Coxsackievirus B3 (CVB3) ist ein Enterovirus aus der Familie der Picornaviridae. Nach Bindung an den Coxsackievirus- und Adenovirus-Rezeptor (6, 64) gelangt die virale RNA in das Zytoplasma, wo sie von der Wirtstranslationsmaschinerie in ein einzelnes Polyprotein translatiert wird. Das Polyprotein wird dann proteolytisch durch virale Proteasen verarbeitet, um alle viralen strukturellen und nichtstrukturellen Proteine herzustellen. Die virus-kodierte RNA-abhängige RNA-Polymerase transkribiert negativ-Strang virale RNAs, die als Vorlagen für die Synthese mehrerer Nachkommen Genome dienen. Nach der viralen Verpackung wird das Virus freigesetzt, möglicherweise unter dem Einfluss des Virus-codierten 2B-Proteins (67). Während des replikativen Prozesses und der Freisetzung viraler Nachkommen tritt der zytopathische Effekt (CPE) auf und die Wirtszelle wird verletzt, mit eventuellem Verlust der Lebensfähigkeit.

Während der Parasitierung des Picornavirus werden mehrere zelluläre Wirtsprozesse verändert. Das Virusprotein 2Apro spaltet direkt den eukaryotischen Initiationsfaktor 4 Gamma (eIF4G). Die Spaltung dieses Translationsinitiationsfaktors hebt nicht nur die cap-abhängige mRNA-Translation auf (19); Es wird angenommen, dass die Spaltprodukte die Translation von nicht verkappter mRNA stimulieren, wie das nichtzelluläre Picornavirus-Genom (43), das einen neuartigen internen Ribosomeneintrittsmechanismus verwendet, um die Proteintranslation zu beginnen (31, 76). Es wurde gezeigt, dass die Poliovirus-Proteine 2Apro und 3CPRO das TATA-bindende Protein spalten, wobei 3Cpro auch die Transkription der RNA-Polymerasen I, II und III abschaltet (11, 72, 74). Die Transkriptionsfaktoren TFIIIC (10), CREB (73) und Oct-1 (75) werden ebenfalls von 3Cpro während einer Picornavirus-Infektion gespalten. Es wurde gezeigt, dass CVB3-Protein 2B das endoplasmatische Retikulum und die Plasmamembranpermeabilität modifiziert (14), was zu einer Erhöhung der cytosolischen Konzentration an freiem Calcium führt (28, 67) und Membranläsionen, die die Freisetzung viraler Nachkommen erleichtern können. Ionengradienten kollabieren (40, 52) und die Phospholipaseaktivität wird verändert (24, 29). Eine CVB3-Infektion von HeLa-Zellen führt zu einer Tyrosinphosphorylierung von zwei zellulären Proteinen bei 4 h nach der Infektion, und die Hemmung dieser Phosphorylierungen reduziert die virale Nachkommensproduktion signifikant (27). Es ist klar, dass Infektion ein dynamischer zellulärer Prozess ist, bei dem rechtzeitige Wechselwirkungen zwischen Virus- und Wirtsproteinen das Ergebnis sowohl für das Virus als auch für die Wirtszellen bestimmen.Es ist jetzt klar, dass Cysteinproteasen in der Caspase-Familie von Enzymen Schlüsseleffektormoleküle beim apoptotischen Zelltod sind. Einmal aktiviert, spalten Caspasen spezifische Substrate, einschließlich Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) (35), DNA-Fragmentierungsfaktor (DFF) (37), Gelsolin (34), Lamin A (58), Sterin regulatorische Element-bindende Proteine (68), α-Fodrin (12, 66), fokale Adhäsionskinase (71) und mdm2 (18), unter vielen anderen. Solche Spaltungsereignisse führen zu wichtigen Veränderungen normaler homöostatischer zellulärer Prozesse und entsprechenden zellmorphologisch-strukturellen Veränderungen.Viele Viren besitzen biochemische Mechanismen, um Apoptose in Zellen, in denen sie sich befinden, zu umgehen und / oder zu induzieren (für Reviews siehe Referenzen49 und 60). Verschiedene Viren interagieren in verschiedenen Stadien des apoptotischen Todesweges. Viren haben Strategien entwickelt, die auf den Fas-Liganden-Fas oder den Tumornekrosefaktor alpha (TNF–α) -TNF-Rezeptor-Signalkomplex, die Bcl-2-Familie von Regulatoren oder die Caspase-Familie von Henkern abzielen (49, 60). Die Mechanismen des Todes von CVB3-infizierten Zellen müssen noch bestimmt werden; es gibt jedoch begrenzte morphologische Hinweise auf die Induktion von Apoptose in Picornavirus-infizierten Zellen. Beweise, die mit dem murinen Enzephalitis-Virus von Theiler (32, 65) und dem Poliovirus (63) erhalten wurden, haben gezeigt, dass Picornavirus-infizierte Zellen Apoptose erfahren, basierend auf morphologischen Kriterien einschließlich Kernkondensation und DNA-Fragmentierung.

Um festzustellen, ob Caspasen aktiviert sind und für das nach einer CVB3-Infektion beobachtete CPE verantwortlich sind, wurden HeLa-Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, Md.) wurden entweder bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 5 mit CVB3 infiziert (großzügig zur Verfügung gestellt von Charles Gauntt, University of Texas Health Sciences Center, San Antonio) oder Schein behandelt mit Minimum Essential Medium (MEM) ohne fetales Rinderserum (FBS) für 45 min. Die Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und anschließend ein vollständiges MEM mit 10% FBS substituiert. Eine positive Apoptosekontrolle bestand aus HeLa-Zellen, die mit dem Photosensibilisator Benzoporphyrinderivat Monoacid Ring A (BPD-MA) für 1 h behandelt und dann wie zuvor beschrieben sichtbarem Licht ausgesetzt wurden (22, 23). Kulturen wurden untersucht und geerntet 0, 1, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, und 12 h Postinfektion. Die Zellen wurden zweimal in kaltem PBS gewaschen und in 1 ml Lysepuffer (20 mm Tris, 137 mM NaCl, 10% Glycerin, 1% Nonidet P-40, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0,15 U Aprotinin pro ml) pro 75 cm2 Kulturfläche lysiert. Nach einer 20-minütigen Inkubation auf Eis wurden die Überstände nach Zentrifugation bei 10.000 ×g gesammelt und bei -20°C für weitere biochemische Analysen gelagert.

Das zeitliche Muster der Produktion von CVB3-Virusproteinen, das Nachkommenvirus und die Entwicklung degenerativer morphologischer Veränderungen von HeLa-Zellen wurden in Verbindung mit einer Untersuchung von Wirtszell-Todproteinen betrachtet. Zelllysatproben wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt. Proteine wurden auf Nitrocellulose (Hybond ECL nitrocellulose membranes; Amersham) übertragen. Die Membranen wurden 1 h bei Raumtemperatur in Blockierpuffer (PBS mit 0,1% Tween 20 und 5% fettfreier Milchpulver) inkubiert. Nach zwei Waschungen im Waschpuffer (PBS mit 0.1% Tween 20) wurden die Membranen mit Antikörper gegen CVB3 (rabbit polyclonal anti-CVB3, 1:1000; Accurate Chemicals) inkubiert. Die Membranen wurden dreimal in Waschpuffer gewaschen und mit einem Esel-Anti-Kaninchen-Immunglobulin-Sekundärantikörper (Amersham) inkubiert. Die Membranen wurden dreimal gewaschen, und die Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Immunglobuline wurden durch die verbesserte Chemilumineszenzmethode (ECL, Amersham) nachgewiesen und einem Hyperfilm (Amersham) -Autoradiographiefilm ausgesetzt. Signifikante Erhöhungen der viralen Proteinsynthese konnten zwischen 3 und 5 h nach der Infektion nachgewiesen werden (Abb.1B). Die viralen Proteasen spalten virale sowie Wirtsproteine früh nach der Infektion. Durch Immunoblot-Analyse mit Maus-monoklonalem Anti-eIF4G (1:1000; Transduction Laboratories) wurde festgestellt, dass eIF4G durch die virale Protease 2A ab 1 h nach der Infektion gespalten wird, wobei der Nachweis des 220-kDa-Proteins nach 5 h nach der Infektion weiter verloren geht (Abb. 1C). Die Menge an CVB3 im Zellüberstand (freigesetztes Virus) wurde an Monoschichten von HeLa-Zellen nach dem Agar-Overlay-Plaque-Assay-Verfahren wie zuvor beschrieben bestimmt (3). Kurz wurde der Probenüberstand seriell 10-fach verdünnt, die Verdünnungen wurden auf 90 bis 95% konfluenten Monoschichten von HeLa-Zellen in Sechs-Well-Platten (Costar) überlagert und die überlagerten Zellen wurden für 1 h inkubiert (5% CO2, 37 °C). Medium, das nicht gebundenes Virus enthielt, wurde entfernt, und warmes vollständiges MEM, das 0,75% Agar enthielt, wurde in jeder Vertiefung überlagert. Die Platten wurden 36 bis 48 h inkubiert (5% CO2, 37°C), mit Carnoys Fixiermittel (95% Ethanol–Essigsäure) fixiert und mit 1% Kristallviolett angefärbt. Das Nachkommenvirus war im Überstand zwischen 1 und 5 h auf Basalspiegel vorhanden. Nach 6 h Nachinfektion gab es einen nachweisbaren Anstieg der Virusüberstände, und die exponentielle Virusproduktion begann nach 9 h Nachinfektion, wie durch Plaque-Assays bestimmt (Abb. 1A). HeLa-Zellen zeigten deutliche Veränderungen in der Morphologie, einschließlich zellulärer Kondensation, Aufrundung und Freisetzung aus der Kulturmonoschicht, zwischen 6 und 7 h nach der Infektion, wie durch Kontrastmikroskopie festgestellt (Abb. 1D).

Um festzustellen, ob die Wirtszell-Todesmaschinerie nach einer CVB3-Infektion aktiviert ist, wurde eine Immunoblot-Analyse von Lysat durchgeführt, das zu bestimmten Zeitpunkten gesammelt wurde. Caspase 3, das in Zellen als Vorläuferprotein mit einer Molekülmasse von 32 kDa vorliegt, ist ein primäres Molekül, das an der Ausführung des Zelltods beteiligt ist. Mit monoklonaler Maus-Anti-Caspase 3 (1:1.000; Transduction Laboratories) wurde festgestellt, dass nicht infizierte Zellen das 32-kDa-Vorläuferprotein enthielten. Nach einer CVB3-Infektion begann der Spiegel des 32-kDa-Vorläuferproteins zwischen 7 und 8 h nach der Infektion abzunehmen und war bis 12 h nach der Infektion fast vollständig nicht nachweisbar (Abb.2). Um festzustellen, ob die abgereicherte Pro-Caspase 3 proteolytisch von einem einkettigen Zymogen zu seinem aktiven zweikettigen Enzym verarbeitet worden war, wurden HeLa-Zelllysate wie zuvor beschrieben mit Caspase 3-Fluoreszenzsubstraten inkubiert (23). Kurzzeitig wurden zelluläre Lysate mit Reaktionspuffer (20 mM Tris, 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% Glycerin) enthaltend 100 µM Caspase 3 Substrat Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp–7-amino-4-methylcumarin (Ac-DEVD-AMC) inkubiert (Calbiochem, Cambridge, Mass.) oder Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluormethylcumarin (Z-DEVD-AFC) (Enzyme Systems Products, Livermore, Calif.). Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei 37°C inkubiert und die Fluoreszenzanregung von AMC bzw. AFC bei 380 bzw. 400 nm wurde bei 460 bzw. 505 nm mit einem Cytofluorometer CytoFluor 2350 (Perseptive Biosystems, Burlington, Ontario, Kanada) gemessen. Mit diesem Ansatz wurde die Caspase 3-Aktivität durch 5 h Postinfektion nachgewiesen. Der Anstieg der Caspase 3-Aktivität von 7 auf 10 h nach der Infektion, wenn das maximale Aktivierungsniveau erreicht war, wurde bis 12 h nach der Infektion aufrechterhalten (Abb. 2). Dieser Protease-Assay zeigte, dass Caspase 3 in infizierten Zellen in aktiver Form vorliegt und andere Caspasen und Substrate proteolytisch verarbeiten kann.

Caspase 3 spaltet spezifische Substrate an Asparaginsäureresten (42). PARP, ein Kernprotein, das an der DNA-Reparatur beteiligt ist (13, 69), hat sich als Substrat für aktivierte Caspase 3 sowie andere Caspasen erwiesen (35). In apoptotischen Zellen wird PARP von einem 116-kDa-Protein gespalten, wobei Fragmente von 85 und 25 kDa erhalten werden, die mit Antikörpern für die Amino- bzw. In CVB3-infizierten HeLa-Zellen war der PARP-Abbau mit dem Auftreten eines 85-kDa-Fragments 9 h nach der Infektion nachweisbar, wobei die Spiegel des 116-kDa-Peptids 10 und 12 h nach der Infektion weiter reduziert wurden, wie durch Immunoblot-Analyse mit monoklonalem Maus-Anti-PARP (1: 2.000; Biomol) bestimmt (Abb. 3).

DFF ist ein cytosolisches Protein, das durch Caspase 3 gespalten werden kann (37). Nach der Spaltung setzt dieses Protein eine Endonuklease frei, die in den Zellkern wandert, wo es DNA an internukleosomalen Stellen spalten kann, was zu einer DNA-Fragmentierung führt (16). Es wurde bereits gezeigt, dass der internukleosomale DNA-Abbau ein zelluläres Merkmal der Picornavirus-Infektion ist (32). Wie unter Verwendung von polyklonalem Anti-DFF von Kaninchen bestimmt (großzügig bereitgestellt von Xiaodong Wang, University of Texas Southwestern Medical School, Dallas), wird DFF von einem 45-kDa-Protein gespalten, wobei ab 9 h nach der Infektion ein 30-kDa-Fragment erzeugt wird, wobei die Verarbeitung und der Verlust des 45-kDa-Proteins zwischen 10 und 12 h nach der Infektion fortgesetzt werden (Abb. 3).

Um festzustellen, ob Caspasen das charakteristische CPE, das nach einer Picornavirus-Infektion auftritt, direkt produzieren oder nach den morphologischen Veränderungen aktiviert werden, wurden Zellen mit dem allgemeinen Caspaseinhibitor Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluormethylketon (ZVAD.fmk). Eine Stammlösung (100 mM in Dimethylsulfoxid) von ZVAD.fmk (Bachem) wurde in vollständigem MEM auf Konzentrationen im Bereich von 0 bis 200 µM verdünnt und die Verdünnungen wurden vor der Infektion oder Lichtbehandlung 30 min mit Zellen inkubiert. Nach CVB3-Infektion wurden die Zellen mit PBS und vollständigem MEM mit 10% FBS und frischem ZVAD gewaschen.anschließend wurde fmk (0 bis 200 µM) substituiert. Es wurde gezeigt, dass dieses Peptid die Induktion morphologischer Veränderungen durch mehrere apoptotische Stimuli hemmt (46, 54). ZVAD.fmk in Konzentrationen von 50, 100 und 200 µM blockierte sowohl die Caspase-Aktivität als auch die Spaltung von PARP und DFF in BPD-MA- und lichtbehandelten HeLa-Zellen (Positivkontrolle für Apoptose) (Abb. 4). In CVB3-infizierten HeLa-Zellen wurde die Spaltung von PARP und DFF durch den Inhibitor bei Konzentrationen von 50 und 100 µM teilweise verhindert (Abb. 4). Bei der höchsten Konzentration des Inhibitors (200 µM) gab es 10 h nach der Infektion keine Hinweise auf PARP- oder DFF-Spaltfragmente in CVB3-behandelten Zellen. Die Caspasespaltung von Strukturproteinen wie Aktin, Gelsolin, Lamin B und fokaler Adhäsionskinase ist für die morphologischen Veränderungen verantwortlich, die nach der Induktion der Apoptose beobachtet werden (42, 45). Bei 2 h nach Photoaktivierung von BPD-MA wurden HeLa-Zellen kondensiert, hatten ein ausgedehntes Membran-Blebbing und lösten sich aus der Monoschicht (Fig.5). Bei steigenden Konzentrationen von ZVAD.fmk war dieser apoptotische Phänotyp nicht ersichtlich, wobei die Zellen eine ähnliche Morphologie wie die Kontrollzellen beibehielten (Abb. 5). CVB3-infizierte HeLa-Zellen wurden kondensiert und aus der Monoschicht freigesetzt, zeigten jedoch nach 10 h nach Infektion kein Membran-Blebbing (Abb. 5). Blockade der Caspase-Aktivität durch ZVAD.fmk bei Konzentrationen bis zu 200 µM veränderte den zytopathischen Phänotyp nicht, obwohl die Spaltung von Substraten (DFF und PARP) gehemmt war.

Ein klassisches Merkmal von Viren der Familie Picornaviridae ist das zelluläre CPE nach einer Infektion. Seit der Entdeckung einer extraneuralen Zellkulturtechnik zur Vermehrung des Poliovirus (17) wurden degenerative Veränderungen der Zellmorphologie festgestellt. Zuerst beschrieben von Robbins et al. (48) 1950 umfassen diese zytopathischen Veränderungen Kernschrumpfung, Kondensation von Chromatin, Zellrundung und Freisetzung aus der Monoschicht mit eventuellem Fortschreiten zum acidophilen Zytoplasma, Kernpyknose und Fragmentierung des Kernchromatins (Karyorrhexis) (47).

Das jüngste Verständnis der Zelltodmechanismen schafft die Voraussetzungen für die Untersuchung von Wirtszell-Todproteinen und ihrer möglichen Rolle bei der CPE von CVB3-Infektionen. Viele Viren hemmen oder aktivieren den Zelltod, Strategien, die charakteristische Aspekte von Zellverletzungen, Entzündungsreaktionen oder viraler Persistenz vermitteln. Wie oben erwähnt, haben frühere Picornavirus-Studien die morphologischen Merkmale des apoptotischen Zelltods aufgedeckt, einschließlich Zellschrumpfung, DNA-Fragmentierung und Kernkondensation (21, 32, 47).

Caspase 3, eine Cysteinprotease mit Homologie zum Caenorhabditis elegans-Protein Ced-3 (77), gilt als eines der Schlüsselproteine, die an der Ausführungsphase des Zelltods beteiligt sind. Apoptose, die durch mehrere Stimuli induziert wird, einschließlich Fas, TNF, Etoposid, Staurosporin, photodynamische Therapie, ionisierende Strahlung und Entzug des Wachstumsfaktors, beinhaltet die Verarbeitung von Pro-Caspase 3 und die anschließende Aktivierung (15, 23, 30, 33, 51). Ab 7 bis 8 h nach der Infektion mit CVB3 ist Pro-Caspase 3 abgereichert, und Caspase-Aktivierungstests haben gezeigt, dass dieses Protein in seine aktive Form gespalten wird. Mehrere Proteine können Caspase 3 aktivieren, darunter Caspase 8 (über die Signalisierung durch TNF- oder Fas-Rezeptoren) (55), Granzym B aus zytotoxischen Lymphozyten (62) und Caspase 9 (über die Freisetzung von mitochondrialem Cytochrom c und den Aufbau apoptotischer Proteaseaktivierungsfaktoren) (36). Einmal aktiviert, kann Caspase 3 spezifische Substrate abbauen, was wiederum zu strukturellen Veränderungen und zum Verlust der homöostatischen Regulation zellulärer Prozesse führt. Es wurde gezeigt, dass zahlreiche Proteine durch aktivierte Caspasen gespalten werden. In Übereinstimmung mit der Aktivierung von Caspase 3 werden sowohl PARP als auch DFF nach einer CVB3-Infektion gespalten. Caspase-Aktivierung und DNA-Fragmentierung sind direkt durch die Spaltung von DFF verbunden (37). DFF ist ein humaner cytosolischer Faktor, der aus zwei Untereinheiten von 45 und 40 kDa besteht, von denen die größere durch Caspase 3 in kleinere Polypeptide abgebaut wird. In neueren Studien von Enari et al. (16) unter Verwendung von murinen Lymphomzellen wurde eine Endonuklease, Caspase-aktivierte DNase (CAD), isoliert. Das murine Äquivalent des DFF-Proteins wurde isoliert und als Inhibitor von CAD bezeichnet (50). Caspase 3 Spaltung von Inhibitor von CAD (DFF) ermöglicht CAD nukleare Translokation und DNA-Abbau. DFF wird ab 9 h nach der Infektion gespalten, was zu einem 30-kDa-Fragment führt (Abb. 3), das zu einem 11-kDa-Fragment (37) weiterverarbeitet werden kann. PARP befindet sich im Zellkern und ist an der DNA-Reparatur beteiligt. Die Spaltung von PARP beginnt bei 9 h nach der Infektion, was darauf hindeutet, dass Caspasen, sobald sie im Cytosol aktiviert sind, auf kernlokalisierte Substrate zugreifen können.

Bemerkenswert ist die Caspaseinhibierung mit dem allgemeinen Caspaseinhibitor ZVAD.fmk verhinderte das durch CVB3 induzierte CPE nach einer Infektion nicht. Zwischen 6 und 7 h nach der Infektion wurde das CPE durch Kontrastmikroskopie in unserem CVB3-Infektionsmodell sichtbar. Die Zeit zwischen Infektion und Auftreten des CPE, wie durch Kontrastmikroskopie beobachtet, war bei ZVAD konsistent.fmk-Konzentrationen von 50 bis 200 µM. Neben nicht die Zeit zu beeinflussen, um CPE, ZVAD.die fmk-Behandlung führte zu Zellen mit einem morphologischen Erscheinungsbild ähnlich dem von unbehandelten, infizierten Zellen (Abb. 5). Wir verwendeten die Behandlung mit BPD-MA und Licht als alternative Methode zur Induktion von Apoptose in HeLa-Zellen (22, 23). Hemmung der Caspase-Aktivierung mit dem Inhibitor ZVAD.fmk verhinderte den apoptotischen Phänotyp (Abb. 5). Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass die Caspase-Aktivität und die Spaltung von Substraten nicht für das charakteristische CPE verantwortlich sind, das mit einer Picornavirus-Infektion assoziiert ist, sondern im Anschluss an die morphologischen Veränderungen aktiviert werden.

Der Schnittpunkt des viralen Replikationszyklus und der Aktivierung des Wirtszell-Todesweges muss noch bestimmt werden. Eine Picornavirus-Infektion führt bald zu einer Hemmung der zellulären RNA- und Proteinsynthese (19, 74). Frühe Studien zu Beziehungen zwischen Picornavirus-induzierten Stoffwechselveränderungen und virusinduziertem CPE zeigten, dass die Hemmung der Protein- und RNA-Synthese nicht direkt mit zellmorphologischen Veränderungen zusammenhängt (4). Protein- und RNA-Synthese-Inhibitoren verzögerten den Zelltod, aber die Zellen zeigten weniger morphologische Veränderungen als Picornavirus-infizierte Zellen (5). Die Hemmung der Protein- und RNA-Synthese mit einem von mehreren Wirkstoffen wie Actinomycin D, Puromycin und Diphtherietoxin führt zu Apoptose (39). Frühe Studien an Poliovirus-Infektionssystemen zeigten, dass Puromycin, ein Inhibitor der Translation von viralen und Wirtsproteinen, den Beginn zytopathischer Veränderungen verzögert, was darauf hindeutet, dass bestimmte virale Proteine direkt zytotoxisch sein können (4). Eine Erhöhung des MOI führt zu einem schnelleren Einsetzen von CPE (unveröffentlichte Beobachtungen), obwohl fast die gesamte Wirtsproteintranslation innerhalb von 3 h bei einem relativ niedrigen MOI (25), wie in dieser Studie verwendet, abgeschaltet wird (MOI = 5). Kürzlich wurde gezeigt, dass das von Coxsackievirus und Poliovirus codierte 2B-Protein mit Zellmembranfraktionen, einschließlich des Plasmalemms und des endoplasmatischen Retikulums, assoziiert ist und die Ionenbewegung einschließlich der Bewegung von Ca2 + zum Cytosol stört (1, 67). Ca2 + -Zustrom tritt bei Apoptose auf (7, 44), aber es ist nicht klar, ob der Zustrom vor oder nach Caspase-Aktivierung auftritt. Durch Untersuchung des Ionenbedarfs von Caspasen wurde festgestellt, dass die Calciumionenkonzentration wenig Einfluss auf die Caspaseaktivität hat (56). Ein früher Calciumeinfluss nach einer Coxsackievirus-Infektion könnte aus dem Einfluss des 2B-Proteins auf die Membranpermeabilität resultieren, und der festgestellte große späte Calciumeinfluss (>6 h Postinfektion) (67) könnte ein nachgeschalteter Effekt der Caspase-Aktivierung sein.

In den frühen Phasen der Infektion wäre es vorteilhaft, wenn das Virus den Tod der Wirtszellen hemmt und dadurch eine maximale Produktion viraler Nachkommen ermöglicht. In späten Stadien des viralen Lebenszyklus wäre es auch vorteilhaft, wenn das Virus eher Apoptose als Nekrose induziert. Ein solcher Todesmechanismus ist ein potenzielles Mittel zur Umgehung des Wirtsimmunsystems durch das Virus während seiner Freisetzung in das umgebende Gewebe. Die Apoptose ist durch die schnelle Phagozytose betroffener Zellen ohne Freisetzung proinflammatorischer Zytokine gekennzeichnet (53).Es wurde gezeigt, dass Viren auf verschiedenen Ebenen des apoptotischen Weges interagieren. Mehrere Gammaherpesviren (einschließlich des Kaposi-Sarkom-assoziierten humanen Herpesvirus 8) sowie das tumorigene Molluscum contagiosum-Virus enthalten FLICE-inhibitorische Proteine, die mit dem Fas-Adapterprotein FADD interagieren und konkurrieren, um die Rekrutierung von Caspase 8 und die anschließende Aktivierung zu hemmen (61). Die Expression des Kuhpockenvirus serpin CrmA blockiert die Caspase 8-vermittelte Aktivierung von Downstream-Caspasen wie Caspase 1 und Caspase 3 (55). Die IAP-Proteine (für Inhibitoren der Apoptose) bilden eine Familie von Proteinen, die von Baculoviren exprimiert werden und die durch Virusinfektion oder durch Caspase 1 induzierte Apoptose blockieren (78). Darüber hinaus wurden mehrere virale Homologe der Bcl-2-Proteinfamilie entdeckt (2, 8, 20, 70). Adenovirus (9, 20, 57), Afrikanisches Schweinepestvirus (41) und Epstein-Barr-Virus (26, 41, 59) kodieren Proteine (E1B-19K, LMWS-HL bzw. BHRF1), die eine Sequenzhomologie zu überlebensfördernden Genen der Bcl-2-Familie aufweisen.

Die Identifizierung viraler Proteine, die direkt Apoptose induzieren, ist nicht so umfassend dokumentiert wie die von viralen Proteinen, die den Zelltod hemmen. Die Lentiviren Human Immunodeficiency Virus und Human T-cell leukemia Virus Typ 1 kodieren die Transkriptionsregulatoren Tat und Tax, von denen gezeigt wurde, dass sie die Expression des Fas-Liganden erhöhen und gleichzeitig die Expression von Bcl-2-Familienmitgliedern verringern (79, 80). Die humanen Adenovirus-kodierten E1A-, E3- und E4-Genprodukte verursachen nach Expression in Zellkultur den Zelltod. Die Adenovirus-todesinduzierenden Gene werden spät im Infektionszyklus exprimiert und überwältigen letztendlich die Virus-codierten todesinhibierenden Gene (38).

Unsere Daten zeigen, dass die Aktivierung von Caspase 3 eher auf CVB3-induzierte degenerative morphologische Veränderungen in infizierten HeLa-Zellen folgt als ihnen vorausgeht. Aktivierte Caspasen verarbeiten spezifische Substrate, einschließlich PARP und DFF. Die Hemmung der Caspase-Aktivität beseitigt jedoch nicht das morphologische Erscheinungsbild (CPE) von virusinfizierten Zellen, wie durch Kontrastmikroskopie bestimmt. Die Caspase-Verarbeitung und -Spaltung von Substraten kann für die endgültige Veränderung normaler homöostatischer Prozesse in infizierten Zellen wichtig sein und die endgültige Clearance von virusinfizierten Zellen erleichtern. Die viralen Proteasen 2A, 3C und 3CD können spezifische Strukturproteine spalten, was zu morphologischen Veränderungen führt, die mit CPE übereinstimmen, und zwar analog zur Wirkung von Caspasen, die separate Substrate spalten, um einen eindeutigen apoptotischen Phänotyp zu erreichen.

• Copyright © 1998 Amerikanische Gesellschaft für Mikrobiologie