Studiendesign

VX-765-Studie: Fünf Monate alte Vehikel-injizierte WT (WT + Vehikel; n = 18) und J20-Mäuse (J20 + Vehikel: n = 14) und VX-765-injizierte J20-Mäuse (WT + Vehikel; n = J20 + VX-765: n = 13) Mäuse wurden zu fünf verschiedenen Zeitpunkten longitudinal beurteilt: Baseline vor der Behandlung (Baseline unbehandelte J20 wurden zusammen gruppiert; n = 19), nach drei IP-Injektionen pro Woche von VX-765 oder Vehikel (Behandlung 1), nach sechs zusätzlichen Injektionen über 2 Wochen (Behandlung 2), nach 4-wöchiger Auswaschperiode (WO) und nach weiteren drei Injektionen in 1 Woche (Behandlung 3) (Abb. 1a). Alle getesteten Tiere wurden in die Analysen einbezogen, es sei denn, (a) das Tier starb während des Experiments oder (b) das Tier reagierte nicht verhaltensmäßig. Insgesamt 25 Würfe, verteilt auf vier verschiedene Kohorten und zu unterschiedlichen Zeiten getestet, wurden verwendet. Drei dieser Kohorten wurden NOR- und Open-Field-Tests unterzogen, während Kohorte 4 für Barnes Maze verwendet wurde. Nachdem die Tiere zu Studienbeginn getestet wurden, um zu bestätigen, dass die J20-Tiere verhaltensauffällig waren, wurden die J20-Tiere unabhängig von der Verhaltensleistung randomisiert entweder Vehikel- oder VX-765-Behandlung zugewiesen. Von allen verwendeten Tieren zeigten vier J20-Mäuse zu Beginn des Experiments keine Verhaltensdefizite und wurden nicht verwendet. Zwei J20 + -Fahrzeugmäuse bewegten sich während des Experiments überhaupt nicht und ihre Verhaltensdaten wurden ausgeschlossen; diese Tiere wurden jedoch gehalten und weiterhin für die postmortale Analyse verwendet.

Casp1-Validierungsstudie: Um Casp1-spezifische Effekte von VX−765 zu validieren, wurden J20−Mäuse auf einem Casp1-/- Hintergrund erzeugt. Es wurden dreiundsiebzig Mäuse verwendet (n = 12-13 pro Genotyp, sechs verschiedene Genotypen), die alle durch In-vitro-Fertilisation (IVF) von 35 Spenderweibchen gezüchtet wurden. Zuchtdetails sind im Abschnitt Tierversuche unten beschrieben. Alle Mäuse wurden im Alter zwischen 7 und 8 Monaten verhaltensbeurteilt, und keine Tiere wurden von dieser Studie ausgeschlossen.

Alle Mäuse wurden im Alter von 8 Monaten getötet und verarbeitet. Die Verhaltensbewertung war für den Mausgenotyp und die Behandlung verblindet, und alle Tiere wurden entweder für biochemische oder histologische Analysen randomisiert und blind analysiert.

VX-765, VRT-043198 IC50-Assays zu rekombinanten Caspasen

Tierstudien

Alle Tierversuche folgten den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und wurden vom McGill University Animal Care Committee genehmigt. Die transgene Mauslinie J20 (JAX Stock No. 006293, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, USA) exprimiert die schwedischen (670/671KM→NL) und Indiana (717V→F) humanen APP Mutationen unter dem PDGF-ßpromoter. Männliche J20-Mäuse wurden als Züchter verwendet und ihr Sperma wurde für die IVF-Kolonieerweiterung verwendet.

Die Genotypen wurden mittels Schwanzbiopsie und RT-PCR bestimmt. Mäuse wurden in Gruppen (2-4 Tiere pro Käfig) in Standard-Makrolon-Käfigen unter einem 12-h-Reverse-Hell / Dunkel-Zyklus und kontrollierten Umweltbedingungen untergebracht. Nahrung und Wasser standen ad libitum zur Verfügung.

VX-765 (Adooq Bioscience, Irvine, CA) wurde in 20% Cremophor in dH2O (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Kanada) gelöst und intraperitoneal verabreicht. Vehikelbehandelte J20- und WT-Mäuse erhielten nur Cremophor.

Analyse der Permeabilität der Blut–Hirn-Schranke

Fünf Monate alte J20- und WT-Mäuse wurden mit Isofluran anästhesiert und die rechte Halsschlagader abgetrennt. Ein kleiner Einschnitt wurde entlang der Halsschlagaderwand gemacht und ein Mikrokatheter wurde in den Eingang der A. carotis interna eingeführt. Der Katheter wurde mit Nahtfaden gesichert. VX−765 (50 mg kg−1) wurde bei 50 µl min-1 (90-120 µl Gesamtvolumen) infundiert. Der Mikrokatheter wurde weitere 5 Minuten belassen, um eine Diffusion zu ermöglichen, wonach Blut durch intrakardiale Punktion gesammelt wurde. Die Maus wurde transkardial mit eiskalter Kochsalzlösung perfundiert und der Hippocampus und der Kortex wurden herausgeschnitten. Die Proben wurden zur Flüssigchromatographie- und Tandem-Massenspektrometrieanalyse an die Biopharmacy Platform (Université de Montreal) geschickt.

Verhaltensanalyse

Offenes Feld: die lokomotorische Aktivität wurde mit einem automatisierten HVS2100-Tracking-System (HVS Image, Hamptom, UK) gemessen. Die Mäuse wurden in die offene Feldkammer (40 × 40 cm Plexiglaskasten, keine Decke und weißer Boden) gebracht und 5 Minuten lang erkunden gelassen.

Novel object Recognition (NOR): Mäuse wurden in der Freifeldkammer 5 min lang zwei identischen Objekten vorbelichtet. Zwei Stunden nach der Vorbelichtung wurden Mäuse wieder in die Kammer gebracht und einem bekannten Objekt und einem neuartigen Objekt für 5 min ausgesetzt. Mäuse wurden in verschiedenen Testsitzungen nur einmal einem bestimmten Objekt ausgesetzt, und die Platzierung neuartiger Objekte wurde innerhalb jeder Behandlungsgruppe ausgeglichen. Prozentuale Berührungen des neuartigen Objekts während der Testphase und Diskriminierungsindex ((# Berührungen neu − # Berührungen vertraut) / Gesamtberührungen) wurden bewertet.

Barnes Maze: Die Barnes Maze-Plattform (91 cm Durchmesser, 90 cm über dem Boden erhöht) bestand aus 20 Löchern (jeweils 5 cm Durchmesser). Alle Löcher waren blockiert, bis auf ein Zielloch, das zu einer versenkten Fluchtbox führte. Räumliche Hinweise, helles Licht und weißes Rauschen wurden verwendet, um die Mäuse zu motivieren, die Flucht während jeder Sitzung zu finden. Für die Anpassungsphase erkundete jede Maus die Plattform für 60 s. Jede Maus, die die Escape-Box nicht fand, wurde zu ihr geführt und blieb dort für 90 s. Für die Akquisitionsphase folgte jede Studie dem gleichen Protokoll, mit dem Ziel, jede Maus zu trainieren, das Ziel zu finden und die Escape-Box innerhalb von 180 s zu betreten. Mäuse blieben weitere 60 s in der Box. Vier Versuche pro Tag im Abstand von etwa 15 Minuten wurden an 4 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Im Sondentest (Tag 5) führte jede Maus eine 90 s-Studie durch. Das Ziel befand sich immer noch an derselben Position, aber die Fluchtbox wurde blockiert. Die Latenz und Fehler, um das Ziel zu erreichen, sowie die Anzahl der Mausstöße zu jedem der Löcher (Zielpräferenz) wurden gemessen. Das Y-Labyrinth bestand aus einem symmetrischen Y-förmigen Labyrinth mit drei Armen, die 120 ° voneinander entfernt waren und mit A, B und C bezeichnet wurden. Gesamtarmeinträge und spontaner Wechsel, definiert als aufeinanderfolgende Einträge in drei verschiedenen Armen, wurden aufgezeichnet. Prozentualer Wechsel wurde ermittelt.

Tissue processing

Für die Immunhistochemie wurden Mäuse (n = 4-6 pro Gruppe) mit Isofluoran anästhesiert und mit eiskalter Kochsalzlösung transkardial perfundiert, gefolgt von eiskaltem 4% Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Die Gehirne wurden in 10% neutral gepuffertem Formalin (Thermo Fisher Scientific, Mississauga, ON, Kanada) für 16 h nachfixiert und in 70% Ethanol überführt. Gehirne wurden in Paraffin eingebettet und bei 4 µm geschnitten.

Für Western Blot und ELISA (n = 4-8 pro Gruppe) wurden narkotisierte Mäuse zervikal disloziert, Hippocampus und Cortex herausgeschnitten und sofort auf Trockeneis eingefroren. Proteine wurden in 5× Volumen/Gewicht mit Radioimmunpräzipitationsassay (RIPA) Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,25% Na-Desoxycholat, 1 mM EDTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 Proteasen-Inhibitoren Cocktail (Sigma-Aldrich)) auf Eis mit einem Gewebehomogenisator (OMNI International, Kennesaw, GA, USA) extrahiert. Die Proben wurden 20 min lang zentrifugiert (20.000 × g, 4°C), der Überstand gewonnen und das Protein mit der BCA-Methode quantifiziert. Das RIPA-unlösliche Pellet wurde weiter in 70%iger Ameisensäure in dH2O extrahiert, eingedampft und in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5, gelöst.

Immunhistologische Färbung

Epitope wurden entweder in Citrat (10 mM Tris-Na Citrat, pH 6,0) oder EDTA (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9) demaskiert.0) Antigen-Retrieval-Puffer und immunbestimmt unter Verwendung des automatisierten Objektträgerprozessors Dako Autostainer Plus und des EnVision Flex-Systems (Dako, Burlington, ON, Kanada). Nach Deparaffinierung und Rehydratation wurden Abschnitte peroxidasebehandelt, in serumfreiem Proteinblock blockiert und mit den folgenden Antikörpern immunisiert, die in EnVision Flex-Antikörperverdünner verdünnt waren: 1: 2000 Kaninchen Anti-Iba1 (Wako 019-19741, Richmond, VA, USA), 1: 8000 Kaninchen Anti-GFAP (Dako Z-0334), 1: 2000 Kaninchen Anti-Aß1-40 (F25276, Labor entwickelt) und 1 :1000 Maus-Antisynaptophysin (Sigma-Aldrich S5768). Abschnitte wurden mit dem Kit-gelieferten geeigneten Maus- oder Kaninchen-HRP-konjugierten Sekundärantikörper behandelt und mit DAB visualisiert. Die Schnitte wurden hämatoxylingegengefärbt, dehydriert und mit Permount (Fisher Scientific) bedeckt. Die Schnitte wurden zur Analyse digital mit MIRAX SCAN gescannt (Zeiss, Don Mills, ON, Kanada). Nach Deparaffinierung und Rehydratation wurden Objektträger mit filtriertem 1%igem wässrigem Thioflavin-S (Sigma-Aldrich) angefärbt.

Quantitative immunhistologische Analyse

Iba1-positive Zellen im Cortex und im vorderen Teil der CA1-Region des Hippocampus wurden unter Verwendung einer modifizierten Version des arealen Zählrahmens quantifiziert48. Kurz gesagt, jede fünfte Folie wurde quantifiziert (was zu vier Abschnitten pro Gehirn führte). Mit dem MIRAX-SCAN wurden mehrere × 80-Bilder innerhalb des interessierenden Bereichs aufgenommen und die Anzahl der Iba1-positiven Zellen manuell gezählt. Die numerische Dichte (Anzahl der Zellen mm-3) in der vorderen CA1-Region und im Kortex wurde geschätzt. Eine Mindestanzahl von 150 Treffern pro Bereich war erforderlich, um eine zuverlässige Schätzung vorzunehmen. Zusätzliche Abschnitte wurden gezählt, wenn wir unsere Mindestanzahl nicht erreichen konnten. Die Quantifizierung wurde für die Behandlung und den Genotyp verblindet durchgeführt. ImageJ Software (NIH, Bethesda, MD, USA) wurde verwendet, um Aß-Akkumulation, GFAP und Synaptophysin immunopositive Färbung in der CA1-Region und Kortex zu messen. Es wurden vier Abschnitte pro Gehirn analysiert, und in jedem Abschnitt wurden mehrere Bilder aufgenommen, um die CA1-Region und den Kortex abzudecken. Die Schwelle wurde in allen Gehirnen gleichermaßen angepasst, um den gefärbten Bereich hervorzuheben, und die Partikel wurden analysiert, um die Gesamtfläche der Färbung zu bestimmen. Die Ergebnisse werden als gefärbte Gesamtfläche pro analysierter Gesamtfläche (µm2 mm−2) ausgedrückt. Repräsentative Bilder wurden nur beschnitten, um Größenbeschränkungen zu entsprechen, und keiner Nachbearbeitung unterzogen.

Western Blotting

Maus-Proteinproben (25-100 µg) wurden in Laemmli (5% 2-β−Mercaptoethanol, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml-1 Proteasen-Inhibitoren-Cocktail (Sigma-Aldrich)) hergestellt, 5 min gekocht und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) getrennt. Die Proben wurden mit den folgenden Primärantikörpern, verdünnt entweder in 5% fettfreier Trockenmilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 0,1% Tween-20 oder PBS-Blockierpuffer (Thermoscientific), untersucht: 1:1000 Maus Anti-human Aß1-16 (6E10) (BioLegend 803001, San Diego, CA, USA), 1:2000 kaninchen Anti-APP C-Terminus (Sigma-Aldrich A8717), 1:1000 Kaninchen Anti-Neprilysin (Abcam ab79423), 1:500 Kaninchen Anti-IDE (Abcam ab32216), 1:1000 Kaninchen Anti-Caspase-3 (Zellsignalisierung 9665), 1:1000 Maus antiaktive Caspase-8 (Zellsignalisierung 8592), 1:1000 Kaninchen Anti-Caspase- 9 (Cell Signaling 9504) und 1:5000 Maus-Anti-β-Aktin (Sigma-Aldrich A5441). Blots wurden mit 1:5000 HRP-verknüpften Anti-Maus (GE Amersham NA9310, Montreal, QC, CA) oder 1:5000 Anti-Kaninchen (Dako P0217) Sekundärantikörper gefolgt von ECL (GE Amersham) nachgewiesen. Immunreaktive Banden wurden mit dem ImageQuant LAS 4000 Imaging System (Fujifilm USA, Valhalla, NY, USA) visualisiert und densitometrische Analysen mit der Image Gauge Analysis Software (Fujifilm USA) durchgeführt. Helligkeit / Kontrast von Raw-Blots wurden mit der Adobe Photoshop CS5-Software (Adobe Systems, Ottawa, ON, CA) gleichmäßig über das gesamte Bild angepasst, um repräsentative Bilder zu erzeugen. Es wurden keine zusätzlichen Änderungen vorgenommen. CanvasTM X Software (Acd System, Plantation, FL, USA) wurde verwendet, um endgültige Zahlen zu erstellen. Rohblots für Western Blots sind in ergänzender Abbildung 11 verfügbar.

ELISA

Pro- und antiinflammatorische Zytokine und Aß-Spiegel im Mausgehirn wurden mit Elektrochemilumineszenz-Immunassay-Kits von Meso Scale Discovery (Rockville, MD, USA) bestimmt. Standards und Proben wurden nach den Protokollen des Herstellers vorbereitet und in zweifacher Ausfertigung ausgeführt. Das Ten-Plex Mouse Proinflammatory Panel wurde für Maus-Hippocampus und Kortikalis und Proben verwendet. Ein einzelner Il-1β-Kit wurde verwendet, um Mäuseplasma zu messen. Das Four-plex Human proinflammatory Panel wurde für HPN-Proben verwendet (siehe unten). Das Vier-Panel-Human-Aß-6E10-Kit wurde für Maus-Hippocampus- und Cortex- sowie HPN-Proben verwendet.

RNA-Extraktion und cDNA-Synthese

Die Gesamt-RNA wurde aus dem Hippocampus und dem Cortex der Maus (n = 3 pro Gruppe) mit Qiazol (Qiagen, Valencia, CA, USA) extrahiert, gefolgt von Homogenisierung mit einer 20-Gauge-Nadel. Das miRNeasy Mini Kit, einschließlich DNase-Behandlungsschritt auf der Säule, wurde zur Aufreinigung von Gesamt-RNA (Qiagen) verwendet. RNA-Qualität und -quantität wurden mit einem Spektralphotometer (DS-11 FX+, DeNovix, Wilmington, DE, USA) bestimmt. Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). Die Produkte wurden auf RedSafe (FroggaBio, North York, ON, Kanada) gefärbten 2% Agarosegelen visualisiert. Real-time PCR Experimente wurden mit SYBR Green Taq Mastermix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA) auf einer Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Maschine (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Die Genamplifikation wurde mit den folgenden Primern durchgeführt: (18s) 5′-GTAACCCGTTGAACCCAT-3′ und 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′; (IDE) 5′- ACTAACCTGGTGGTGAAG-3′ und 5′- GGTCTGGTATGGGAAATG-3′; (Neprilysin) 5′- TCTTGTAAGCAGCCTCAGCC-3′ und 5′- CTCCCCACAGCATTCTCCAT-3′. Die Ergebnisse werden als Faltungsinduktionswerte ausgedrückt, die mit der Pfaffl-Methode auf mittlere HPRT- und 18S-Referenzgene normalisiert wurden.

Maus synaptische plastizität RT2-Profiler PCR array

Die maus synaptische plastizität RT2 Profiler PCR Array (PAMM-126Z, Qiagen) profile die expression von 84 gene beteiligt in synaptischen veränderungen während lernen und speicher und fünf housekeeping gene (β-actin; β-2-microglobulin; glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase, GAPDH; β-glucuronidase, Gusb; Hitzeschockprotein 90 alpha (cytosolisch), Hsp90ab1) mit Echtzeit-PCR. Die Gesamt-RNA (465 ng für jede Probe) wurde nach dem Herstellerprotokoll (First Strang cDNA Synthesis Kit, Qiagen) reverse transkribiert (einschließlich eines genomischen DNA-Eliminationsschritts). Die Real-time PCR Reaktion wurde in einem Real-time Cycler ABI 7500 (Fast Block) (Applied Biosystems) unter Verwendung des RT2 SYBR Green/ROX PCR Master Mix (Qiagen) durchgeführt. Die Zyklusbedingungen waren wie folgt: 2 min bei 50 °C, 10 min bei 95 °C, 40 Zyklen, jeweils 15 s bei 95 °C und 1 min bei 60 °C. Schwellenwert und Baseline wurden manuell gemäß den Anweisungen des Herstellers eingestellt. Die Daten wurden auf das geometrische Mittel der fünf Housekeeping-Gene normalisiert und mit der vergleichenden Ct-Methode (2−ΔCT) analysiert.

Neuronale Zellkultur und axonaler Degenerationstest

Zwölf bis sechzehn Wochen altes fetales kortikales Gewebe wurde vom Birth Defects Research Laboratory (University of Washington, Seattle, USA) gemäß einem vom McGill Institutional Review Board genehmigten Protokoll erhalten. HPN wurden aus Gehirnen kultiviert, die mit Trypsin dissoziiert, mit Desoxyribonuklease I behandelt und durch 130, 70 und 30 µm Nylonnetz filtriert wurden21. Dissoziierte Zellen wurden für 10 min bei 300 × g zentrifugiert und in minimal essentiellem Medium (MEM) mit Earles Salzen resuspendiert und mit 5% dekomplementiertem BCS, 1× Penicillin-Streptomycin, 1 mM Natriumpyruvat und 2 mM l-Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ergänzt. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 3×106 Zellen ml−1 auf 5 µg mL−1 Poly-l-Lysin-beschichteten Six-Well-Gewebekulturplatten (Sigma-Aldrich) ausgesät. Das MEM-Medium wurde alle 2 Tage gewechselt und die Astrozytenproliferation war begrenzt mit Fluorodesoxyuridince (FdU) antimitotische Behandlung (1 mM, Sigma) für die ersten 4 Tage. Neuronale Kulturen wurden 7-10 Tage vor der Durchführung von Experimenten gezüchtet. Vier verschiedene Neuronenpräparate zu unterschiedlichen Zeiten wurden getestet. Eines der Neuronenpräparate war nicht stabil und die Kultur, einschließlich der Serum + Kontrolle, die kein Medikament erhielt, starb mitten im Experiment. Daher wurden drei verschiedene Neuronenpräparate von drei genetisch unterschiedlichen Spendern verwendet.Die Toxizität von VX-765 wurde mit 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) untersucht. Neuronen wurden mit 25-200 µM VX-765 oder 0,1% DMSO (höchste verwendete DMSO−Konzentration) für 72 h behandelt. Neuronen wurden dann mit 0,5 µg ml-1 MTT (Sigma-Aldrich) für 4 h bei 37 ° C (5% CO2) inkubiert. Die Formazankristalle wurden 30 min in 100 µl DMSO gelöst. Die Absorption wurde bei 560 und 670 nm mit dem Synergy H4 Plattenleser gemessen.Die axonale Degeneration wurde entweder durch APPWT-Transfektion oder durch Serumdeprivationsstress induziert. VX-765 wurde entweder als Vorbehandlungsstrategie (1 h vor Stressor) oder als Postbeading-Behandlungsstrategie (48 h nach Stressor) verabreicht. Neuronen wurden mit einer Genkanone (BioRad, Mississauga, ON, Kanada) mit Goldperlen transfiziert, die mit pBudCE41-eGFP zur Fluoreszenzvisualisierung beschichtet waren. Neuronen, die APPWT-gestresst waren, wurden mit pBudCE41-eGFP / APPWT transfiziert. Kurz gesagt, Neuronen wurden mit Medium behandelt, das mit 25 oder 50 µM VX-765, 5 µM Casp1-Inhibitor Z-YVAD-fmk oder DMSO ergänzt wurde. Fluoreszenzbilder wurden alle 24 h (bis zu 72 h Nachbehandlung) mit einem Nikon Eclipse Ti Mikroskop (Nikon, Mississauga, ON, CA) und Photometrics coolSNAP HQ2 CCD Kamera (Photometrics, Tucson, AZ, USA) unter Verwendung der NIS Elements AR 3.10 Software (Nikon). Das prozentuale neuronale Abperlen wurde gemessen, indem die Anzahl der abperlenden eGFP-positiven Neuronen über die Gesamtzahl der eGFP-positiven Neuronen zu jedem Zeitpunkt gezählt wurde. Für jeden Zustand wurden mindestens 150 eGFP-positive Neuronen gezählt. Konditioniertes Medium wurde beprobt (ergänzt mit 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF, 10 µl ml−1 Proteasen-Inhibitoren Cocktail (Sigma-Aldrich)), und Neuronen wurden in Zelllysepuffer (50 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 0,1 mM EDTA) zur Analyse geerntet.

Statistische Analysen

Die Anzahl der Tiere oder unabhängigen Experimente und die verwendeten statistischen Analysen (ANOVA und Post-hoc-Vergleiche) sind in den folgenden Abbildungen angegeben. Alle Werte werden als Mittelwert ± s.e.m. ausgedrückt, wobei die F- und p-Werte in der Abbildung unten angegeben sind. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) durchgeführt.