfindlicher machen können. Es gibt jedoch Ausnahmen (Chen und Heidelberger, 1969; Kachani und Sabin, 1969), und in den meisten Fällen wurde eine veränderte Morphologie oder ein veränderter Metabolismus mit einer Zelltötung gleichgesetzt. Daher deuten die Daten auf eine selektive Wärmeempfindlichkeit von Krebszellen hin (Mondovi et al., 1969, 1970; Levine und Robbins, 1970; Turano et al., 1970; Muckle und Dickson, 1971; Overgaard und Overgaard, 1972a; Kim et al., 1974) wurde nicht nachgewiesen, dass Tumorzellen für das Kriterium des Fortpflanzungstodes wärmeempfindlicher sind als die normalen Zellen, aus denen der Tumor hervorgegangen ist.
Der fraktionierte Wärmeeintrag wurde nur kurz untersucht. Palzer und Heidelberger (1973a) untersuchten die Rückgewinnung asynchroner HeLa-Zellen zwischen geteilten Wärmedosen. Ihre Daten zeigen, dass Zellen in der Lage waren, subletale Hitzeschäden in 6 Stunden zu reparieren. Auch die Fluktuation in der überlebenden Fraktion deutete auf eine teilweise Synchronisation der asynchronen Population als Ergebnis der ersten Dosis hin. Es gab eine Abnahme des Überlebens nach einem anfänglichen Anstieg aufgrund der Reparatur von subletalen Hitzeschäden. Das verringerte Überleben wurde als Ergebnis der Umverteilung von Zellen in eine empfindlichere Phase des Zellzyklus aufgrund einer partiellen Synchronisation interpretiert, die durch die erste Dosis des letalen Mittels induziert wurde.
Gerweck et al. (1974) untersuchten die Fähigkeit von Wärme, hypoxische Zellen in vitro abzutöten. Hypoxie wurde in CHO-Zellen durch eine schnelle Begasungstechnik erzeugt. Strahlenüberlebenskurven für aerobe und hypoxische CHO-Zellen zeigten ein Sauerstoffverstärkungsverhältnis (OER) von 2,5, was darauf hinweist, dass eine radiobiologische Hypoxie erreicht wurde. Das Erhitzen erfolgte durch Eintauchen in 45,5 ° C Wasser für variable Zeitintervalle. Anschließend wurden Wärmeüberlebenskurven von aeroben und hypoxischen Zellen konstruiert, die zeigten, dass hypoxische Zellen mindestens genauso wärmeempfindlich und möglicherweise etwas wärmeempfindlicher waren als aerobe Zellen. Die D0 für hypoxische Zellen betrug 1,2 min und für aerobe Zellen 1,8 min.Schulman und Hall (1974) fanden heraus, dass hypoxische V79-Zellen des chinesischen Hamsters wärmeempfindlicher waren als aerobe V79-Zellen. Dreiundvierzig Grad Celsius waren notwendig, um in aeroben Zellen Schäden zu verursachen, während 41 ° C in hypoxischen Zellen Schäden verursachten.
Zusammenfassend hat die Hitzetötung von Säugetierzellen in Kultur die folgenden Eigenschaften: bei einer gegebenen Temperatur ist ein Diagramm des Logarithmus der überlebenden Fraktion als Funktion der Behandlungszeit typischerweise exponentiell, dem eine anfängliche Schulter vorausgeht, was darauf hinweist, dass Zellen die Fähigkeit haben, subletale Hitzeschäden anzusammeln, und dann exponentiell mit zunehmender Behandlungszeit getötet werden. Split-Dose-Studien zeigen, dass Zellen auch die Fähigkeit haben, diesen subletalen Hitzeschaden zu reparieren. Es gibt erhebliche Unterschiede in der Wärmeempfindlichkeit zwischen verschiedenen Zelllinien. Eine Zellaltersempfindlichkeit besteht, wobei S-Phase- und M-Phase-Zellen am wärmeempfindlichsten sind. Das durch Hitze geschädigte Ziel ist unbekannt, aber eine Protein—DNA-Interaktion ist zumindest eine plausible Möglichkeit. Hypoxische Zellen scheinen wärmeempfindlicher zu sein als sauerstoffhaltige Zellen.
