Ergebnisse

Charakterisierung von plasmazytoiden dendritischen Zellen des Dünndarms.

Wir haben Standardverfahren angewendet, um Immunzellen im Epithel (intraepithelial, DH) und im LP aus dem Darm zu isolieren. In beiden Zellpräparaten fanden wir eine ausgeprägte Population von CD11c + B220 + Ly6C + Zellen, die bis zu 1% aller Zellen ausmachten. Im Gegensatz zu pDC waren myeloide (m)DC (CD11c+MHCII+CD3−B220−Ly6C−) in der IE-Präparation nur in sehr geringer Anzahl vorhanden (Abb. 1A). Sowohl pDC der LP- als auch IE-Präparation zeigten geringe Mengen an Oberflächen-MHC-Klasse-II-Expression (Abb. 1A). Weitere Analysen ergaben, dass CD11c+B220+Ly6C+ Zellen beider Präparate die pDC-Marker PDCA1 sowie 120G8 einheitlich exprimieren (Abb. 1 B). Cytospins aus sortiertem pDC (CD11c+B220+Ly6C+) und myeloidem DC (mDC) der IE-Präparation zeigten eine runde und glatte, plasmazellartige Morphologie von pDC, wohingegen mDC die charakteristischen Dendriten zeigte (Abb. 1 C). Um die Lokalisation von pDC im Darm weiter zu charakterisieren, haben wir Anti-B220, Anti-120G8 und Anti-CD3 mAb in der Immunhistologie angewendet. Mikroskopische Aufnahmen wurden zufällig aus Schnitten entnommen und, wie in Fig. 1D wurde die Positionierung von 120G8+B220+CD3− Zellen relativ zu Epithelzellen mittels Bildanalyse (analySIS; Olympus, Hamburg, Deutschland) bestimmt. Bei der Auswertung der Positionierung von ≈150 pDC beobachteten wir, dass 4,9% dieser Zellen deutlich innerhalb der Epithelzellschicht lokalisiert waren, während weitere 6,7% in einem Abstand von 5-10 µm von der apikalen Spitze der Epithelzellen lagen (Abb. 1 D). Diese Daten zeigen, dass sich eine bestimmte Menge des pDC innerhalb oder in der Nähe des Darmepithels befindet, während >80% der analysierten Zellen in Abständen >15 µm positioniert waren, was sie als LP-Zellen darstellt (Abb. 1 D). Da in der IE- und LP-Präparation nach Standardisolationsverfahren eine ähnliche Anzahl von pDC vorhanden war, ist derzeit unklar, ob pDC der LP die IE-Präparation kontaminieren oder ob pDC, die zum Epithel gehören, effizienter isoliert werden. Da wir in der IE-Vorbereitung kaum mDC finden, bevorzugen wir die letztere Möglichkeit. Es muss jedoch noch festgestellt werden, ob beide Populationen unterschiedliche Funktionen erfüllen oder zu einer gemeinsamen Zellpopulation gehören. Da pDC der IE-Präparation im Gegensatz zu pDC der LP-Präparation durch eher schonende Verfahren isoliert werden kann, wurden in dieser Studie ausschließlich pDC der IE-Präparation für funktionelle Assays verwendet.

CCR9-Expression auf Darm-pDC.

Um die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die die Migration von pDC in den Darm ermöglichen, analysierten wir die Expression von Homing-Molekülen. Obwohl bekannt ist, dass das Integrin aE (CD103) die Lymphozytenadhäsion an Epithelzellen im Darm vermittelt, konnten wir die Expression dieses Integrins auf der intestinalen pDC nicht identifizieren. In ähnlicher Weise CCR7 (Fig. 1 E), im Wesentlichen in Homing von Lymphozyten in periphere lymphatische Organe beteiligt ist, wird nicht durch pDC des Darms exprimiert. Im Gegensatz dazu beobachteten wir hohe CD18-Spiegel (β2-Integrin) und mittlere α4β7-Spiegel, während ≈50% der pDC P-Selektin-Liganden exprimieren (Abb. 1 E). Von Interesse ist, dass die überwiegende Mehrheit der intestinalen pDC hohe Mengen des Chemokinrezeptors CCR9 exprimierte (Abb. 1 E), während mDC der LP keine oder niedrige CCR9-Werte exprimierte.

CCR9 Expression von pDC isoliert aus verschiedenen lymphatischen Organen.

In Anbetracht der einheitlichen Expression von CCR9 auf intestinalem pDC analysierten wir die Expression von CCR9 auf pDC, die aus sekundären lymphoiden Organen einschließlich Milz, hautdrainierendem LN, mesenterialem LN und Peyer-Patches isoliert wurden (PP; Abb. 2A) und verwendete CD4+CD8+-Thymozyten, von denen bekannt ist, dass sie hohe CCR9-Spiegel exprimieren, als Positivkontrolle (11); Fig. 2B). Interessanterweise exprimierte nur ein Bruchteil der in einem dieser Organe vorhandenen pDC CCR9 (Abb. 2A), während ≈95% der aus dem BM isolierten pDC diesen Rezeptor trugen (Fig. 2 C). Die meisten BM-pDC exprimieren auch CCR5 und CXCR3, während CCR2 nur in etwa 25% der Zellen vorhanden ist. CXCR4, von dem bekannt ist, dass es Zellen an das BM bindet, wird nur sehr schwach exprimiert (Abb. 2 C). Zusammen zeigen diese Daten, dass pDC mit verschiedenen Chemokinrezeptoren ausgestattet sind, bevor sie aus dem BM freigesetzt werden. Diese Eigenschaft erlaubt vermutlich Homing nicht nur zu Orten der Entzündung, sondern auch zum nicht entzündeten Darm.

Chemotaxis-Analyse von Flt3L-erweitertem pDC.

Basierend auf der starken Expression von CCR9 auf BM und intestinalem pDC verglichen wir die Migrationskapazität von pDC und mDC in Richtung des Chemokins CCL25 /TECK, das der einzige bekannte Ligand für diesen Rezeptor ist (12). Die Häufigkeit von pDC variiert zwischen verschiedenen Mausstämmen, und es ist bekannt, dass beispielsweise C57BL / 6 (B6) -Mäuse viel weniger pDC enthalten als 129SV-Mäuse (13). Unabhängig vom genetischen Hintergrund reicht die Anzahl der pDC, die aus Mausgeweben isoliert werden können, jedoch nicht aus, um Standard-In-vitro-Chemotaxis-Assays durchzuführen. Um diese Einschränkung zu überwinden, erweiterten wir die DC-Population in vivo durch Implantation einer Flt3-L-sekretierenden Tumorzelllinie (B16-FL) in B6-Mäuse für 14 Tage (14).

Während dieses Zeitraums stieg der Prozentsatz der in der Milz vorhandenen CD11c + -Zellen von 3% auf 30-35% (Daten nicht gezeigt). Achtzig Prozent der in vivo expandierten pDC exprimierten CCR9, wobei die Spiegel denen auf BM-pDC sehr ähnlich waren (Abb. 2C und Fig. 4C), während in vivo expandiertes mDC nur geringe Mengen dieses Rezeptors exprimierte (siehe Fig. 6B). Milz-pDC wurden durch CD11c + MACS-Sortierung angereichert, was zu einer Reinheit von 95% für CD11c + -Zellen führte, die ≈15% Ly6C + B220 + pDC enthielten. In-vitro-Transwell-Migrationstests zeigten eine starke chemotaktische Reaktion von pDC auf CCL25 sowie auf CXCL9, einen Liganden für CXCR3 und auf CXCL12, einen Liganden für CXCR4. Es wurde nur eine schwache Reaktion auf CCL19 beobachtet, das als Ligand für CCR7 dient. mDC zeigte eine geringe chemotaktische Reaktion gegenüber CCL25 und CXCL9 und eine moderate Reaktion gegenüber CXCL12 und CCL19 (Abb. 3A).

Reduzierte Anzahl von pDC im Dünndarm von CCR9-defizienten Mäusen.

Basierend auf diesen Beobachtungen charakterisierten wir die Verteilung von pDC in CCR9-defizienten Mäusen. Wir fanden ähnliche Prozentsätze von pDC in Lunge und Leber (SIEHE Abb. 7) sowie in inguinalen und mesenterialen Lymphknoten, wohingegen die Anzahl der Milz−pDC bei CCR9−/-Mäusen leicht erhöht war. Im Gegensatz dazu beobachteten wir eine >90% ige Abnahme von intestinal und eine 50% ige Reduktion von PP pDC (Abb. 3B).

pDC wandern bevorzugt in den Dünndarm.

Basierend auf den bisher beschriebenen Befunden schien es wahrscheinlich, dass pDC CCR9 für die Suche nach dem Dünndarm benötigen. Um diese Hypothese zu beweisen, transferierten wir adoptiv Zellen von B6− und CCR9− / – Spendern, die 14 Tage lang einen Flt3-L-sekretierenden Tumor trugen. Unter dem Einfluss von Flt3L expandierte pDC in ähnlichem Ausmaß in B6- und CCR9- /- Mäusen (Abb. 4A und in Fig. 8) und waren hinsichtlich der Expression von CCR2, CCR5 und CXCR3 nicht unterscheidbar, wohingegen CCR9 nur an pDC nachgewiesen wurde, die von B6, aber nicht von CCR9-defizienten Spendern stammten (Abb. 4 C). Ohne weitere Reinigung wurden Splenozyten dieser Spender mit 5(6)-Carboxyfluoresceindiacetat-N-succinimidylester (CFSE) bzw. 5 (6)-Carboxytetramethylrhodamin-N-succinimidylester (TAMRA) markiert. Eine Mischung aus WT- und CCR9-defizienten Zellen, die so eingestellt waren, dass sie eine gleiche Anzahl von pDC enthielten, wurde i.v. in B6-Empfänger übertragen. Nach 18 h Transfer analysierten wir zunächst die Zusammensetzung der adoptiv transferierten WT-Zellen, die sowohl in der IE- als auch in der LP-Präparation vorhanden waren, und stellten fest, dass 54% bzw. 25% aller aus der IE- und LP-Fraktion gewonnenen Zellen pDC waren (Abb. 4 B). Diese Ergebnisse zeigen, dass unter den verschiedenen Zellpopulationen übertragen pDC nach Hause am effizientesten in den Darm. Diese kompetitiven Transfers zeigten auch, dass CCR9-defiziente pDC in ihrer Fähigkeit, in den Darm zu gelangen, weitgehend beeinträchtigt sind, was sich in dem niedrigen Migrationsverhältnis von CCR9-defizientem zu WT-pDC widerspiegelt, das in der IE- und LP-Präparation gefunden wurde (Abb. 4 D). Im Gegensatz dazu migrierten CCR9-defiziente und B6-pDC mit ähnlicher Effizienz in periphere und mesenteriale Lymphknoten (Abb. 4 D). Die Art der Zellmarkierung hatte keinen Einfluss auf diese Experimente, da der Austausch der Farbstoffe zwischen B6− und CCR9−/- Zellen zu identischen Ergebnissen führte (Daten nicht dargestellt). Obwohl diese Daten eindeutig zeigen, dass pDC CCR9 für ein effizientes Homing in den Darm benötigen, sollte erwähnt werden, dass sich die Handelseigenschaften von pDC von mit Flt3-Liganden behandelten Mäusen von denen unter physiologischen Situationen unterscheiden können.

pDC werden in den entzündeten Darm rekrutiert.

Da bekannt ist, dass pDC eine wichtige Rolle bei der antiviralen Immunität spielen (4, 10), spekulierten wir, dass pDC während entzündlicher Prozesse in den Darm rekrutiert werden könnte, um die First-Line-Abwehr zu stärken. Es ist bekannt, dass Choleratoxin (CT) bei oraler Verabreichung eine Darmentzündung induziert, und es wurde berichtet, dass innerhalb von 2 h nach oraler Anwendung die Anzahl der vorübergehend in den Darm rekrutierten mDC um das 4-fache zunimmt (15). Wir beobachteten, dass sich die pDC-Zahlen zusätzlich zu mDC auch um das 3-fache erhöhten, wenn B6-Mäuse mit 10 µg CT gefüttert wurden (Abb. 4 E). Interessanterweise führte der identische Versuchsaufbau weder in der IE- noch in der LP-Präparation von CCR9-defizienten Mäusen nach 1, 2 oder 3 h CT-Behandlung zu einem Anstieg der pDC (Abb. 4E und Daten nicht dargestellt). Die spezifische Anforderung an CCR9 an pDC für ihre Rekrutierung in den Darm während entzündlicher Prozesse wurde durch adoptiven Transfer von WT und CCR9-defizientem pDC an CCR9-defiziente Empfänger bestätigt, gefolgt von Anwendung von CT wie oben beschrieben. Während adoptiv übertragene WT-pDC in der IE- und LP-Präparation reichlich vorhanden waren, waren CCR9-defiziente pDC aus diesen Kompartimenten fast vollständig ausgeschlossen (Abb. 4 F). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass bei entzündlichen Ereignissen pDC an die Darmschleimhaut rekrutiert werden kann und dass dieser Mechanismus zu einem großen Teil auf CCR9 beruht.

Eine Rolle für intestinale pDC für die schnelle Mobilisierung von LP Myeloid DC.

Es wurde kürzlich gezeigt, dass die orale Anwendung des TLR7/ 8-Liganden resiquimod (R848) zu einer schnellen Mobilisierung von LP DC führt und dass TNFa, möglicherweise von pDC freigesetzt, an diesem Prozess beteiligt ist (16). Wir spekulierten daher, dass intestinales pDC die Quelle von TNFa sein könnte, die möglicherweise die Mobilisierung benachbarter mDC auslöst. Um diese Hypothese zu testen, stimulierten wir in vitro B6 pDC der IE- und LP-Präparation für 16 h mit R848. Tatsächlich sezernierte pDC beträchtliche Mengen an TNFa, produzierte jedoch keine nachweisbaren Mengen an IL-2, IL-4, IL-5 oder IFNy (Abb. 5A). Wir analysierten dann die Mobilisierung von LP mDC in vivo nach oraler Anwendung von R848. Während sich unbehandelte B6− und CCR9−/- Mäuse hinsichtlich des Vorhandenseins von intestinalem mDC nicht unterschieden (Abb. 5B), induzierte orales R848 innerhalb von 2 h die Mobilisierung von ≈60% mDC in WT, aber nur 10,8% in CCR9-/- Mäusen. Wichtig ist, dass sobald CCR9-defiziente Mäuse i.v. erhielten Milz-pDC von Flt3L-behandelten WT-Spendern 16 h vor oraler Anwendung von R848 konnte dieser Mangel an intestinaler mDC-Mobilisierung vollständig gerettet werden (Abb. 5C). Diese Experimente zeigen, dass ein CCR9-abhängiges Homing von pDC in den Darm an der schnellen Mobilisierung von intestinalem mDC nach oraler Applikation eines TLR7 / 8-Liganden beteiligt ist. Da andere im Rattenmodell gezeigt haben, dass die Anwendung von LPS auch die Mobilisierung von LP-mDC induziert (17), haben wir 50 µg LPS i.p. auf WT- und CCR9-defiziente Tiere aufgetragen. Interessant ist, dass wir unter diesen experimentellen Bedingungen keinen Unterschied zwischen WT und CCR9-defizienten Tieren bezüglich der Mobilisierung von LP mDC beobachten konnten (SIEHE Abb. 9).