Ergebnisse und Diskussion

In Säugetiersystemen hat sich gezeigt, dass die Cdc42-Aktivität bei der Regulierung der Differenzierung von Hautstamm- / Vorläuferzellen in Haarfollikelzellen, der Kontrolle der Polarität von neuroepithelialen Stamm- / Vorläuferzellen und der hemisphärischen Bifurkation des Gehirns sowie der Regulierung der Zellzahl und des Wachstums während der perinatalen Entwicklungsphase wichtig ist (6-9). Interessanterweise zeigt eine Untersuchung der Cdc42-Aktivität bei gesunden erwachsenen Mäusen unterschiedlichen Alters, dass der relative Cdc42-GTP-Spiegel älterer Tiere in verschiedenen Geweben, einschließlich Herz, Gehirn, Lunge, Leber, Knochenmark, Milz und Niere, signifikant höher ist als der jüngerer Tiere (Abb. 1A und Daten nicht gezeigt), was die Möglichkeit erhöht, dass eine erhöhte Cdc42-Aktivität am normalen Alterungsprozess beteiligt ist.

Um festzustellen, ob die erhöhte Cdc42-Aktivität im Zusammenhang mit dem natürlichen Altern physiologische Relevanz haben kann, untersuchten wir den Cdc42-negativen Regulator, Cdc42GAP, in Gen-targeted Mäusen, nachdem sie das Erwachsenenalter erreicht haben. Frühere Studien an den homozygoten Cdc42GAP-Knockout-Mäusen während der Perinatalperiode zeigten, dass verschiedene Gewebe / Zellen erhöhtes Cdc42-GTP enthielten und die Embryonen / neugeborenen Welpen des Cdc42GAP − / − Genotyps eine reduzierte Organ- / Organismusgröße aufwiesen, die mit einer erhöhten spontanen Apoptose in verschiedenen Zelltypen zusammenhängt (6). Bei adulten Cdc42GAP- /- Mäusen war die Cdc42-Aktivität in mehreren Gewebe- / Zelltypen konstitutiv höher als bei den passenden WT-Mäusen, während das Niveau von RhoA-GTP oder Rac1-GTP dem von WT ähnlich blieb (Abb. 1 B; daten nicht gezeigt), was auf eine spezifische Verstärkung der Cdc42-Aktivität bei den erwachsenen Tieren hindeutet, ähnlich der während der Perinatalperiode. Die Mehrheit der Cdc42GAP- / – Mäuse starb während der Neugeborenenperiode aufgrund ihrer geringeren Größe und ihres schwachen Körpers (6). Ein Teil von ihnen (≈7%) könnte jedoch die Neugeborenenperiode unter Pflege durch nicht verwandte pflegende Frauen überleben. Trotz regelmäßiger Milchaufnahme und normaler Serumglukose− und Insulinkonzentrationen, die bei homozygoten Mäusen in der postnatalen Phase gefunden wurden , verlangsamte sich die Gewichtszunahme von Cdc42GAP− / – Mäusen im Alter von ≈3 Monaten im Vergleich zu ≈5 Monaten bei WT- oder heterozygoten Mäusen, und die reifen Homozygoten waren aufgrund einer Abnahme der Gesamtzellularität um ≈30% im Körpergewicht reduziert (Abb. 1C und Daten nicht dargestellt). Die mittlere Lebensdauer der Cdc42GAP −/− Mäuse betrug ≈12 Monate, während die Kontrollmäuse (WT oder heterozygot) bis zu einem mittleren Alter von ≈27 Monaten vital blieben (Abb. 1 D). Die Überlebenskurve der homozygoten Mäuse unterscheidet sich etwas von der typischen Gompertz-Kurve, ähnelt jedoch denen für BubR1 (ein mitotischer Checkpoint-Regulator) Knockout (10) oder p44 (eine kurze Isoform des p53-Tumorsuppressors) transgene (11) Tiere. Kyphose und mangelnde Vitalität bei Cdc42GAP- /- Mäusen zeigten sich im Alter von ≈12 Monaten (Abb. 1 E). Gehäutete Cdc42GAP- /- Mäuse im Alter von 15 Monaten zeigten eine deutliche Verringerung der Körpermasse, einen erheblichen Verlust an subdermalem Fettgewebe, schwere Lordokyphose und Muskelatrophie (Daten nicht gezeigt). Eine Röntgenaufnahme zeigte bei Cdc42GAP−/−Mäusen im Alter von 15 Monaten einen signifikanten Kyphose-Phänotyp und eine verminderte Knochenmineraldichte (BMD) (Abb. 1 F). Eine weitere Quantifizierung der präparierten Knochen von Cdc42GAP- /- Mäusen ergab eine 3- und 2,6-fache Reduktion der BMD in der Tibia bzw. im Femur (SIEHE Abb. 7). Darüber hinaus verloren sowohl männliche als auch weibliche Cdc42GAP− / − Mäuse die Fruchtbarkeit in einem früheren Alter im Vergleich zu WT. Bei der Paarung zwischen Cdc42GAP- /- Weibchen und WT-Männchen wurden die Homozygoten im Alter von 26 Wochen unfruchtbar, verglichen mit 48 Wochen für WT (Abb. 1 G). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass ein Cdc42GAP-Mangel zu einem konstitutiv erhöhten Cdc42-GTP-Spiegel, einer verringerten Körpergröße, einer frühen Kyphose, einer verringerten BMD, einer verkürzten Fruchtbarkeitsperiode und einer verringerten Lebensdauer bei erwachsenen Mäusen führt.

Die H&E gefärbten Schnitte durch den 8 Monate alten weiblichen Mauswirbelkörper zeigten, dass die Cdc42GAP – /- Mäuse im Vergleich zu WT−Mäusen einen dünneren, gebogenen Kortex und dünnere Trabekel aufwiesen (Abb. 2A). In ähnlicher Weise zeigten die Längenabschnitte des Femurs der homozygoten Mäuse eine Verringerung der kortikalen Knochendicke im Vergleich zu der von WT-Mäusen (Daten nicht gezeigt). Diese Beobachtungen stimmen mit dem groben Erscheinungsbild und den klinischen Merkmalen der Osteoporose überein. Milz, Leber und Nieren von adulten Cdc42GAP− / − Mäusen waren aufgrund einer Abnahme der Gesamtzellularität in der Masse reduziert, was in den H&E-gefärbten Abschnitten der Milz offensichtlich war, und die T- und B-Zell-haltigen weißen Pulpa−Regionen von 12 Monate alten Cdc42GAP− / – Milz waren im Vergleich zu denen von altersgleichen WT-Mäusen deutlich reduziert (Abb. 2B und Daten nicht gezeigt), was auf eine ausgeprägte lymphoide Atrophie bei den Homozygoten hindeutet. In Übereinstimmung mit der scheinbaren Reduktion des subdermalen Fettgewebes ergab die histologische Analyse der Querschnitte der dorsalen Haut eine fast vollständige Abwesenheit von s.c.-Fettzellen in 9 Monate alten Cdc42GAP – / – Mäusen (Abb. 2 C). Ein Verlust an Muskelmasse und Muskelatrophie wurden auch durch die Untersuchung von H&E-gefärbten Skelettmuskelschnitten von 12 Monate alten Cdc42GAP- /- Mäusen und den altersgerechten WT−Mäusen bestätigt (Abb. 2 C). Die Cdc42GAP- /- Mäuse zeigten auch eine deutliche Reduktion der Haarregeneration nach Entfernung der Rückenhaare durch Rasieren, während die alters- und geschlechtsangepassten Mäuse ein robustes Nachwachsen der Haare zeigten (SIEHE Abb. 8). Die Fähigkeit, Belastungen wie Wundheilung, eine alterungsassoziierte Aktivität (12) der Cdc42GAP- /− Mäuse, zu tolerieren, war im Vergleich zu WT signifikant reduziert (Abb. 2 D). Die histopathologische Analyse der Wundabschnitte zeigte bei den Cdc42GAP−/−Mäusen eine geringe Reepithelialisierung im Wundrand, wohingegen eine vollständige Reepithelialisierung der Mäuse 4 Tage nach dem Einbringen der Wunde evident war (Abb. 2 E). Zusätzlich zu diesen Beobachtungen waren eine Reihe von hämatopoetischen Phänotypen der homozygoten Mäuse, einschließlich Anämie, verminderte Milz- und Knochenmarkszellen, Defekte der hämatopoetischen Stammzelleneinpflanzung in das Knochenmark und eine erhöhte Empfindlichkeit von hämatopoetischen Stammzellen gegenüber induzierter Mobilisierung (13, 14) konsistent mit einer frühen Alterung im hämatopoetischen System. Wichtig ist, dass eine Untersuchung junger homozygoter Mäuse (<4 Monate alt) vor der Manifestation offensichtlicher Phänotypen keine größeren Anomalien in Knochen, Haut und Milz ergab (SIEHE Abb. 9A und B und Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die alterungsähnlichen Phänotypen der Cdc42GAP-/− Mäuse nicht auf eine frühe Entwicklungsstörung zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnten bei den alten (>2,5 Jahre alten) WT-Mäusen eine Reihe von Phänotypen der homozygoten Mäuse gefunden werden, darunter reduzierte kortikale Knochendicke, Kyphose und Verlust von Muskelmasse und epidermalem Gewebe (SI Abb. 9C und D und Daten nicht dargestellt). Wie in SI-Tabelle 1 zusammengefasst, liefern diese Ergebnisse zusammen einen starken Beweis dafür, dass ein Cdc42GAP-Mangel bei den Tieren zu vorzeitigen alterungsähnlichen Phänotypen führt.

Die Färbung der Gewebe von 9 Monate alten Erwachsenen, einschließlich Leber, Niere und Milz, auf Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal) ergab eine starke Aktivität dieses Seneszenzmarkers in den homozygoten Mäusen, die in den Geweben von alters- und geschlechtsangepassten WT-Mäusen nicht nachweisbar war (Abb. 3A und in Fig. 10), was darauf hinweist, dass Cdc42GAP- /- adulte Gewebe eine vorzeitige Seneszenz erfahren können. Interessanterweise war eine erhöhte Apoptose der homozygoten Gewebe, die während der Perinatalperiode beobachtet wurde, bei den erwachsenen Homozygoten nicht vorhanden, wenn die erhöhte SA-β-gal-Aktivität offensichtlich war (Ref. 6 und Daten nicht dargestellt). Cdc42GAP- / – Maus-embryonale Fibroblasten (MEF) -Zellen, die ≈ 3-fach höheres Cdc42-GTP, aber normale Rac1-GTP- oder RhoA-GTP-Gehalte im Vergleich zu WT-MEF-Zellen (6) enthalten, zeigten signifikant erhöhte SA-β-gal-Aktivität und akkumulierten eine abgeflachte und vergrößerte seneszente Morphologie ab Passage 6, wenn WT-MEF-Zellen negativ für die SA-β-gal-Aktivität waren und in der Morphologie schwach waren (Abb. 3B und in Fig. 11). Die Cdc42GAP- /- MEF-Zellen begannen sich an den Passagen 5-7 zu verlangsamen, als die übereinstimmenden WT-MEF-Zellen exponentiell wuchsen (Abb. 3C) (6), und sie durchliefen nach Passage 7 eine massive replikative Seneszenz, wohingegen die meisten WT-MEF-Zellen erst nach Passage 13 eine Seneszenz erreichten (siehe Fig. 11 und nicht dargestellte Daten). Darüber hinaus bildete ein signifikant höherer Prozentsatz von Cdc42GAP− /− MEF-Zellen bei Passage 7 größere Herde im Kern als WT-Zellen (SIEHE Abb. 12). Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Cdc42GAP-Mangel eine frühe Gewebe- / Zellseneszenz induziert.

Ein anerkannter Faktor, der zur vorzeitigen Alterung und Zellseneszenz von Säugetieren beiträgt, ist die erhöhte genomische Instabilität (15). Die Metaphasenspreizanalyse zeigte, dass >30% der primären Splenozyten von 8 Monate alten homozygoten Mäusen aneuploid waren, während alters- und geschlechtsangepasste primäre Splenozyten keine nachweisbare Aneuploidie aufwiesen (Abb. 3D), was darauf hindeutet, dass das Cdc42GAP−/− Gewebe eine genomische Instabilität aufwies. Zur Unterstützung dieses Befundes zeigten Cdc42GAP−/− MEF-Zellen einen signifikanten Anstieg von Doppelkernzellen unter DAPI-Färbung im Vergleich zu WT-Zellen bei Passage 7 (SI Abb. 12). Die Karyotypanalyse der späteren Passagen von MEF-Zellen (Passage 6-7) ergab weiter, dass, obwohl die meisten Chromosomen aus WT−Zellen (≈80%) intakt blieben, 42% der Cdc42GAP− / – Zellen mindestens eine Chromosomenaberration, 20% zwei oder mehr Aberrationen und 14% drei oder mehr Aberrationen enthielten (Abb. 3 E). Der Prozentsatz und der Grad der Aneuploidie nahmen auch in Cdc42GAP− /− MEF-Zellen signifikant zu, wobei >32% der Zellen abnormale Chromosomenzahlen im Bereich von 72 bis 102 aufwiesen, während die meisten WT-Zellen diploid waren (Abb. 3E und SI Fig. 13). Die Karyotypanalyse der Chromosomenschäden zeigt, dass die Aberrationen der homozygoten MEF-Zellen vielfältig waren, einschließlich Chromatidbruch, vorzeitiger Schwesterchromatidtrennung (ein Kennzeichen eines defekten Spindelbaugruppen-Checkpoints), Translokation, Chromosomenbrüchen, dizentrischem Chromosom und Chromosomenfragmentierung (Abb. 3F und SI Tabelle 2), was darauf hindeutet, dass die DNA−Reparaturmaschinerie in Cdc42GAP− /- Zellen beeinträchtigt ist. Die Immunfluoreszenzfärbung von phospho-H2 AX im Zellkern, einem DNA Damage response Marker (16), zeigt, dass, obwohl 10% der Passage 7 Cdc42GAP−/− MEF Zellen positiv für den DNA Damage Marker waren, <1% der WT Zellen positiv waren (Abb. 3 G). Die Korrelation zwischen dem Auftreten und Fortschreiten der alterungsähnlichen Phänotypen der Cdc42GAP- / – Mäuse und dem beobachteten Grad und Schweregrad der genomischen Aberrationen in Cdc42GAP− / − Zellen unterstützt eine Rolle von Cdc42 bei der Entwicklung der Progeroidmerkmale.

Um den möglichen Mechanismus der akkumulierten DNA−Schäden in Cdc42GAP− / – Zellen zu bestimmen, verglichen wir den endogenen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) -Spiegel der homozygoten Zellen mit dem von WT-Zellen, da Rac1 und Rac2, zwei eng verwandte Rho-GTPasen, bekannte Regulatoren von zellulärem ROS sind (17). In Fig. 14 zeigt, dass Cdc42GAP-/- Zellen eine ROS-Aktivität ähnlich der von WT-Zellen zeigten, was darauf hindeutet, dass Cdc42GAP die genomische Stabilität durch einen endogenen ROS-unabhängigen Mechanismus reguliert. Aufgrund der Ähnlichkeiten mehrerer Cdc42GAP- /- Maus-Phänotypen mit denen einer Reihe von Gen-gezielten Mausmodellen von DNA-Schadensreparaturmolekülen, einschließlich der Brca1−/−p53 +/−, Ku80−/− und Mtr− /−Wrn-Mausmodelle (12, 18, 19) untersuchten wir weiter die Reaktionsfähigkeit der frühen passagierten Cdc42GAP- / – Zellen auf verschiedene DNA-Schadensagenten. Im DNA Damage Response Growth Assay zeigten die Cdc42GAP-defizienten Zellen einen breiten Defekt der DNA-Schadensreparaturaktivität (Abb. 4), die sich als signifikant höhere Prozentsätze des Zelltods bei den homozygoten Zellen im Vergleich zu WT-Zellen nach Behandlung durch Erhöhung der Dosen von H 2O2, ionisierender Bestrahlung, Camptothecin, Methylmethansulfonat oder Mitomycin C manifestierten. Somit können die akkumulierten verschiedenen genomischen Anomalien, die in den späteren Passagen von Cdc42GAP− / −Zellen gefunden wurden, zumindest teilweise auf beeinträchtigte DNA-Schadensreparaturaktivitäten zurückzuführen sein.

Eine Folge anhaltender genomischer Schäden in den Zellen ist die Induktion multipler DNA-Damage-Response- und/oder Seneszenzgene (20, 21). Die Expression von p53, p21Cip1, p16INK4a und phospho-p53 (Ser-15) in Cdc42GAP− /− MEF-Zellen war nach ähnlichen Passagen signifikant höher als die von WT-MEF-Zellen, während p19ARF in den homozygoten Zellen einen ähnlichen Anstiegstrend mit Passagen zeigte, wie die WT-Zellen (Abb. 5A). Die Proteinspiegel von p53, p21Cip1, p16INK4a, Phospho-p53 (Ser-15) und des DNA-Schadensmarkers phospho−H2 AX in Cdc42GAP− /- Geweben von 8 Monate alten Mäusen waren ebenfalls signifikant höher als in den entsprechenden Geweben von Matched-WT-Mäusen (Abb. 5B). Diese Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass die Aktivierung des p53-regulierten Signalwegs, insbesondere p21Cip1 und p16INK4a, mit einer durch Cdc42GAP-Mangel induzierten frühen Seneszenz assoziiert ist. Um die Frage zu untersuchen, ob eine erhöhte Cdc42-Aktivität in den Cdc42GAP-defizienten Zellen ausreicht, um den frühen Seneszenzphänotyp zu erklären, exprimierten wir eine aktivierende Mutante von Cdc42, Cdc42F28L, in primären WT-MEF-Zellen und testeten die SA-β-gal-Aktivität der Zellen im Vergleich zu der von passenden EGFP-exprimierenden Zellen an verschiedenen Passagen. Die Cdc42F28L-Expression verursachte einen signifikanten Anstieg der SA-β-gal-positiven Zellpopulation (35% in Cdc42F28L-Zellen im Vergleich zu 7% in EGFP-exprimierenden Zellen) in frühpassagierten MEF-Zellen (Abb. 5C), was darauf hinweist, dass die Cdc42-Aktivierung für die Induktion einer frühen Zellseneszenz ausreichend ist.

Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass der Seneszenzphänotyp von Cdc42GAP−/− Zellen durch einen p53−Defekt gerettet werden könnte, erzeugten wir Cdc42GAP+/−p53+/- Mäuse und versuchten, MEF-Zellen aus der Kreuzung herzustellen. Von 44 Embryonen wurden sechs mit dem Cdc42GAP−/−p53+/− Genotyp und keiner mit dem Cdc42GAP−/−p53-/- Genotyp erhalten. Die Cdc42GAP− /−p53 +/− MEF−Zellen wuchsen mit einer Rate zwischen der von p53 + /− und WT−Zellen und zeigten eine basale Seneszenzpopulation, die mit der von p53 + /− oder WT-Zellen bei Passage 7 vergleichbar war, während die p53-/- und Cdc42GAP-/- MEF-Zellen mit einer linearen Kurve und einer Biege-Populationsverdopplungskurve proliferierten und an ähnlichen Passagen seneszenzresistent bzw. seneszenzanfällig waren (Abb. 5D und E). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Cdc42-aktivierungsinduzierte vorzeitige Seneszenz von p53 abhängt.Die begrenzte Lebensdauer von Zellen und Tieren kann aus replikativer Seneszenz als Reaktion auf verschiedene Belastungen resultieren, einschließlich DNA-Schäden (22), Telomererosion (23), ROS (24) und / oder unangemessen aktivierten Onkogenen (25). Die Cdc42GAP- / – Mäuse präsentieren ein Gain-of-Cdc42-Activity-Tiermodell, das die mitogene signalinduzierte Cdc42-Aktivierung nachahmt (6) und eine Bewertung der möglichen Auswirkungen der Cdc42-Aktivierung auf die Tier- und Zellphysiologie ermöglicht. Wir zeigen, dass ein Cdc42GAP-Mangel den frühen Beginn der Seneszenz in Zellen und vorzeitige alterungsähnliche Phänotypen im Tier verursacht. Insbesondere das Cdc42GAP-Gen-Targeting induziert eine globale Zunahme der Cdc42-Aktivität und fördert die zellgenomische Instabilität mit verminderter Reparaturfähigkeit von DNA-Schäden, was wiederum p53 und p1614a aktivieren kann, was zu einer frühen Seneszenz führt (Abb. 5 F). Zuvor wurde festgestellt, dass Cdc42 in seneszenten Zellen aktiviert wird, um die morphologische Anpassung zu modulieren (26). Es wurde auch vorgeschlagen, an p53-regulierten zellmorphologischen Veränderungen, Apoptose und Proliferation beteiligt zu sein (27-29) und an c-Jun N-terminaler Kinase-kontrollierter Apoptose (30, 31), Ereignisse, die mit zellulärer Seneszenz und Tieralterung in Verbindung gebracht wurden (32, 33). Unsere Ergebnisse, dass die Cdc42-Aktivierung mit dem natürlichen Altern verbunden ist und dass ein Cdc42GAP-Mangel einen DNA-Schadensreparaturdefekt verursacht, der es den Zellen ermöglicht, genomische Anomalien anzusammeln, die zu einer frühen Seneszenz führen, legen einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Cdc42-Aktivität und dem Altern von Säugetieren nahe.

Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung des p53-Signalwegs oder die Störung von Genen, die an der Reparatur von DNA-Schäden oder der Regulierung der genomischen Stabilität beteiligt sind, bei Mäusen eine frühe Alterung induziert (11, 12, 33, 34). In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen, dass Cdc42 möglicherweise nicht an der Regulierung der zellulären Superoxidaktivitäten beteiligt ist (17), fanden wir heraus, dass der akkumulierte DNA−Schaden in Cdc42GAP− / – Zellen nicht mit der ROS-Aktivität assoziiert ist, da homozygote Zellen keine erhöhte ROS-Aktivität zeigen. Die Cdc42GAP-Deletion bewirkt eine deutliche Verringerung der Reparaturfähigkeit von DNA-Schäden in einem breiten Spektrum, einschließlich Reaktionen auf das DNA-Vernetzungsmittel und den Doppelstrangbruch- oder Einzelstrangbruchinduktor, was darauf hindeutet, dass eine längere Aktivierung von Cdc42 die Reparaturfähigkeit von DNA-Schäden dämpfen kann. Die Vielfalt der in den Cdc42GAP− / − Zellen gefundenen genomischen Schäden steht auch im Einklang mit einem Einfluss eines globalen DNA-Schadensreparaturdefekts. Zu den wichtigen Fragen, die noch zu klären sind, gehören, welche spezifischen molekularen Determinanten an der Cdc42GAP-regulierten Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind und welche Upstream-Signale während des normalen Alterungsprozesses eine erhöhte Cdc42-GTP verursachen.