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Die Behandlung von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) wurde durch zunehmende Antibiotikaresistenzraten erschwert. MRSA-Stämme exprimieren das von mecA codierte Penicillin-Bindungsprotein 2a (PBP2a), das eine Resistenz gegen β-Lactame bietet, indem es das reaktive Serin in einem engen, unzugänglichen Spalt schützt, wodurch die Zellwandsynthese in Gegenwart von Antibiotika fortgesetzt werden kann (1, 2). Ceftobiprol und Ceftarolin sind Anti-MRSA-Cephalosporine, die PBP2A in therapeutisch nützlichen Konzentrationen hemmen. Die R2-Gruppe von Ceftobiprol erstreckt sich in den engen Spalt von PBP2a, um auf das aktive Zentrum zuzugreifen, während die Ceftarolinbindung eine allosterische Veränderung von PBP2A verursacht und das aktive Zentrum für die Bindung durch ein zweites Molekül freilegt (3, 4). Ceftobiprol wurde in klinischen Studien untersucht, und Ceftarolin ist von der FDA für die Behandlung von Haut- und Hautstrukturinfektionen zugelassen, einschließlich solcher, die durch MRSA verursacht werden (5-10).Frühere Studien aus unserer Gruppe haben gezeigt, dass die Passage des COL-Stammes in Ceftobiprol resistente Mutanten mit Mutationen in PBP2A selektiert (11). Diese Studie untersucht, ob die Ceftarolinpassage auch für ähnliche Mutationen verantwortlich ist. Die Experimente wurden mit zwei verschiedenen MRSA-Hintergründen durchgeführt: COL, ein archaisches homogen resistentes Isolat aus dem Jahr 1961, und SF8300, ein heterogen resistenter zeitgenössischer USA300-MRSA-Stamm. COLnex und SF8300ex, mecA-negative Derivatstämme von COLn und SF8300, wurden durch (12) Exzision des chromosomalen Staphylokokken-Kassettenchromosoms mec (SCCmec) erhalten (13). Wildtyp-mecA wurde auf Plasmid pYK20 (abgeleitet von Plasmid pAW8 und enthaltend Wildtyp-mecA, kloniert von COL) in COLnex und SF8300ex für Passage-Studien wieder eingeführt. Wenn mecA eine Resistenz vermittelte, sollte entweder die Aushärtung einer resistenten Mutante des Plasmids oder die Einführung in einen anfälligen Hintergrund zu einem Verlust bzw. Gewinn des Phänotyps führen, was die Bestimmung des Beitrags von mecA zur Resistenz ermöglicht. Die in dieser Studie verwendeten Stämme und Plasmide sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. COLnex (pYK20) und SF8300ex (pYK20) wurden seriell in tryptischer Sojabrühe mit steigenden Konzentrationen von Ceftarolin (Forest Laboratories) wie zuvor beschrieben (11) passagiert.

Nach 28 Tagen ergaben COLnex(pYK20) und SF8300ex(pYK20), die in Ceftarolin passagiert wurden, zwei Mutanten, COLnexpT(pYK20COLT*) und SF8300expT(pYK208300T *) (ein Sternchen kennzeichnet ein Plasmid, das während der Ceftobiprol- oder Ceftarolinselektion in einem COL- oder SF8300-Hintergrund erzeugt wurde) (Tabelle 1). Die MHK gegen Ceftarolin, Ceftobiprol und andere β-Lactame (Sigma-Aldrich) wurden nach der Bouillon-Verdünnungsmethode gemäß CLSI-Standards bestimmt (Tabelle 3) (15). COLnexpT(pYK20COLT*) zeigte eine hohe Resistenz gegen Ceftarolin und Ceftobiprol mit MKS von 64 µg / ml bzw. 32 µg /ml. SF8300expT (pYK208300T *) exprimierte am Tag 4 der Passage eine geringe Resistenz mit einer MHK von 4 µg / ml, die trotz 24 weiterer Passagen unverändert blieb (Tabelle 3 und Abb. 1). Die zuvor beschriebene Ceftobiprol-passagierte Mutante von COLnex (pYK20) (11), COLnexpB (pYK20COLB *), zeigte eine hohe Resistenz sowohl gegen Ceftobiprol als auch gegen Ceftarolin mit einer MHK von jeweils 64 µg / ml.

Plasmid mecA wurde für Mutationen in passagierten Stämmen sequenziert. Da PBPs das Ziel von β-Lactamen sind, wurden auch pbp1, -2, -3 und -4 sequenziert. Schließlich wurden gdpP und acrB sequenziert, da Mutationen in diesen Genen in einer mecA-negativen Ceftobiprol-resistenten Mutante von COL identifiziert worden waren (16). Plasmid pYK208300T * (pYK20 aus SF8300ex in Ceftarolin passagiert), hatte eine Single-Point-Mutation (G zu A an kodierender Sequenzposition 1339) in mecA, was zu einer nicht-synonymen Aminosäureänderung, E447K, führte. In anderen PBP-Genen, acrB oder gdpP waren keine Mutationen vorhanden (Tabelle 4).

Plasmid pYK20COLT* (pYK20 von COLnex, das in Ceftarolin passagiert war) hatte keine Mutationen in mecA. Eine Punktmutation (C bis T an CDS-Position 1327), die die H443Y-Mutation in GdpP einführt, eine Punktmutation (G bis A an CDS-Position 466), die die D156N-Mutation in PBP2 einführt, und zwei Punktmutationen (A bis G an CDS-Position 601 und C bis G an CDS-Position 723), die T201A- und F241L-Mutationen in PBP4 einführen, wurden gefunden (Tabelle 4). Bemerkenswert ist, dass die Ceftarolin-Passage von COL, das mecA an seiner natürlichen chromosomalen Position enthielt, auch zu einer Mutante mit hoher Resistenz führte, jedoch ohne Mutationen in mecA (Daten nicht gezeigt). Die Sequenzanalyse dieser passagierten Mutante ergab eine Punktmutation in pbp2 (G zu A an CDS-Position 1891), was zu der Aminosäureänderung G631S führte, und eine in pbp4 (T zu A an CDS-Position 414), die eine N138K-Mutation einführte. Diese Daten zeigen, dass Ceftarolin auch in Gegenwart von mecA Mutationen in anderen Genen selektieren kann, was zu Resistenzen führt.

Die COLnexpB(pYK20COLB*) und SF8300expT(pYK208300T*) ihrer Plasmide, die jeweils mecA-Mutationen aufwiesen, erniedrigten die MICs für alle getesteten β-Lactame (Tabellen 5 und 6). Das COLnexpT(pYK20COLT*) seines Plasmids, dem mecA-Mutationen fehlten, hatte keine Wirkung auf MICs (Tabelle 5). Die Umwandlung von pYK20COLB *, das 6 Substitutionsmutationen in mecA enthält, in das anfällige COLnex-Elternteil, das den Transformanten COLnex (pYK20COLB *) ergab, führte zu einer hohen Ceftarolin- und Ceftobiprol-Resistenz. Die Umwandlung von pYK208300T *, das die einzelne Mutation E447K in mecA enthält, in COLnex, wobei die Transformante COLnex (pYK208300T *) erhalten wurde, führte zu einer hohen Resistenz gegen Ceftobiprol (MHK von 64 µg / ml), jedoch nur zu einer geringen Resistenz gegen Ceftarolin (MHK von 4 µg / ml) (Tabelle 5). Die Umwandlung von pYK20COLB* in SF8300ex, wobei der Transformant SF8300ex (pYK20COLB *) erhalten wurde, führte zu einer hochgradigen Resistenz gegen Ceftarolin und Ceftobiprol (MHK von jeweils 32 µg / ml) (Tabelle 6). Mehrere Versuche, SF8300ex mit pYK208300T * zu transformieren, waren erfolglos.

Eine einzelne Aminosäureänderung an E447 in mecA scheint eine Schlüsselrolle bei der Resistenz zu spielen. Es ist in Ceftobiprol-passagiertem COL (neben anderen Mutationen) vorhanden (11), es ist die einzige mecA-Mutation im Ceftarolin-passagierten SF8300 und es wurde in klinischen Isolaten berichtet (17, 18). Strukturell befindet sich E447 in der Penicillin-bindenden Domäne von PBP2a und interagiert mit der R2-Gruppe von Ceftobiprol und anderen β-Lactamen (3, 19). E447K führte zu einer hohen Ceftobiprol-Resistenz und einer niedrigen Ceftarolin-Resistenz im COLnex-Hintergrund, wahrscheinlich aufgrund struktureller Unterschiede zwischen den beiden Verbindungen. Multiple Mutationen in mecA führen zu einer hohen Resistenz gegen beide Antibiotika (20). Auch der genetische Hintergrund spielt eine Rolle. Heterogenes SF8300, das in Ceftarolin passagiert wurde, entwickelte eine geringe Resistenz gegen Ceftobiprol und Ceftarolin mit E447K (MHK 4 µg / ml). Diese Mutation wurde mit einer geringen Resistenz gegen Ceftarolin in klinischen Isolaten in Verbindung gebracht (17).Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Passage in Ceftarolin oder Ceftobiprol eine E447K-Mutation in PBP2a selektiert, eine Mutation, die in Ceftarolin-resistenten klinischen Isolaten gefunden wurde, was ihre Bedeutung bei der Vermittlung des Resistenzphänotyps unterstreicht (17, 18). Obwohl keine Sequenzierung des gesamten Genoms durchgeführt wurde, was eine Einschränkung dieser Studie darstellt, spielen andere Gene als mecA eine Rolle, da das Resistenzniveau bei Einführung der E447K-Mutation zwischen COL- und SF8300-Mutationen unterschied und die hochresistente passagierte COL-Mutante keine mecA-Mutationen aufwies. Obwohl es wahrscheinlich andere gibt, scheinen Mutationen in Genen, die für PBP4 und GdpP kodieren, besonders wichtig zu sein, da diese wiederholt in Ceftobiprol- und Ceftarolin-passagierten Mutanten identifiziert wurden. Die Rolle dieser und anderer Gene wird aktiv untersucht.