alle metoder i humane og dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de relevante institutionelle retningslinjer og regler.

isolering og kultur af plasthæmmende MSC ‘er og CD271 immunopositive MSC’ er fra fedtvæv

efter etisk godkendelse fra National Health Service (NHS) Health Research Authority (LREC nummer 12/EE / 0136) og informeret samtykke fra alle donorer blev PA MSC ‘er og CD271+ MSC’ er isoleret fra at, der var høstet som kirurgiske affaldsprodukter. At blev hakket og behandlet med 0.3 U/ml collagenase (Sigma, Dorset UK) i to timer ved 37 liter C, hvorefter Dulbeccos modificerede Ørnemedium (DMEM) suppleret med 20% (v/v) føtalt kalveserum (FCS) og 1% (v/v) penicillin og streptomycin (alle fra PAA, Yeovil, Somerset, UK) blev tilsat, og det fordøjede præparat centrifugerede ved 600 g i 10 minutter. Den resulterende pellet blev suspenderet igen i DMEM suppleret med 10% (v/v) FCS og 1% (v/v) penicillin og streptomycin, dvs.standardkulturmedium og passeret gennem en 100-cellesil (BD Biosciences, Berkshire, UK). Filtratet blev centrifugeret igen ved 600 g i 10 minutter, og pelleterede celler blev opslæmmet igen i 5 ml standardkulturmedium og ført gennem en 40 liter cellesil. Den resulterende cellesuspension blev derefter behandlet med Erythrocytlysisbuffer (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) i 10 minutter ved stuetemperatur. For hvert at-præparat blev MSC ‘er isoleret fra de mononukleerede celler, der var til stede efter erythrocytlysis gennem deres øgede vedhæftning til vævskulturplast8 eller ved magnetisk associeret cellesortering (Mac’ er) til CD271 immunopositivitet14. Disse celler blev kulturudvidet i standardkulturmedium i en befugtet atmosfære ved 37 kg C med rutinemæssig passage ved trypsinisering ved 80% sammenløb. PA MSC ‘er og CD271+ MSC’ er ved passager II-III blev brugt til alle efterfølgende eksperimenter. Strømningscytometri blev brugt til at vurdere berigelsen for CD271+ – celler (ved hjælp af MACS-teknologi), hvor de frisk isolerede celler blev opbevaret ved -80 liter C natten over efter isolering og derefter optøet og straks immuniseret for CD271; for alle prøver >90% af cellerne var CD271 immunopositive på dette tidspunkt (data ikke vist).

in vitro-differentieringsprotokoller

differentieringskapaciteten for PA og CD271+ MSC ‘ er til dannelse af osteocytter, chondrocytter og adipocytter blev vurderet som beskrevet tidligere8,45. Kort for osteogenese blev monolagskulturer af MSC ‘ er behandlet med 10 nM deksamethason, 50 ng/ml ascorbinsyre og 1 mM beta-glycerophosphat (versus bærerkontroller) hver 2-3 dage i en periode på 4 uger, hvorefter kulturerne blev høstet ved fiksering og farvet til alkalisk phosphataseaktivitet som følger: celler blev fikseret med 10% neutral bufferformalin i 10 minutter. I mellemtiden blev farvningsopløsningen fremstillet ved at placere 25 mg naphthol-phosphat (Naphthol as-MKS phosphat: Sigma) i 0,5 ml dimethylformamid. Denne opløsning blev blandet med 50 ml 0,2 M Tris-HCl-buffer indeholdende 50 mg hurtig rød TR (Sigma). Efter blanding blev den endelige opløsning filtreret under anvendelse af tegnepapir nr. 1 filterpapir (Tegnepapir). Den fikserende opløsning blev derefter fjernet, og cellerne blev vasket med PBS, derefter blev 1 ml af farvningsopløsningen tilsat til hver brønd i 1 time. endelig blev pletten fjernet, og digitaliserede billeder blev taget med et omvendt mikroskop. Differentiering langs den osteogene afstamning blev yderligere evalueret ved øget mængde alkalisk phosphataseaktivitet i differentierede celler sammenlignet med udifferentierede celler ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit (Biovision, USA) og ved at følge producentens protokol; kort sagt blev celler homogeniseret i assaybufferen. De homogeniserede celler blev derefter centrifugeret for at fjerne uopløseligt materiale ved 13.000 g i 3 minutter. Derefter blev 80 liter af hver af prøverne indlæst i separate brønde på en 96 brøndplade. Derefter blev der tilsat 50 liter 5 mM pnpp-opløsning til hver prøvebrønd. Efter et blandingstrin ved pipettering op og ned blev brøndene inkuberet ved 25 liter C i 60 minutter. En standardkurve blev genereret ved at fortynde 40 liter på 5 mM pNPP til 160 liter assaybuffer for at generere 1 mM pNPP-standard. Derefter blev 0, 4, 6, 12, 16 og 20 liter af denne standardopløsning indlæst i en 96 brøndplade for at generere 0-20 nmol/ml pNPP-standarder, der kunne måles ved spektrofotometri. Til chondrogenese blev cellepiller fremstillet i DMEM / høj glucose (Sigma) suppleret med 100 nM deksamethason (DEKSAMETHASON), 37.5 mg/ml Ascorbat-2-phosphat, 1% (vol/vol) insulin, transferrin og selen (its-100; Sigma) og 10 ng/ml transformerende vækstfaktor-kurt1 (TGF-kurt1) (PeproTech, London, UK) og penicillin og streptomycin. Kontrolkulturer blev behandlet med DMEM/højglucosemedier med bærere alene, dvs.methanol, sterilt vand og BSA ved passende fortyndinger. På dag 28 blev chondrogen differentiering undersøgt histologisk ved at fiksere pellets i 10% neutral bufret formalin og derefter indlejre i paraffin-og skærevævssektioner, som blev farvet med toluidinblåt (Sigma) som en markør for proteoglycansyntese8. Derudover blev niveauet af glycosaminoglycan udskilt i det differentierende medium i de sidste 24 timers kultur før høst på dag 28 målt ved hjælp af DMMB-analysen. Dmmb-analyseprotokollen blev tilpasset fra metoden fra Farndale et al., 1986 som følger46: (i) DMMB-farvestofopløsningen blev fremstillet ved tilsætning af 3.04 g glycin, 2,37 g NaCl og 16 mg 1,9 DMMB til 1 liter deioniseret vand; (ii) pH-værdien blev justeret til 3,0 med saltsyre, og farvestofopløsningen blev opbevaret i en brun flaske; (iii) 50 liter alikvoter af dyrkningsmedium høstet fra de cellefrøede stilladser på dag 28 blev tilsat i tre eksemplarer til en 96 brøndplade; (iv) 200 liter af dmmb-farvestofopløsningen blev tilsat til dyrkningsmediet, og absorbansen blev vurderet ved 540 nm med det samme. Chondroitinsulfat (CS) fra hajbrusk (Sigma) blev anvendt til at tilvejebringe en standardkurve for absorbans (0-40 gag/ml, CS), hvorfra GAG-indholdet i prøverne af dyrkningsmedium blev beregnet. Niveauerne af absorbans for GAG-indhold i prøverne af dyrkningsmedium blev normaliseret for at tage højde for baggrundsabsorbansen som følge af tilstedeværelsen af phenolrød i mediet ved at opløse standarderne i DMEM-medium. Til adipogenese blev MSc-kulturer opretholdt i kulturmedier indeholdende 1 liter, 0.5 mM 3-isobutyl-metylksantin (Sigma), 1% insulin, transferrin og Selen (100 forblanding; PAA) og 100 liter indomethacin (Sigma) i 28 dage ved 37 liter C og 5% CO2, som tidligere beskrevet47. Kontrolceller blev opretholdt i komplette medier med bærere. Differentiering blev undersøgt ved anvendelse af Olierød o-farvning af lipiddråber. Celler blev fikseret i 10% neutral bufferformalin i 1 time, hvorefter farvningsopløsningen blev tilsat. Relativ olierød o-akkumulering blev målt efter behandling med 100% isopropanol i 15 minutter og aflæsning af supernatantens absorbans ved 540 nm ved anvendelse af et spektrofotometer.

MSc-transplantation til en femoral osteochondral defektmodel

efter institutionel etisk gennemgang og godkendelse (de institutionelle dyrepleje-og Brugsudvalg ved Fukui University, Institut for Ortopædi og rehabiliteringsmedicin: godkendelsesnummer 25-053), kvindelige athymiske nøgne rotter (F344/N Jcl rnu / rnu, CLEA Japan, Inc. Tokyo, Japan) i alderen 6-10 uger og vejer 150-170 gram blev tilfældigt fordelt i følgende grupper: (i) PA MSC ‘er (n = 6 dyr); (ii) CD271+ MSC’ er (n = 6 dyr); (iii) en kontrolgruppe af Alpha Chondro Shield stillads alene (ingen celler, n = 3 dyr). Disse antal dyr pr. gruppe er tidligere blevet anvendt på samme institut til at påvise signifikante forskelle mellem behandlingsgrupper på 5% – niveauet48. Rotterne blev bedøvet ved eksponering for 3% isofluran i O2-gas og opretholdt ved 1, 5% isofluran i O2-gas under operationen. Efter sterilisering af knæene ved hjælp af 70% ethanol blev der foretaget et medialt parapatellært hudinsnit efterfulgt af dissekering gennem muskelen og derefter eksponering af knæleddet ved lateral forskydning af patellaen. Bilaterale osteochondrale defekter med en diameter på 2 mm og en dybde på 1 mm blev skabt i den patellære rille i lårbenet på hvert dyr ved hjælp af en kirurgisk boremaskine med en diameter på 2 mm. Alpha Chondro Shield blev brugt som cellebærer/stillads til at levere 5 liter 104 Pa MSC ‘er eller CD271+ MSC’ er versus ingen celler (som kontroller). Før transplantation blev celler høstet ved trypsinisering og podet i et volumen på 10 liter standardkulturmedium på skiver med en diameter på 2 mm Alpha Chondro Shield og derefter inkuberet i en befugtet atmosfære ved 37 liter C og 5% CO2 i 30 minutter for at fremme celleadhæsion og inkorporering i stilladset. De cellefrøede og kontrolstilladser blev transplanteret ind i defekterne og fikseret på plads med fibrinlim, som fik lov til at sætte sig i cirka 10-20 sekunder (Fig. 6). Patella blev flyttet, og bindevæv og hud sutureres med nylon suturer. Dyr fik lov til at bevæge sig frit efter genopretning og fodret med en standard vedligeholdelsesdiæt og vand ad libinum. 3 uger efter transplantation blev dyr ofret ved overdosering af 3% isofluran for at undersøge omfanget af sårreparation makroskopisk og histologisk.

makroskopisk scoring af brusk sårheling

efter eksponering af knæleddet i ofrede dyr blev defekten scoret makroskopisk af to kirurger, der blev blindet til behandlingsarmen ved hjælp af et etableret system til vurdering af brusk sårheling i mindre dyremodeller49. Graden af vævsreparation blev scoret fra 0 point (bedste resultat) til 4 point (værste resultat) hver for: (1) farven på reparationsvævet; (2) omfanget af blodkar set i reparationsvævet; (3) glatheden af overfladen af reparationsvævet; (4) i hvilket omfang sårdefekten blev fyldt med reparationsvæv; (5) omfanget af degeneration af den tilstødende ledbrusk. De scorede point for hvert kriterium blev tilføjet, og graden af bedste reparation blev repræsenteret med den laveste score fra en samlet score på 20.

histologisk scoring af brusk sårheling

efter kirurgisk udskæring blev dyreknæ fikseret i 10% neutralt bufret formalin (Sigma) i 48 timer og anbragt i K-CK afkalkningsopløsning (FALMA, Tokyo, Japan) i 24-48 timer ved 4 kur C. Efter dette blev rotteknæene vasket natten over i rindende ledningsvand, forarbejdet og indlejret i paraffinvoksblokke klar til snitning. Vævssektioner blev skåret med en tykkelse på 5 mikron i et standard roterende mikrotom, og disse blev farvet med hæmatoksylin og eosin (H&E) og toluidinblåt før montering i dpks og histologisk undersøgelse. Omfanget og kvaliteten af bruskreparation blev vurderet histologisk og uafhængigt af to eksaminatorer ved hjælp af Vakitani scoring system36, modificeret til at omfatte to yderligere parametre, dvs. at undersøge tilstedeværelsen af blodkar og fremmedlegemer gigantiske celler (FBGCs). Derfor består scoringssystemet af syv forskellige parametre: (1) cellemorfologi; (2) matriksfarvning; (3) overfladens regelmæssighed; (4) tykkelse af brusk; (5) integration af reparationsvævet med værtsbrusk; (6) omfanget af vaskularisering inden for defekten; (7) omfanget af FBGC-reaktion. For hver af disse parametre repræsenterede den laveste score (0) den’ bedste ‘reparation, og en højeste score (4) repræsenterede den’ værste ‘ reparation. De samlede score blev tilføjet og derefter sammenlignet mellem grupper ud af en samlet score på 21.

immunhistokemi for humant mitokondrielt antigen

vævssektioner blev farvet med et anti-humant mitokondrielt antigen (HMA) antistof (klon 113-1: Abcam, Cambridge, UK) for at vurdere tilstedeværelsen af humane MSC ‘ er. Efter antigenudtagning blev sektionerne nedsænket i tre ændringer af PBS og blokeret i 20 minutter med 2,5% hesteserum (Vector Labs Ltd) ved stuetemperatur for at forhindre ikke-specifik binding. Sektionerne blev derefter inkuberet med musens anti-HMA-antistof (1:400 fortynding i PBS) i 1 time ved stuetemperatur i et befugtet kammer. Herefter blev ethvert ubundet antistof vasket af i tre ændringer af PBS forsigtigt, og sektionerne blev inkuberet med biotinyleret anti-mus IgG i 30 minutter ved stuetemperatur. Sektionerne blev vasket tre gange i PBS, og endogen peroksidisaktivitet blev blokeret ved anvendelse af 0,3% brintoverilte i methanol i 30 minutter ved stuetemperatur. Under dette inkubationstrin blev Vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, UK) forberedt og fik lov til at stå i 30 minutter før brug i henhold til producentens anvisninger. Efter blokering af den endogene peroksidisaktivitet blev sektioner vasket i tre gange PBS og inkuberet med ABC-reagenset i 30 minutter ved stuetemperatur. Herefter blev et dab-kromogen (Vector labs) tilsat i 6-8 minutter afhængigt af intensiteten af den ønskede farve. Sektioner blev derefter vasket og dehydreret gennem serier af ethanol (70-100%), ryddet med kylen og monteret i Perteks. Chondrogen pellet af humane MSC ‘ er blev anvendt som en positiv kontrol. Negativ kontrol omfattede chondrogen pellet, hvor det primære antistof blev udeladt.

Scanningselektronmikroskopi

vedhæftningen af MSC ‘ er, der blev podet i Alpha Chondro Shield-stilladset før implantation, blev undersøgt ved scanning af elektronmikroskopi (sem) som følger: efter at de cellefrøede stilladser var blevet inkuberet i en befugtet atmosfære ved 37 liter C og 5% CO2 i 30 minutter, blev de vasket i PBS og derefter fikseret i 2% glutaraldehyd i 0,1 M phosphatbuffer (pH 7,4) i 2 timer og derefter vasket i 0.1 M fosfatbuffer før behandling med 1% osmiumtetrailte i 1 time. Prøverne blev derefter dehydreret gennem en graderet serie ethanolopløsning, behandlet med overgangsopløsningsmiddel, t-butylalkohol i 30 minutter, frysetørret, belagt med guld palladium og til sidst afbildet ved hjælp af et JSM-6390 (JEOL, Tokyo, Japan) eller SEISS EVO10 scanningselektronmikroskop (Carl Seiss, Cambridge, UK).

levende/død farvning for at analysere cellelevedygtighed i cellefrøede stilladser

MSC-seedede stilladser blev farvet med levende / død farvningsopløsning efter producentens protokol, som beskrevet tidligere8. Kort fortalt blev de cellefrøede stilladser nedsænket i den levende/døde farvningsopløsning i 30 minutter i mørket ved 37 liter C. stilladserne blev derefter fjernet fra farvningsopløsningen, vasket i PBS og straks afbildet ved hjælp af et konfokalt mikroskop (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS).

in vitro angiogeneseanalyser

den humane EA.hy926 endotelcellelinie blev brugt som model til at undersøge enhver angiogen aktivitet af dyrkningskonditioneret medium fra PA MSC og CD271+ MSC CM. EA.hy926 endotelcelleproliferation / migration og dannelse af endotelrør blev undersøgt som følger: (i) EA.hy926-celler blev dyrket i standardkulturmedium (DMEM/ F-12 suppleret med 10% FBS, 1% penicillin og streptomycin) i 24 brøndplader i 2 dage, indtil der blev dannet 100% sammenflydende monolag. En steril pipettespids blev brugt til at lave en ridse i monolaget. Derefter blev brøndene vasket med sterile PBS, og derefter blev 1 ml konditionerede medier fra PA MSC-kulturer eller CD271+ MSC-kulturer tilsat i hver af triplikatbrønde pr.testet tilstand. Serumfrit DMEM-dyrkningsmedium blev anvendt som kontrol. Pladen blev inkuberet i celle-ik-platformen til digitaliseret billeddannelse i levende celler over en 2 dages periode, hvorefter lukning af ridsesår, levedygtige celletal og omfanget af migration af individuelle celler blev kvantificeret ved hjælp af celle-ik-billedanalyseprogrammet. Den proliferative respons af EA.hy926 endotelceller til PA MSC og CD271+ MSc konditionerede medier (versus serumfrit kontrolmedium) blev også undersøgt ved hjælp af MTT-analysen; (ii) EA.hy926 endotel tubuledannelse blev testet ved hjælp af vækstfaktorreduceret Matrigel (BD Bioscience), som blev aciteret i 96-brøndsplader (50 liter matrigel/brønd) og derefter inkuberet i 30 minutter ved 37 liter C. EA.hy926 endotelceller blev podet på Matrigel ved 2 liter 104 celler / brønd i 200 liter PA MSC og CD271+ MSC konditionerede medier eller serumfrit kontrolkulturmedium. Pladerne blev inkuberet ved 37 liter C i 1 dag, hvorefter de blev afbildet ved hjælp af Cell ik imaging platform (3 billeder pr. Den totale endotel-tubulelængde/ – billede og det totale antal endotel-tubuleforgreningspunkter/ – billede blev målt ved hjælp af Cell-ik-billedanalysatorprogrammet.

statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism6-programmet (GraphPad, Inc. CA, USA). For in vivo-forsøg blev der testet mindst n = 3 dyr pr.tilstand. For in vitro-eksperimenter blev n = 3-4 uafhængige eksperimenter udført for alle analyser, hvor data blev analyseret med envejs ANOVA, når der var en variabel faktor, og tovejs ANOVA, når der var to variable faktorer. For makroskopiske og histologiske scoringer af bruskreparation blev forskelle mellem grupper undersøgt ved hjælp af Dunns multiple sammenligningstest. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle data er blevet præsenteret som betyder Kurt SEMs eller betyder Kurt SDs (som angivet i figuren legender).