Diskussion

Die vorliegende Studie hat eine Rolle für das SR luminale Ca-bindende Protein CSQ2 bei der Regulierung der Erregungs–Kontraktions-Kopplung und der CICR im Herzen aufgedeckt. Insbesondere zeigen wir, dass die Ad-vermittelte Überexpression von CSQ2 die Größe sowohl der zellgemittelten ICa-induzierten Ca-Transienten als auch der spontanen Ca-Funken in isolierten Herzzellen dramatisch erhöhte. Die Analyse der ansteigenden Phase und Änderungsrate dieser Ca-Signale zeigte, dass ihre erhöhte Größe auf eine verlangsamte Beendigung der zugrunde liegenden Ca-Freisetzungsflüsse aus dem SR zurückzuführen war. Zusätzlich zur Verlängerung der aktiven Ca-Freisetzung wurde die Dynamik der funktionellen Wiederaufladung der SR-Ca-Speicher auch in Zellen mit erhöhten CSQ2-Proteinspiegeln verlangsamt, wie durch eine verlangsamte Erholungszeit für repetitive Ca-Speicher angezeigt. Wir erzielten im Wesentlichen die entgegengesetzten Ergebnisse in Myozyten, in denen CSQ2-Spiegel durch Ad-vermittelte Antisense-Transduktion reduziert wurden. Diese Myozyten zeigten eine kürzere Ca-Freisetzung, aber eine beschleunigte Restitution von Ca-Freisetzungsstellen. Darüber hinaus verursachte die Anwendung von Isoproterenol in periodisch stimulierten Myozyten mit verringerten CSQ2-Spiegeln arrhythmogene Oszillationen von intrazellulären . Diese Ergebnisse zeigen, dass CSQ2 eine Schlüsseldeterminante der SR-Ca-Freisetzungsfunktion ist, die die Ca-Freisetzungsdauer und die Feuerfestigkeit der Freisetzungsstelle regelt. Angesichts der beobachteten Isoproterenol-abhängigen Störungen des rhythmischen Ca-Kreislaufs in Myozyten, die CSQ2 unterexprimieren, sind unsere Ergebnisse relevant für das Verständnis der zellulären Mechanismen von Katecholamin-induzierten Arrhythmien, die mit Mutationen des CSQ2-Gens zusammenhängen.

Molekulare Mechanismen der CSQ2-Wirkung. Wir führen die beobachteten Effekte von CSQ2 auf die SR-Ca-Freisetzung auf die Fähigkeit dieses Proteins zurück, als molekularer Puffer zu fungieren, der das Freie im SR-Luminalraum steuert (siehe vorgeschlagenes Schema in Abb. 5). Aus Lipiddoppelschichtstudien ist bekannt, dass die Bindung von Ca an den luminalen Aspekt des RyR-Komplexes (d. H. Den luminalen Ca-Sensor) die Kanalaktivität erhöht, während bei erniedrigtem Luminal die Kanalaktivität verringert ist (EC50 ≈ 1 mM; Ref. 26). Da sich viele RyRs bei normalen luminalen Ca-Ruhespiegeln (≈1 mM) in einem aktivierten Zustand befinden würden, würde das Absenken von Luminal während des Freisetzungsprozesses daher die Gesamtkanalaktivität verringern (ein Prozess, der als luminale Ca-abhängige Deaktivierung bezeichnet wird; Ref. 3). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass CSQ2 durch Stabilisierung des lokalen freien Luminals in der Nähe von RyRs während des Freisetzungsprozesses den luminalen Ca-abhängigen Verschluss des RyR-Kanals verlangsamt und dadurch die Menge an Ca erhöht, die vom SR an das Cytosol freigesetzt wird. CSQ2 steuert auch die Wiederherstellungsdynamik von freiem Intra-SR während der Ca-Wiederaufnahme, indem es als Senke für Ca im SR-Lumen dient. Somit potenziert CSQ2 nicht nur den SR-Ca-Efflux, sondern stabilisiert auch CICR, indem es die funktionelle Wiederherstellung oder Bereitschaft von Ca-Freisetzungsstellen nach jeder Freisetzung moduliert. Kürzlich haben wir einen ähnlichen Mechanismus angewendet, um die Auswirkungen von Ca-Chelatoren mit niedriger Affinität (organische Salze), die in die SR geladen sind, auf die Ca-Freisetzung zu erklären (3). Die Bedeutung unserer vorliegenden Ergebnisse ist, dass sie zeigen, wie der Freisetzungsprozess durch ein endogenes, SR-residentes Ca-bindendes Protein, CSQ2, gesteuert wird. Sie zeigen auch die pathologischen Folgen reduzierter CSQ2-Mengen in der SR von Herzzellen.

Es wurde vorgeschlagen, dass CSQ2 die Ca-Freisetzungskanalfunktion durch direkte Wechselwirkungen mit Proteinen beeinflussen könnte, die den Ca-Freisetzungskanalkomplex (d. h. RyR, Junctin und / oder Triadin) umfassen (Ref. 13; zur Überprüfung siehe Ref. 9). Unsere Studien haben keine signifikanten Unterschiede in den Parametern der SR-Ca-Freisetzung zwischen Zellen mit etwa 3-fach erhöhten CSQ2-Proteinspiegeln und Zellen gezeigt, in denen organische Puffer in die SR geladen wurden (3). So, die einfachste Erklärung für unsere Ergebnisse ist, dass die vorherrschenden Auswirkungen von CSQ2 auf SR-Ca-Freisetzung sind aufgrund der Pufferung Aktionen dieses Proteins innerhalb der SR. Aufklärung des detaillierten Mechanismus, durch den CSQ2 und die damit verbundenen Proteine wie Junctin und Triadin regulieren Ca-Freisetzung müssen Studien warten, die Manipulation von Ebenen und Expression von mutierten Formen dieser Proteine mit veränderten Fähigkeiten, untereinander zu interagieren und die RyR.

Die maximale Rate der Ca-Freisetzung aus stimulierten Myozyten war unabhängig von den in der SR exprimierten Mengen an CSQ2 ähnlich (Abb. 2B und 3D). Diese Ergebnisse stützen die Vorstellung, dass CSQ2 die Beendigung des Freisetzungsprozesses steuert, aber diese Ergebnisse sind nicht das, was man aufgrund der erwarteten Puffereffekte dieses Proteins in der SR notwendigerweise vorhersagen würde. In der Tat wäre zu erwarten, dass die maximale Freisetzungsrate in Zellen mit erhöhten luminalen Ca-Pufferstärken höher ist, die durch einen verlangsamten Rückgang der freien Intra-SR verursacht werden , da in diesen Zellen erwartet würde, dass die verzögerte Abnahme des Ca-Gradienten über die SR-Membran zu größeren Ca-Flussintensitäten führt. Mehrere mögliche Gründe erklären, warum dies nicht beobachtet wurde. Eine Möglichkeit besteht darin, dass die anfängliche freie Intra-SR in CSQ2-überexprimierenden Zellen niedriger sein kann als in CSQ2-unterexprimierenden Zellen. Obwohl im Steady State die Konzentration in einem geschlossenen Kompartiment wie dem SR nicht durch die Anzahl der Ca-Bindungsstellen beeinflusst werden sollte (dies sollte nur die Kinetik beeinflussen, bei der Intra-SR im Steady State erreicht wird), ist es möglich, dass in unseren Experimenten kein echter Steady State erreicht wurde (d. H. Myozyten, die einer Stimulation mit niedriger Rate unterzogen werden). Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass das Vorhandensein erhöhter Spiegel des CSQ2-Proteins die Diffusion von Ca im Luminalraum verlangsamt, wodurch der Exodus von Ca durch die offenen Kanäle verlangsamt wird. Es ist eindeutig mehr experimentelle und theoretische Forschung erforderlich, um dieses Problem zu lösen.

Beendigung der CICR. Wie CICR, ein Prozess mit einer inhärenten Neigung zur Selbstregeneration, beendet wird, war Gegenstand intensiver Forschung, zunächst durch Messungen globaler Ca-Transienten und in jüngerer Zeit durch Untersuchung von Ca-Funken (3, 27-30). Eine Möglichkeit, die in Betracht gezogen wurde, besteht darin, dass die RyR-Kanäle infolge des Anstiegs von auf der cytosolischen Seite des Kanals einer Ca-abhängigen Inaktivierung oder Anpassung unterliegen (27-29). Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass der Rückgang der Intra-SR ein aktives Signal für die Schließung von RyRs liefert, nachdem sie sich geöffnet haben (3, 30-32). Wir haben kürzlich direkte experimentelle Beweise für eine Rolle von luminalen Ca-induzierten Veränderungen der RyR-Aktivität (d. H. luminale Ca-abhängige Deaktivierung) bei der Beendigung der SR-Ca-Freisetzung gefunden, indem die Spiegel von intra-SR mit niedrigaffinen Ca-Puffern, die in die SR-Zisternen geladen sind, geklemmt wurden (3). Mit diesen Puffern haben wir die Dauer der aktiven Ca-Freisetzung, die sowohl fokalen als auch globalen Ca-Transienten in Myozyten zugrunde liegt, dramatisch verlängert. Im Einklang mit diesen Erkenntnissen, Unsere vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Erhöhung der Spiegel des SR-Luminal-Ca-Puffers mit hoher Kapazität CSQ2 verlängert die Ca-Freisetzungsdauer, während die Verringerung der Mengen dieses endogenen Puffers die Freisetzungsdauer verkürzt, anscheinend durch Verlangsamung oder Beschleunigung des luminalen Ca-abhängigen Verschlusses von RyRs, beziehungsweise. Zusammen liefern diese Ergebnisse überzeugende Beweise für die Rolle der luminalen Ca-abhängigen Deaktivierung von RyRs bei der Beendigung der CICR. Obwohl die Bedeutung von Veränderungen der luminalen Ca bei der Beendigung der SR-Ca-Freisetzung demonstriert wird, schließen unsere Ergebnisse nicht unbedingt die Möglichkeit aus, dass zusätzliche Mechanismen wie RyR-Inaktivierung oder Anpassung an cytosolische Ca-Regulationsstellen ebenfalls die Beendigung der Ca-Freisetzung beeinflussen könnten.

Obwohl eindeutige Beweise für eine Rolle von Veränderungen der luminalen Ca bei der Beendigung von Herzerkrankungen vorliegen (Ref. 3; b. vorliegende Studie) zeigten frühere Studien, dass Ca-Veränderungen im Skelettmuskel möglicherweise nicht mit einer erheblichen Erschöpfung des SR einhergehen . In: Lacampagne et al. (33) verwendeten eine kinetische Analyse von Ca-Funkenaufnahmen mit hoher zeitlicher Auflösung, um darauf hinzuweisen, dass der dem Ca-Funken zugrunde liegende Ca-Freisetzungsfluss in Amphibienmuskelfasern konstant ist. Da der SR-Ca-Fluss immer dann abnehmen muss, wenn der SR fällt, Dieses Ergebnis könnte bedeuten, dass die luminalen Ca-Spiegel während des Ca-Prozesses stabil bleiben. Somit besteht die Möglichkeit, dass die grundlegenden Mechanismen, die für den Funkenabbruch verantwortlich sind, im Herz- und Skelettmuskel unterschiedlich sind. Die Durchführung komplementärer Studien in diesen beiden Zelltypen (d. H. Modulation des CSQ-Proteinspiegels in Skelettmuskelfasern und schnelle CAQ-Kinetikmessungen in Herzmyozyten) sollte dazu beitragen, dieses Problem zu klären.

Relevanz für CPVT. Einer der wichtigsten Aspekte unserer Ergebnisse ist, dass sie zeigen, wie reduzierte CSQ2-Spiegel Herzrhythmusstörungen auf zellulärer Ebene verursachen können. CPVT ist eine arrhythmogene Erkrankung, die durch Synkope und plötzlichen Tod gekennzeichnet ist induzierbar durch Bewegung und Katecholamininfusion (34). Bisher wurden vier Mutationen mit CPVT in Verbindung gebracht. Drei dieser Mutationen scheinen zu einer verminderten CSQ2-Expression zu führen (17), und es wurde vorgeschlagen, dass eine Mutation zu einer gestörten Bindung von Ca führt (16). Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die zugrunde liegende Ursache der CPVT mit einer abnormalen Wiederherstellung des Ca-Freisetzungsmechanismus zusammenhängen könnte, die durch reduzierte CSQ2-Spiegel verursacht wird (Abb. 5). Aufgrund der geringeren Konzentration an Ca-Bindungsstellen im SR von Zellen, die CSQ2 unterexprimieren, erfolgt das Nachfüllen des Ca-Speichers durch die SERCA-Pumpe schneller als in normalen Zellen. Das Aufladen des Speichers wird noch schneller, wenn die Aktivität von SERCA durch Proteinkinase A stimuliert wird, was möglicherweise die Abhängigkeit klinischer Episoden von CPVT von Katecholaminen erklärt. In Myozyten mit vermindertem CSQ2-Spiegel führte die vorzeitige Wiederherstellung von Ca-Freisetzungskanälen aus einem luminalen Ca-abhängigen Refraktärzustand zu spontanen, extrasystolischen Entladungen von SR-Ca-Speichern. Es ist bekannt, dass eine spontane Ca-Freisetzung Einwärtsströme und Schwingungen im Membranpotential induzieren kann, was zu einer ausgelösten Arrhythmie führt (4-7). Daher könnten die beobachteten Störungen im Ca-Handling zumindest teilweise die Pathogenese von CPVT erklären, die mit genetischen Defekten verbunden ist, die entweder zu einer verringerten Ca-Bindungsaktivität (16) oder zu einer verringerten Expression von CSQ2 führen (17).

Vergleich mit früheren Studien an transgenen Mäusen. Unsere Ergebnisse unterscheiden sich von früheren Ergebnissen bei transgenen Mäusen, die CSQ2 überexprimieren (14, 15). In diesen Studien erhöhte eine 10- bis 20-fache Überexpression von CSQ2 die Ca-Speicherkapazität isolierter Herzmyozyten; Das luminale Ca stand jedoch nicht zur Freisetzung zur Verfügung, was zu depressiven globalen und lokalen Ca-Freisetzungssignalen führte. Diese Veränderungen im Ca-Handling gingen mit mehreren strukturellen, funktionellen und biochemischen Veränderungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene sowie der Entwicklung von Herzhypertrophie und -versagen einher. Auf der anderen Seite hält die vorliegende Studie die CSQ2-Proteinspiegel unter akuten und nicht unter chronischen Bedingungen näher am physiologischen Niveau; daher spiegeln diese Daten wahrscheinlich die direkten physiologischen Folgen von Änderungen der CSQ2-Proteinspiegel auf die intrazelluläre Ca-Handhabung genauer wider. Diese Ergebnisse unterstreichen die potenziellen Probleme bei der Interpretation der Auswirkungen der konstitutiven High-Level-Expression von Proteinen in transgenen Tiermodellen und den Wert komplementärer Studien in akuteren Umgebungen.

Fazit. Zusammenfassend haben wir festgestellt, dass CSQ2 eine wesentliche Determinante für die Fähigkeit der SR ist, Ca im Herzmuskel zu speichern und freizusetzen. CSQ2 scheint als Reservoir für Ca zu dienen, das für CICR leicht zugänglich ist, und auch als aktiver Ca-Puffer, der den lokalen luminalen Ca-abhängigen Verschluss von RyRs moduliert. Gleichzeitig stabilisiert CSQ2 den CICR-Mechanismus, indem es das funktionelle Aufladen der Ca-Speicher verlangsamt. Abnormales Repriming-Verhalten von Ca-Freisetzungskanälen könnte ventrikuläre Arrhythmien, die mit Mutationen im CSQ2-Gen assoziiert sind, erklären oder dazu beitragen.