Sériové passaging plicních metastáz in vivo obohacuje pro metastatický potenciál
PDX-line WU-BC3 byl vygenerován přihojením prsu nádorových buněk od pacienta s metastatickým TNBC do zlidštění prsní tukové polštářky (Multifunkční zařízení) NOD/SCID myši myši.26,27 vytvořili Jsme tyto nádorové buňky stabilně express Klepněte na tlačítko Brouk Červené Luciferase (CBR-Luc), mCherry, a shRNA specifickými pro p53 (shA2) vytvořit PDX-line BC3_A2 (dříve známý jako BC3-p53KD28) (Doplňkový Obr. 1a). Ukázali jsme, že nádorové buňky metastázovaly z MFP na fyziologicky relevantní místa včetně plic, jater, kostí, mozku a lymfatických uzlin.28 plicních metastáz (P0) bylo izolováno z replikovaných myší, sdruženo a roubováno do MFP přijímajících myší. Výsledné plicní metastázy (P1) byly izolovány, sloučeny a roubovány do MFP dalších myší. Plicní metastázy z těchto myší (P2) byly také shromážděny a sloučeny (Doplňkový obr. 1b). Provedli jsme bioluminiscence imaging (BLI) plic, kostí a jater, při pitvě kvantifikovat relativní velikost metastáz v každém průchodu (Doplňkový Obr. 1c). Sériové pasážování obohacené pro nádorové buňky se zvýšenou kapacitou metastázovat na všechna místa (Doplňkový obr. 1d-f, h) a požadované myši, které mají být utraceny dříve (Doplňkový obr. 1i). Naproti tomu sériové průchodové nádory mezi MFP nevedly ke zvýšeným plicním metastázám (Doplňkový obr. 1g), což naznačuje, že získání zvýšené metastatické kapacity nebylo pouze důsledkem sériově pasážujících nádorů in vivo. Kromě toho nádorové buňky se zvýšenou metastatickou kapacitou nevykazovaly významné zvýšení růstových vlastností, když byly izolovány z MFP a umístěny zpět do MFP přijímajících myší (Doplňkový obr. 1j). Dohromady tyto výsledky ukazují, že sériové průchodování nádorových buněk z plic do MFP v tomto modelu obohacuje metastatický potenciál, ale ne orgánově specifické navádění.
Mezenchymálních genové exprese je snížená v plicních metastáz vzhledem k MFP nádory
identifikovat změny v genové expresi vzory, které doprovázejí metastáz, jsme provedli RNA sekvenování (RNAseq), na plicních metastáz (P0 a P2) a MFP (P0 a P2) nádory (Obr. 1a a doplňková Tabulka 1). Po odečtení RNAseq čte mapování myši transcriptome, jen člověk přepisu čte byly použity pro následné analýzy. Analýza hlavních komponent (PCA) odhalila snížil nesoulad mezi biologickými opakováními s opakovaným passaging in vivo, jako biologické replikáty P2 nádorových vzorků clusteru více úzce spolu navzájem než s jinými subpopulacemi analyzovat (Obr. 1b). Genetické Nastavit Obohacení Analýzy (GSEA) ukázal, že EMT bylo nejvíce významně downregulated dráhy v obou P0 a P2 plicních metastáz vzhledem k MFP nádorů (Obr. 1c). Signalizace TGF-β, která reguluje EMT, byla také významně down-regulována v plicních metastázách P0 i P2 (obr. 1c).
PDX plicních metastáz podpisy identifikovat geny, de-upraveno v metastáz. schematické znázornění MPF nádorů a plicních metastáz izolovaných pro RNAseq. B analýzy hlavních komponent (PCAs)z dat RNAseq generovaných z nádorů MFP a plicních metastáz použitých v této studii. Každý datový bod představuje jeden vzorek z jednotlivé myši. c GSEA pathway analysis on the enriched lung metastasis signature (P2); horní 5 dolů (modrý) – a nahoru (červená)regulované procesy jsou zobrazeny. NES, normalizované skóre obohacení. Pole označují FDR < 0.1 pro statistickou významnost. V pravém panelu jsou znázorněny enrichmentační grafy pro epiteliální mezenchymální přechod (EMT) a signalizace TGF-β pro P0 a P2. p < 0.001 pro EMT a TGF-β signalizaci při P0 a P2. d qRT-PCR analýza exprese vimentinu u nádorů BC3_A2 MFP a metastatických subpopulací izolovaných z plic. Spárované t-testy, p = 0,02 pro P0 plic, p < 0,001 pro P2 plic. Každý datový bod představuje jednu myš. Chybové sloupce představují SEM biologických replikátů. Viz také doplňkový obr. 2. barvení IHC bylo provedeno na označených tkáňových úsecích pomocí protilátky rozpoznávající formu vimentinu specifickou pro člověka. Stupnice stupnice označují 100 µm. F Vodopád graf ukazující expresi EMT genů v P0 a P2 plicních metastázách ve srovnání s odpovídajícími nádory MFP. p-hodnoty jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1. Vzorky z nejméně tří nezávislých myši byly zahrnuty pro RNAseq analýzy
Kvantitativní real-time (zásahovou jednotku-PCR) byla provedena pro sledování exprese vimentinu, mezenchymálních markerů, v MFP nádorů a plicních metastáz po sériové passaging. Exprese vimentinu vykazovala dynamický vzorec s vyšší expresí v nádorech MFP vzhledem k odpovídajícím plicním metastázám v každém průchodu(obr. 1d) a jaterních metastáz při P0 (Doplňkový obr. 2a). Hladiny proteinu vimentinu rekapitulovaly tento dynamický vzorec (obr. 1e). Další EMT geny byly také downregulovány v plicních metastázách vzhledem k odpovídajícím nádorům MFP(obr. 1f). Expresi mezenchymálních markerů CDH2 (gen kódující N-cadherin) následoval stejný vzor jako vimentinu (Doplňkový Obr. 2b), zatímco exprese epiteliálního markeru CDH1 (gen kódující E-kadherin) vykazovala inverzní trend (Doplňkový obr. 2c). Společně roubované lidské stromální fibroblasty byly vyčištěny v době sklizně nádoru (Doplňkový obr. 3a-f), vylučující možnost, že přispěly k expresi mezenchymálních markerů v nádorech MFP. Dohromady tyto výsledky ukazují, že nádory snižují expresi mezenchymálních genů, jakmile byly zavedeny v metastatických místech.
stanovení složitosti knihovny pro vysoký výkon zesílení funkce obrazovky
obrazovka s vysokým výkonem gain-of-function (GOF) byla navržena k identifikaci funkčních ovladačů metastáz z našeho podpisu plicních metastáz P2. HOXA1, známý řidič metastáz,29 sloužil jako pozitivní kontrola pro optimalizaci obrazovky, a GFP byl použit jako negativní kontrola. BC3_A2 buňky jsou transduced s lentivirus kódování buď HOXA1 nebo GFP, a infikované nádorové buňky byly smíchány v různých poměrech (Doplňkový Obr. 4a). Smíšené populace nádorových buněk byly poté roubovány do MFP přijímajících myší a BLI byla použita ke skóre plicních metastáz v době nekropsie (Doplňkový obr. 4b). V druhé sadě experimentů, metastatické řidič ID19 byl použit v kombinaci s GFP, ale v tomto případě smíšené populace nádorové buňky byly injikovány do ocasní žíly příjemce myší model konečné fáze metastáz (Doplňkový Obr. 4c). Významné zvýšení toku fotonů bylo pozorováno u nádorů s poměrem HOXA1: GFP nebo ID1: GFP 1: 10. Tyto složitosti testy prokázaly, že v dobré víře metastáz driver může být detekován v naší obrazovky, pokud se spojí s 9 non-ovladač otevřené čtecí rámce (Orf), ale bazén jeden řidič s 19 non-řidiči maskovaný naše schopnost detekovat řidiče. Na základě těchto výsledků jsme omezili naši velikost bazénu na 12 ORFs.
Vysoká propustnost gain-of-function screening in vivo identifikuje kandidáta funkční ovladače z TNBC metastázy
určit, které z upregulated geny z P2 plicních metastáz podpis byly schopné jízdy plicních metastáz, navrhli jsme vlastní čárovým kódem lentiviral knihovny kódování Orf z 230 genů, které jsou většinou vysoce upregulated v plicních metastáz. Orf byly individuálně vyjádřené v BC3_A2 buňky tak, že každá buňka řádku vyjádřil jeden ORF, buňky byly pak sloučeny do skupin po 12 a bazény byly implantovány do Multifunkčních zařízení příjemce myší (n = 10 myší na bazén, Obr. 2a). Kontrolní plazmid exprimující GFP byl zahrnut do každé skupiny, aby se zjistily vnitřní metastázy v tomto modelu TNBC. Každý ORF byl spojen s jedinečným čárovým kódem DNA. Referenční peleta sdružených buněk byla zmrazena, aby se potvrdilo stejné zastoupení každého ORF v době implantace nádoru. Třináct týdnů bylo vybráno jako koncový bod studie, protože HOXA1, ale ne nádory exprimující GFP, metastázovaly do plic do tohoto časového bodu (Doplňkový obr. 5a). Třináct týdnů po štěpení byly plíce podrobeny BLI ex vivo (Doplňkový obr. 5a), metastatické léze byly izolovány a genomová DNA (gDNA) byla extrahována a použita jako šablona pro qPCR k zesílení jedinečných oblastí čárového kódu spojených s každým ORF (Doplňkový obr. 5b). Nádory MFP byly také izolovány a podrobeny těmto analýzám (obr. 2a). Reprezentace každého čárově kódovaného ORF v MFP vzhledem k referenčnímu vzorku byla stanovena pro každý fond (obr. 2b; doplňkové obr. 5c, d). Reprezentace v plicích byla poté normalizována k obohacení v MFP vs. odkaz (obr. 2b, c). Ovladače metastáz se rozdělily do tří skupin, včetně těch, které byly obohaceny jak v plicích, tak v MFP (obr. 2b, pravý horní kvadrant a doplňkový obr. 5c), které jsou obohaceny výlučně o multifunkční zařízení (obr. 2b, pravý dolní kvadrant) a ty, které jsou obohaceny výhradně v plicích (obr. 2b, levý horní kvadrant a obr. 2c). Buňky exprimující GFP byly v některých bazénech obohaceny plicními metastázami a průměrné skóre obohacení GFP v plicích bylo přibližně 5 (Doplňkový obr. 5e). Proto jsme použili jako obohacení skóre cutoff definovat skutečný hit v naší obrazovky a identifikovány 44 geny, které byly selektivně obohacené v plicních metastáz vzhledem k primární nádory. Tyto zásahy byly seřazeny podle skóre obohacení (obr. 2c a doplňková Tabulka 2). Mezi pěti nejlepšími hity byl CEACAM5 jediný, jehož exprese v primárních nádorech předpovídala špatné přežití u pacientů s rakovinou prsu (Doplňkový obr. 6a). Proto jsme dále zkoumali funkční roli CEACAM5 v metastázách rakoviny prsu.
Vysoká propustnost gain-of-function screening in vivo identifikuje funkční ovladače metastáz. schéma znázorňující formát používaný pro zisk-of-funkce (GOF) obrazovky. Viz také doplňkový obr. 5. ORF, otevři čtecí rámeček. Do každé kohorty bylo implantováno deset myší. B bodový graf ukazující relativní zastoupení každého ORF v nádorech MFP po normalizaci k referenci (osa x) a v plicích vzhledem k nádorům MFP(osa y). Pro kvantifikaci dat qPCR byla použita metoda ΔΔCT. CEACAM5 je zobrazen červeně. C geny obohacené o plicní metastázy, ale ne nádory MFP, byly řazeny v sestupném pořadí obohacení v plicích. Tečkovaná čára označuje mezní skóre obohacení. Viz také doplňkový obr. 5. a Doplňující Tabulka 2
Potvrzení posílené CEACAM5 výraz v další metastatické PDX modely
Jsme zjistili, že CEACAM5 výraz byl dynamicky regulováno jako metastatické subpopulace byly sériově pasážovány mezi plíce a Multifunkčních in vivo (Obr. 3a), potvrzující nálezy z RNAseq (doplňková Tabulka 1 a doplňkový obr. 6b). Podobně byla exprese CEACAM5 vyšší v játrech (Doplňkový obr. 7a) a mozek (Doplňkový obr. 7b) metastázy ve vztahu k odpovídajícím nádorům MFP. Hladiny proteinu CEACAM5 byly také vyšší u plicních metastáz ve srovnání s nádory MFP (obr. 3b). Zvýšení CEACAM5 výraz v metastatických lézí nebyla závislá na p53 tlumení hluku v této PDX-line, jako plicní metastázy z izogenní PDX-line exprimujících divoký typ p5326,30 zobrazeny také vyšší exprese úrovně CEACAM5 (Doplňkový Obr. 7c).
CEACAM5 je upregulován v metastáz, a jeho výraz je nepřímo spojeny s vimentinu v PDX modely TNBC. exprese CEACAM5 v nádorech MFP a metastatických lézích myší roubovaných nádory BC3_A2 byla stanovena pomocí qRT-PCR. Spárované t-testy, p < 0,001 pro P0 plic, P2 MFP nádor a P2 plic. Každá tečka představuje samostatnou myš. Chybové sloupce představují SEM biologických replikátů. Viz také doplňkový obr. 7. nádory B MFP a odpovídající metastázy z myší roubovaných nádory BC3_A2 byly analyzovány IHC pomocí protilátky CEACAM5. Stupnice stupnice označují 100 µm. C exprese CEACAM5 u nádorů MFP a metastatických lézí myší roubovaných nádory PIM001-P byla stanovena pomocí qRT-PCR. Data jsou prezentována na stupnici protokolu. Párový t-test, p < 0.001. Každá tečka představuje samostatnou myš. Chybové sloupce představují SEM biologických replikátů. nádory D MFP a odpovídající plicní metastázy z myší roubovaných nádory PIM001-P byly analyzovány IHC pomocí protilátky CEACAM5. Stupnice stupnice označují 100 µm. e, f IHC sériové nádor tkáňové řezy z myší engrafted s BC3_A2 (e) nebo PIM001-P (f) potřísněné protilátky specifické pro CEACAM5 (horní panel) nebo vimentinu. Stupnice stupnice označují 100 µm. G exprese CEACAM5 (horní panel) nebo vimentinu (spodní panel) byla stanovena v panelu buněčných linií karcinomu prsu. Chybové sloupce představují SEM technických trojic. h IHC byl proveden ke sledování fosforylovaného p38 u nádorů MFP a plicních metastáz BC3_A2 myší. Měřítko bary naznačují, 100 µm,
druhý soubor PDX modely TNBC (PIM001) byly hodnoceny určit, zda zvýšení CEACAM5 v metastatických lézí byla obecná vlastnost metastáz. PIM001-P byl stanoven z primárního nádoru dosud neléčeného pacienta s metastazujícím TNBC, zatímco PIM001-M byl stanoven z dermálních metastáz od stejného pacienta. Nádorové buňky PIM001-P byly navrženy tak, aby exprimovaly jak CBR-Luc, tak mCherry a poté byly roubovány do MFP přijímajících myší. V době nekropsie byly izolovány nádory MFP a plicní metastázy. Exprese CEACAM5 byla zvýšena na obou hladinách mRNA (obr. 3c) a hladiny bílkovin (obr. 3d) v plicních metastázách PIM001-P ve srovnání s odpovídajícími nádory MFP. Zajímavé je, CEACAM5 hladiny proteinu byly vyšší u PDX MFP nádory stanovena od pacienta kožní metastázy (PIM001-M) ve srovnání s PDX MFP nádorů založena z její primární nádor prsu (PIM001-P) (Doplňkový Obr. 7d). Souhrnně tyto výsledky ukazují, že zvýšení CEACAM5 je společnou vlastností metastáz v PDX modelech TNBC.
exprese CEACAM5 je nepřímo korelována s expresí VIMENTINU a fosforylací p38
, protože exprese CEACAM5 v PDX modelech byla nepřímo korelována s expresí vimentinu (obr. 1d, 3a; doplňkové obr. 2a a 7a, b), imunohistochemie (IHC) byla použita ke sledování plicních metastáz a nádorů MFP pro relativní hladiny VIMENTINU a CEACAM5. Hladiny proteinů korelovaly s hladinami mRNA v obou modelech PDX (obr. 3e, f). Exprese vimentinu byla také nepřímo korelována s expresí CEACAM5 v panelu buněčných linií karcinomu prsu (obr. 3g). Serin / threonin-specifická proteinkináza p38alfa (známá také jako MAPK14, dále jen p38) je fosforylována během EMT.31 je zajímavé, že fosforylovaný (aktivní) p38 koreloval s vysokými hladinami exprese vimentinu v nádorech MFP a fosforylace p38 se snížila v plicních metastázách, kde byly hladiny vimentinu nízké (obr. 3h). Souhrnně tato data ukazují, že exprese CEACAM5 je nepřímo korelována s expresí EMT markerů v plicních metastázách.
Ektopické nadprodukce CEACAM5 inhibuje TGF-β signalizace a exprese markerů EMT
Vzhledem k tomu, že CEACAM5 projevu nepřímo spojeny s mezenchymálních stav jsme hodnotili, zda CEACAM5 měl přímou roli v regulaci exprese mezenchymálních markerů. BC3_A2 buňky konstruované k nadprodukci lidského CEACAM5 nebo GFP jako negativní kontrola (Doplňkový obr. 8a, b) byla zkoumána exprese vimentinu a CDH2 / N-kadherinu (mezenchymální markery) a CDH1/E-kadherinu (epiteliální marker). Nadměrná exprese CEACAM5 vedla ke zvýšené expresi CDH1 (Doplňkový obr. 8c) a snížená exprese CDH2 (Doplňkový obr. 8d) a vimentin (Doplňkový obr. 8e). Kromě toho nadprodukce CEACAM5 snížila a zpožďovala fosforylaci Smad zprostředkovanou TGF-β v buňkách BC3_A2 (obr. 4a, c, Doplňkový obr. 9a) a P38 fosforylace v obou buňkách BC3_A2 (obr. 4a, b, Doplňkový obr. 9a) a buňky MDA-MB-231 (Doplňkový obr. 8f, Doplňkový obr. 9b). Konečně nadprodukce CEACAM5 zpožďovala EMT indukovanou TGF-β, jak bylo hodnoceno expresí E-cadherinu a vimentinu (obr. 4d, Doplňkový obr. 9c). Tyto výsledky naznačují, že CEACAM5 negativně reguluje EMT a identifikuje funkci CEACAM5 v metastázách rakoviny prsu.
CEACAM5 nadprodukce downreguluje expresí mezenchymálních markerů a snižuje TGF-β signalizace a snižuje TGF-β signalizace. buňky BC3_A2 vytvořené k nadprodukci CEACAM5 nebo GFP byly kultivovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti 1 ng / ml TGF-β po uvedená časová období. Buněčné lyzáty byly podrobeny Western blotování pro uvedené proteiny. Histogram B, c ukazuje změnu fold (log scale) ve stavu fosforylace P38 (b) nebo Smad2/3 (c) ve srovnání s časovým bodem 0 pro buňky exprimující GFP. Chybové sloupce představují SEM nejméně tří nezávislých experimentů. d BC3_A2 buňky exprimující GFP nebo CEACAM5 byly kultivovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti 1 ng / ml TGF-β po uvedená časová období. Buněčné lyzáty byly podrobeny Western blotování pro uvedené proteiny. Všechny výsledky jsou reprezentativní pro nejméně tři nezávislé experimenty. Viz také doplňkové obr. 8 a 9,
Nadprodukce CEACAM5 podporuje metastatického následek a snižuje EMT in vivo
EMT je spojena s snížení buněčné proliferace.19 schopnost CEACAM5 inhibovat EMT tedy naznačuje, že může fungovat na podporu růstu nádoru v metastatických místech. K testování této hypotézy, BC3_A2 buněk navržen tak, aby nadprodukci CEACAM5 nebo GFP (kontrolní) byly injikovány do ocasní žíly příjemce myší sledovat účinky CEACAM5 nadprodukce na růst nádoru v plicích. Nadměrná exprese CEACAM5 vedla ke zvýšenému růstu nádoru v plicích (obr. 5a a doplňkový obr. 10a), snížená exprese vimentinu na úrovni proteinu (Doplňkový obr. 10b) a snížená fosforylace p38 (obr. 5d, e). Snížení hladin CEACAM5 v BC3_A2 se dvěma různými shrna (obr. 5b) měl opačný účinek v tom, že transdukované buňky rostly pomaleji v plicích než kontrolní buňky po injekci ocasní žíly (obr. 5c a doplňkový obr. 10c). Kromě toho CEACAM5 knockdown vedl ke zvýšení počtu lézí, ale ke snížení velikosti lézí (Doplňkový obr. 10d, e). Tyto výsledky naznačují, že umlčení CEACAM5 podporuje EMT a extravazaci nádorových buněk a současně inhibuje metastatický růst.
Výraz CEACAM5 podporuje růst plicních metastáz. BC3_A2 buňky nadprodukční CEACAM5 nebo GFP byly injikovány do ocasních žil myší. BLI byla použita ke kvantifikaci toku fotonů v plicích myší v uvedených časových bodech. Párový t-test, p = 0,03. Chybové pruhy představují SEM biologických replikátů (n = 5 myší na skupinu). b BC3_A2 buněk exprimujících kontrolní shRNA (shLuc) nebo dvě různé shRNAs (#3 a #5) specifické pro CEACAM5 byly podrobeny zásahovou jednotku-PCR pro sledování CEACAM5 výraz. Chybové sloupce představují SEM technických trojic. Viz také doplňkový obr. 10. C BC3_A2 buňky exprimující shLuc nebo dvě různé ceacam5 shrna byly injikovány do ocasních žil myší. BLI byla použita ke kvantifikaci toku fotonů v plicích myší v uvedených časových bodech. Spárované t-testy, p = 0.01 pro SH#3 a p < 0.001 pro sh#5. Data byla normalizována na počáteční časový bod a jsou prezentována na stupnici protokolu. Chybové pruhy představují SEM biologických replikátů (n = 5 myší na skupinu). d BC3_A2 buňky nadprodukci CEACAM5 byly injikovány do ocasní žíly myší, a plíce byly izolovány a podrobeny IHC s uvedenou protilátky. Stupnice stupnice označují 100 µm. e Buněk barvení pozitivní pro CEACAM5, vimentinu, nebo p-p38 v tkáňových řezech zastoupeny v panelu d byly kvantifikují pomocí Vectra 3.0 automatizované zobrazovací systém. Párové t-testy, p = 0.0008 pro CEACAM5, p = 0,03 pro vimentinu, a p = 0,03 p-p38. Chybové pruhy představují SEM nejméně tří nezávislých biologických replik. f RNA izolované z BC3_A2 buňky nadprodukci CEACAM5 nebo GFP a kultivovány buď in vitro nebo izolované z plic po ocasní žíly injekci (in vivo, a, d) bylo podrobeno GSEA cesta analýza (levé dva sloupce). Nahoře 5 dolů regulované (modrá) a top 5 nahoru regulované (červená) procesy jsou zobrazeny. Pole označují FDR < 0.1 pro statistickou významnost. NES (normalized enrichment score). Význam těchto cest v nádorech P0 a P2 MFP vs. odpovídající plicní metastázy jsou zobrazeny pro srovnání (pravé dva sloupce). Data jsou reprezentována biologickými triplikáty. Viz také doplňkový obr. 11.
sledovat, jak nadprodukce CEACAM5 dopad na genovou expresi, BC3_A2 buněk navržen tak, aby nadprodukci CEACAM5 nebo GFP byly kultivovány in vitro nebo izolované z plic po ocasní žíly injekci (in vivo). RNA byla izolována a podrobena RNAseq. Byla provedena analýza diferenciální genové exprese a GSEA identifikovala EMT jako jedinou cestu punc rakoviny, která byla významně snížena jak in vitro, tak in vivo nadprodukcí CEACAM5 (obr. 5f, Doplňkový obr. 11). Tento výsledek je podobný výsledku pozorovanému u plicních metastáz P0 a P2 (obr. 1c, 5f). Souhrnně tyto údaje ukázaly, že upregulace exprese CEACAM5 v metastatických lézích indukuje MET a zvyšuje růst metastatických nádorových buněk v sekundárních místech.
CEACAM5 výraz je upregulated v metastatických lézí od pacientů s rakovinou prsu
Next, CEACAM5 exprese byla hodnocena v metastatických lézí a prsní nádorové tkáni získané od pacientů s rakovinou prsu. IHC barvení na uzavřeno tkáně set skládající se z primárního nádoru a plicních metastáz z pacienta s rakovinou prsu (Doplňující Tabulka 3), bylo zjištěno vyšší CEACAM5 úrovně v plicních metastáz vzhledem k primární nádor prsu (Obr. 6a a doplňkový obr. 12a). Rozšířit tyto analýzy, tissue microarray (TMA), skládající se z plicních metastáz z 25 pacientů s rakovinou prsu (Doplňkový Obr. 12b, c a doplňková Tabulka 3) byla obarvena pro CEACAM5 (Doplňkový obr. 12b) a intenzita barvení byla přiřazena skóre (obr. 6b). Tento bodovací metoda byla použita i na TMA z Human Protein Atlas sestávající z lidských nádorů prsu barevného pro CEACAM5.32 většina plicních metastáz vyjádřil vysoké úrovně CEACAM5 (Obr. 6c) ve srovnání s nádory prsu (obr. 6d), prokazující, že CEACAM5 byl vyšší v metastatických lézích ve srovnání s primárními nádory prsu.
CEACAM5 bílkovin v krvi jsou vyšší u metastatických lézí pacientů s rakovinou prsu a jsou nepřímo spojeny s expresí vimentinu. a primární nádor a odpovídající plicní metastázy od pacienta s rakovinou prsu byly podrobeny IHC ke sledování hladin CEACAM5. Stupnice stupnice označují 100 µm. b mikroarray nádorové tkáně (TMA) sestávající z plicních metastáz od 25 pacientů s karcinomem prsu byl podroben IHC s protilátkou specifickou pro CEACAM5 a intenzita barvení byla hodnocena. Reprezentativní obrázky jsou zobrazeny. Stupnice stupnice označují 100 µm. c bodovací systém v B byl aplikován na TMA sestávající z plicních metastáz od 25 pacientů s karcinomem prsu k posouzení relativních hladin CEACAM5. d bodovací systém v b byl aplikován na TMA z atlasu lidského proteinu sestávajícího z 25 primárních nádorů prsu k posouzení relativních hladin CEACAM5. e primární nádor a odpovídající plicní metastázy od pacienta s karcinomem prsu (od a) byly barveny pro CEACAM5 a vimentin a analyzovány imunofluorescenční mikroskopií. Stupnice stupnice označují 100 µm. f buňky s pozitivním barvením na CEACAM5, vimentin nebo obojí v tkáňových sekcích zastoupených v e byly kvantifikovány pomocí automatizovaného zobrazovacího systému Vectra 3.0. g TMA sestávající z plicních metastáz od 25 pacientů s karcinomem prsu bylo barveno na CEACAM5 a vimentin a analyzováno imunofluorescenční mikroskopií. Reprezentativní obrázky jsou zobrazeny. Stupnice stupnice označují 100 µm. h Buněk barvení pozitivní pro CEACAM5, vimentinu, nebo jak v tkáňových řezech zobrazeny v g byly kvantifikují pomocí Vectra 3.0 automatizované zobrazovací systém. Viz také doplňkový obr. 12,
dále Jsme hodnotili uzavřeno tkáně nastavit pro co-vyjádření CEACAM5 a vimentinu. Co-barvení pro CEACAM5 a vimentinu odhalila vyšší úrovně CEACAM5 v plicních metastáz oproti uzavřeno nádor prsu, a naopak barvení vzor byl pozorován pro vimentinu (Obr. 6e, f). Kromě toho malá populace nádorových buněk vykazovala společné barvení jak pro CEACAM5, tak pro vimentin (obr. 6f). Tyto buňky, které jsou pozitivní na oba proteiny, mohou představovat buňky v hybridním stavu EMT / MET.33 TMA sestávající z plicních metastáz od 25 pacientů s karcinomem prsu také prokázala inverzní korelaci mezi barvením CEACAM5 a vimentinem (obr. 6g, h; doplňkové obr. 12a–e). Tyto výsledky potvrdily závěry provedené s našimi modely PDX TNBC a prokázaly, že exprese CEACAM5 je nepřímo korelována s expresí vimentinu u primárních nádorů prsu a metastatických lézí. Celkově tyto výsledky naznačují, že CEACAM5 podporuje MET k usnadnění růstu nádoru v metastatických místech (Doplňkový obrázek 12a, b).
