Všechny metody v lidské a zvířecí studie byly provedeny v souladu s příslušnými institucionálními pokyny a předpisy.

Izolace a kultury z plastu přilnavé Msc a CD271 immunopositive MSCs z tukové tkáně

Po etické schválení od Národní Zdravotní Služby (NHS) Výzkum Zdraví Orgánu (LREC číslo 12/EE/0136) a informovaný souhlas od všech dárců, PA Msc a CD271+ MSCs byly izolovány z V, které byly sklizeny jako chirurgický odpad. At byl mletý a ošetřen 0.3 U/ml kolagenáza (Sigma, Dorset, UK) po dobu dvou hodin při 37 °C po kterém Dulbecco ‚ s Modified Eagle Medium (DMEM) s přídavkem 20% (v/v) fetální telecí sérum (FCS) a 1% (v/v) penicilin a streptomycin (Všechny z PAA, Yeovil, Somerset, velká BRITÁNIE) byl přidán a stravitelné příprava odstředěny při 600 g po dobu 10 minut. Výsledná peleta byla znovu suspendována v DMEM doplněném o 10% (v/v) FCS a 1% (v/v) penicilin a streptomycin, tj. Filtrát byl znovu odstředěny při 600 g po dobu 10 minut a pelet buněk se resuspenduje v 5 ml standardní kultivační médium a prošel 40 µm mobilní sítko. Výsledná suspenze buněk se pak zpracuje s Erytrocytů Lyzačního Pufru (Miltenyi Biotech, Surrey, UK) po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Pro každého PŘI přípravě, MSCs byly izolovány z mononucleated buněk přítomných po lýze erytrocytů přes jejich zvýšenou přilnavost k tkáňové kultury plastic8 nebo magnetické souborům třídění buněk (MACS) pro CD271 immunopositivity14. Tyto buňky byly kultura rozšířená ve standardním kultivačním médiu ve zvlhčené atmosféře při 37 °C s rutinní passaging tím, trypsinisation na 80% konfluence. Pro všechny následné experimenty byly použity pa MSC a CD271+ MSc v pasážích II-III. Průtoková cytometrie byla použita k posouzení obohacení pro CD271+ buněk (pomocí MACS technology), kde čerstvě izolované buňky byly skladovány při -80 °C přes noc po izolaci, a pak rozmraženy a okamžitě immunostained pro CD271; pro všechny vzorky, >90% buněk, byly CD271 immunopositive v této době bod (data nejsou zobrazena).

In vitro diferenciace protokoly

diferenciace kapacity PA a CD271+ MSCs tvořit osteocyty, chondrocyty a adipocyty byla hodnocena, jak je popsáno previously8,45. Krátce, pro osteogenesis, jednovrstevné kultury MSCs byly ošetřeny s 10 nM dexamethasonu, 50 ng/ml kyseliny askorbové a 1 mM beta glycerofosfát (oproti dopravce kontroly) každé 2-3 dny po dobu 4 týdnů, po které kultury byly sklizeny pomocí fixace a barevné pro aktivity alkalické fosfatázy takto: buňky byly fixovány 10% neutrální nárazníkové formalínu po dobu 10 minut. Mezitím byl barvicí roztok připraven umístěním 25 mg naftol-fosfátu (naftol AS – MX fosfát: Sigma) do 0,5 ml dimethylformamidu. Tento roztok byl smíchán s 50 ml 0,2 M Tris-HCl pufru obsahujícího 50 mg rychle červené TR (Sigma). Po dobrém promíchání byl konečný roztok filtrován pomocí filtračního papíru Whatman č. 1 (Whatman). Fixační roztok byl poté odstraněn a buňky byly promyty PBS, pak 1 ml barvicího roztoku bylo přidáno do každé jamky pro 1 hr. Konečně, skvrna byla odstraněna a digitalizované snímky byly pořízené inverzní mikroskop. Diferenciace podél osteogenní linie byla dále hodnocena zvýšené množství aktivity alkalické fosfatázy v diferencovaných buněk ve srovnání s nediferencované buňky pomocí komerčně dostupného kitu (Biovision, USA) a podle výrobce je protokol; stručně řečeno, buňky byly homogenizovány v testu vyrovnávací paměti. Homogenizované buňky se potom odstředí, aby se odstranil nerozpustný materiál při 13 000 g po dobu 3 minut. Poté bylo 80 µl každého ze vzorků naloženo do samostatných jamek 96 jamkové desky. Poté bylo do každé jamky vzorku přidáno 50 µl 5 mM roztoku pNPP. Po mísícím kroku pipetováním nahoru a dolů byly jamky inkubovány při 25 °C po dobu 60 minut. Standardní křivka byla vytvořena zředěním 40 µl 5 mM pNPP do 160 µl assay buffer generovat 1 mM pNPP standard. Pak 0, 4, 6, 12, 16 a 20 µl tohoto standardu roztok byl vložen do 96 dobře deska generovat 0-20 nmol/ml pNPP normy, která by mohla být měřena pomocí spektrofotometrie. Pro chondrogenezi byly buněčné pelety připraveny v DMEM / vysoké glukóze (Sigma) doplněné 100 nM dexamethasonem (DEX), 37.5 µg/ml solution-2-fosfát, 1% (obj./obj.) inzulínu, transferinu a selen (JEHO-X100; Sigma) a 10 ng/ml transformující růstový faktor-β1 (TGF-β1) (PeproTech, Londýn, spojené KRÁLOVSTVÍ), a penicilin a streptomycin. Kontrolní kultury byly ošetřeny médiem DMEM / s vysokým obsahem glukózy samotnými nosiči, tj. methanolem, sterilní vodou a BSA ve vhodných ředěních. Na den 28, chondrogenic diferenciace byla zkoumána histologicky upevnění pelet do 10% neutrálního pufrovaného formalínu, poté zalitím do parafínu a řezání tkáňové řezy, které byly barveny toluidinovou modří (Sigma) jako marker proteoglykan synthesis8. Kromě toho byla pomocí testu DMMB měřena hladina glykosaminoglykanu vylučovaného do diferenciačního média za posledních 24 hodin kultury před sklizní v den 28. Protokol testu DMMB byl upraven z metody Farndale et al., 1986 následovně: i) roztok barviva DMMB byl připraven přidáním 3.04 g glycinu, 2.37 g NaCl a 16 mg 1,9 DMMB na 1 litr deionizované vody; (ii) pH bylo upraveno na 3,0 kyselinou chlorovodíkovou a roztoku barviva byla uložena v hnědé láhvi; (iii) 50 µl kultivačního média sklizené z buňky nasazený lešení na den 28 byly přidány v trojím vyhotovení na 96 dobře desky; (iv) 200 µl DMMB roztoku barviva bylo přidáno do kultivačního média a absorbance byla hodnocena na 540 nm, ihned. Chondroitin sulfát (CS) ze žraločí chrupavky (Sigma) byl použit k vytvoření standardní křivky absorbance (0-40 µg/ml, CS), ze které byl vypočítán obsah GAG ve vzorcích kultivačního média. Úrovně absorbance pro GAG obsahu ve vzorcích kultivačního média byly normalizovány na účet pro pozadí absorbance plynoucí z přítomnosti fenolové červeně v médiu rozpuštěním standardů v DMEM médiu. Pro adipogenezi byly MSc kultury udržovány v kultivačním médiu obsahujícím 1 µM DEX, 0.5 mM 3-isobutyl-metylxantinové (Sigma), 1% inzulin, transferin a selen (- X 100 pre-mix; PAA) a indometacin 100 µM (Sigma) po dobu 28 dní při 37 °C a 5% CO2, jako dříve described47. Kontrolní buňky byly udržovány v kompletním médiu s nosiči. Diferenciace byla zkoumána pomocí olejově Červené O barvení lipidových kapiček. Buňky byly fixovány v 10% neutrálním pufrovacím formalinu po dobu 1 hodiny, po které byl přidán barvicí roztok. Relativní Oil Red O akumulace byla měřena po ošetření se 100% isopropanolu po dobu 15 minut a čtení absorbance supernatantu při 540 nm pomocí spektrofotometru.

transplantace MSC do stehenní osteochondrální defekt model

Následující institucionální etické přezkoumání a schválení (Institucionální Animal Péče a Používání Výbory Fukui University, Oddělení Ortopedie a Rehabilitačního Lékařství: Číslo Schválení 25-053), žena pokusným nude potkanů (F344/N Jcl rnu/rnu, CLEA Japonsko, Inc. Tokyo, Japonsko) ve věku 6-10 týdnů a váží 150 až 170 g byli náhodně rozděleny do následujících skupin: (i) PA Msc (n = 6 zvířat); (ii) CD271+ MSCs (n = 6 zvířat); (iii) kontrolní skupina Alfa Chondro Štít lešení sám (ne buňky, n = 3 zvířata). Tyto počty zvířat na skupinu byly dříve použity ve stejném ústavu k prokázání významných rozdílů mezi léčebnými skupinami na úrovni 5% 48. Krysy byly anestetizovány expozicí 3% isofluranu v plynu O2 a udržovány na 1,5% isofluranu v plynu O2 během chirurgického zákroku. Po sterilizaci kolena pomocí 70% ethanolu, mediální parapatellar kožní řez byl proveden následuje pitvat přes sval a pak vystavovat kolenního kloubu po laterální dislokace čéšky. Bilaterální osteochondrální defekty o průměru 2 mm a hloubce 1 mm byly vytvořeny v patelární drážce stehenní kosti každého zvířete pomocí chirurgického vrtáku o průměru 2 mm. Alfa Chondro štít byl použit jako buněčný nosič / lešení k dodání 5 × 104 PA MSC nebo CD271+ MSc versus žádné buňky (jako kontroly). Před transplantací, buňky byly sklizeny pomocí trypsinisation a nasazený v objemu 10 µl standardního kultivačního média do 2 mm v průměru, disky Alfa Chondro Štít, pak inkubovány ve zvlhčené atmosféře při 37 °C a 5% CO2 po dobu 30 minut, aby podporovaly mobilní dodržování a začlenění do lešení. Buňky nasazený a kontrolu lešení byly transplantovány do vady a upevněny na místě s fibrinové lepidlo, které bylo umožněno nastavit dobu asi 10-20 sekund (Obr. 6). Patella byla přemístěna a pojivová tkáň a kůže sešita nylonovými stehy. Zvířata se po zotavení mohla volně pohybovat a krmila standardní udržovací dietou a vodou ad libinum. Po 3 týdnech po transplantaci, zvířata byla obětována předávkování 3% isofluranu zkoumat rozsah hojení rány makroskopicky a histologicky.

Makroskopické bodování chrupavky hojení ran

Po vystavení kolenního kloubu v obětovali zvířata, vada byla hodnocena makroskopicky tím, že dva chirurgové, kteří byli oslepeni na rameni pomocí zavedeného systému pro hodnocení chrupavky hojení ran v menších zvířat models49. Stupeň opravy tkání byla hodnocena od 0 bodů (nejlepší výsledek) až 4 body (nejhorší výsledek) pro: (1) barva opravy tkáně; (2) rozsah cév vidět v rámci opravy tkáně; (3) hladkost povrchu opravy tkáně; (4) rozsah, v němž rány vada byla naplněna opravy tkáně; (5) rozsah degenerace přilehlého kloubní chrupavky. Byly přidány body za každé kritérium a stupeň nejlepší opravy byl reprezentován nejnižším skóre z celkového skóre 20.

Histologické bodování chrupavky hojení ran

Po chirurgické excizi, zvířat kolena byly fixovány v 10% neutrálním pufrovaném formalínu (Sigma) po dobu 48 hodin a je umístěna v K-CX odvápňuje řešení (FALMA, Tokio, Japonsko) po dobu 24-48 hodin při 4 °C. Poté byla krysí kolena přes noc promyta tekoucí vodou z vodovodu, zpracována a vložena do parafínových voskových bloků připravených k krájení. Tkáňové řezy byly sníženy na 5 mikronů tloušťky standardní rotační mikrotom a tyto byly obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E) a toluidinovou modří před montáží v DPX a histologické vyšetření. Rozsah a kvalita opravy chrupavky byla histologicky a nezávisle hodnocena dvěma zkoušejícími pomocí bodovacího systému Wakitani36, upraveného tak, aby zahrnoval dva další parametry, tj. zkoumat přítomnost krevních cév a cizích těles obřích buněk (FBGCs). Proto, bodovací systém se skládá ze sedmi různých parametrů: (1) morfologie buněk; (2) matrix barvení; (3) povrch správnosti; (4) tloušťka chrupavky; (5) integrace opravy tkáně s hostitelskou chrupavky; (6) rozsah vaskularizaci v rámci vada; (7) rozsah FBGC reakce. Pro každý z těchto parametrů představovalo nejnižší skóre (0) „nejlepší“ opravu a nejvyšší skóre (4) „nejhorší“ opravu. Celkové skóre bylo přidáno a poté porovnáno mezi skupinami z celkového skóre 21.

Imunohistochemie pro lidskou mitochondriální antigen

Tkáňové řezy byly obarveny s anti-lidské mitochondriální antigen (HMA) protilátky (Klon 113-1: Abcam, Cambridge, UK) k posouzení přítomnosti lidských MSCs. Následující antigen retrieval, oddíly byly ponořeny do tři změny PBS a blokovány po dobu 20 minut s 2,5% koňského séra (Vector Labs Ltd) při pokojové teplotě, aby se zabránilo nespecifické vazbě. Sekce byly poté inkubovány s myší anti-HMA protilátkou (1:400 ředění v PBS) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě ve zvlhčené komoře. Poté byla jakákoli nevázaná protilátka jemně promyta třemi změnami PBS a sekce byly inkubovány s biotinylovaným anti-myším IgG po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Řezy byly promyty třikrát v PBS a endogenní peroxidizační aktivita byla blokována použitím 0,3% peroxidu vodíku v methanolu po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Během tohoto inkubačního kroku byl vecta ABC regent (Vector Labs Ltd, Peterborough, UK) připraven a byl ponechán stát 30 minut před použitím podle pokynů výrobce. Po blokování endogenní peroxidizační aktivity byly řezy promyty třikrát PBS a inkubovány s ABC činidlem po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Poté byl přidán chromogen DAB (Vector labs) po dobu 6-8 minut v závislosti na požadované intenzitě barvy. Sekce byly poté promyty a dehydratovány sérií ethanolu (70-100%), vyčištěny xylenem a namontovány v Pertexu. Chondrogenní pelety lidských MSc byly použity jako pozitivní kontrola. Negativní kontrola zahrnovala chondrogenní pelety, kde byla primární protilátka vynechána.

Skenování elektronové mikroskopie

adhezi MSCs nasazený do Alfa Chondro Štít lešení před implantací byla zkoumána pomocí skenovací elektronové mikroskopie (SEM) takto: poté, co mobilní nasazený lešení byly inkubovány ve zvlhčené atmosféře při 37 °C a 5% CO2 po dobu 30 minut, byly promyty v PBS a následně fixovány ve 2% glutaraldehyd v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 7.4) po dobu 2 hodin, potom se promyje v 0.1 M fosfátový pufr před ošetřením 1% tetraoxidem osmiem po dobu 1 hodiny. Vzorky byly poté dehydratován prostřednictvím odstupňované řady roztok ethanolu, léčených přechod rozpouštědla, t-butyl alkoholu po dobu 30 minut, zmrazení-sušené, potažené zlato, palladium a nakonec zobrazen pomocí JSM-6390 (JEOL, Tokio, Japonsko) nebo Zeiss EVO10 rastrovací elektronový mikroskop (Carl Zeiss, Cambridge, UK).

LIVE/DEAD barvení pro stanovení životaschopnosti buněk v buňky nasazený lešení

MSC nasazený lešení byly obarveny pomocí LIVE/DEAD barvení řešení následující výrobce protokolu, jak je popsáno previously8. Stručně řečeno, mobilní nasazený lešení byly ponořeny v LIVE/DEAD barvení roztoku po dobu 30 minut ve tmě při 37 °C. Na lešení byly pak odstraněny z barvicí roztok, promyty v PBS a okamžitě zobrazen pomocí konfokálního mikroskopu (Leica Microsystems DM6000B – SP57CS).

testy angiogeneze in vitro

lidské EA.hy926 endoteliální buněčné linie byl použit jako model k prozkoumání jakékoli angiogenní aktivita kultury podmíněné střední z PA MSC a CD271+ MSC CM. EA.hy926 proliferace/migrace endotelových buněk a tvorba endotelových tubulů byly zkoumány následovně: (i) EA.hy926 buňky byly kultivovány ve standardním kultivačním médiu (DMEM/ F-12 doplněným 10%FBS, 1% penicilin a streptomycin) 24 no desek na 2 dny do 100% konfluence monovrstvy vytvořené. Sterilní špička pipety byla použita k vytvoření poškrábání v monovrstvě. Následně byly jamky promyty sterilním PBS a poté byl do každé z trojitých jamek přidán 1 ml upraveného média z kultur PA MSC nebo kultur CD271+ MSC za testovanou podmínku. Jako kontrola bylo použito kultivační médium bez séra DMEM. Deska byla inkubována v Buňce IQ platforma pro živé buňky digitálních fotografií přes 2 den období, po které nuly uzavření rány, životaschopných buněk čísla a rozsah migrace z individuální buňky byly kvantifikují pomocí Mobilní IQ analýzu obrazu software. Proliferativní odpověď EA.hy926 endoteliální buňky na PA MSC a CD271+ MSC podmíněné médium (versus kontrolní médium bez séra)byl také zkoumán pomocí testu MTT; (ii) EA.hy926 endoteliální tubulu tvorba byla testována pomocí růstového faktoru-snížení Matrigel (BD Bioscience), který byl aliquoted do 96jamkové destičky (50 µl Matrigel/no) a pak inkubovány po dobu 30 min při 37 °C. EA.hy926 endoteliální buňky byly nasazeny na Matrigel na 2 × 104 buněk na jamku ve 200 µl PA MSC a CD271+ MSC podmíněné média nebo bez séra kontrolní kultivační médium. Destičky byly inkubovány při 37 °C po dobu 1 dne, poté byly zobrazovány pomocí zobrazovací platformy Cell IQ (3 obrázky na jamku). Celková délka endoteliálního tubulu / obraz a celkový počet bodů větvení endoteliálních tubulů / obraz byly měřeny pomocí softwaru cell IQ image analyser.

Statistická analýza

Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru GraphPad Prism6 (GraphPad Software, Inc. CA, USA). Pro pokusy in vivo bylo testováno minimálně N = 3 zvířata na podmínku. Pro in vitro experimenty byly provedeny n = 3-4 nezávislé experimenty pro všechny analýzy, kde byla data analyzována jednosměrnou ANOVA, když byl jeden variabilní faktor, a obousměrnou ANOVA, když byly dva variabilní faktory. Pro makroskopické a histologické skóre opravy chrupavky, rozdíly mezi skupinami byly zkoumány pomocí Dunnových vícenásobných srovnávacích testů. Hodnota p menší než 0,05 byla považována za významnou. Všechny údaje byly prezentovány jako prostředky ± sem nebo prostředky ± SDs (jak je uvedeno v legendách obrázku).