디자인을 공부

VX-765 연구:Five-month old 차량 주입 중량(WT+차량;n=18)및 J20 쥐(J20+량:n=14), 고 VX-765-injected J20 쥐(J20+VX-765:n=13)쥐 세로 방향으로 평가에서 다섯 다른 시점:초기 치료(기준선 치료되지 않는 J20 었 함께 그룹화; 치료 1),2 주 동안 6 회의 추가 주사 후(치료 2),4 주 세척 기간 후(치료 3),1 주 동안 3 회의 추가 주사 후(그림 1). 1). 실험된 모든 동물은(가)실험 중에 동물이 사망하거나(나)동물이 행동적으로 반응하지 않는 한 분석에 포함되었다. 총 25 새끼,4 개의 다른 코 호트에 걸쳐 확산 하 고 다른 시간에 테스트,사용 되었다. 이 코호트 중 3 명은 코호트 4 가 반스 메이즈에 사용 된 반면,오픈 필드 테스트를 거쳤습니다. 동물 행동 적자 했다 확인 하기 위해 기준 테스트 했다 후 20 동물 행동 적자의 차량 또는 765 치료에 무작위로 할당 했다. 사용 된 모든 동물 중 4 마리의 쥐 20 마리는 실험 초기에 행동 적자를 보이지 않았으며 사용되지 않았습니다. 실험 기간 동안 두 개의 제이 20+차량 마우스가 전혀 움직이지 않았으며 행동 데이터는 제외되었습니다.; 그러나,이 동물은 유지되었고 여전히 사후 분석에 사용되었습니다.이 연구에서는 생쥐가 생쥐의 생쥐를 관찰할 수 있도록,생쥐의 생쥐가 생쥐의 생쥐를 관찰할 수 있도록 하였다. 73 마리의 생쥐가 사용되었으며(엔=유전자형 당 12-13,6 개의 다른 유전자형),모두 35 명의 기증자 암컷으로부터 체외 수정(체외 수정)을 통해 사육되었습니다. 번식 세부 사항은 아래의 동물 연구 섹션에 설명되어 있습니다. 모든 생쥐는 생후 7 개월에서 8 개월 사이에 행동 평가를 받았으며 어떤 동물도 본 연구에서 제외되지 않았습니다.모든 생쥐는 생후 8 개월에 희생되고 처리되었다. 행동 점수는 마우스 유전자형 및 치료에 눈을 멀게했고 모든 동물은 생화학 적 또는 조직 학적 분석을 위해 무작위로 할당되고 맹목적으로 분석되었습니다.모든 동물 절차는 캐나다 동물 관리 지침에 따라 진행되었으며 맥길 대학교 동물 관리위원회의 승인을 받았습니다. 제 20 형질 전환 마우스 라인(잭스 재고 번호. 006293,잭슨 연구소,바 하버,ME,미국)을 표현하는 스웨덴(670/671KM→co.kr)과 인디애나(717V→F)인 앱 돌연변이 아래에서 PDGF-ßpromoter. 수컷 생쥐는 육종가로 사용되었고 그들의 정자는 체외 수정 식민지 확장에 사용되었습니다.꼬리 생검에 의해 유전자형이 결정되었습니다. 마우스는 12 시간 역광/암흑주기 및 제어 된 환경 조건 하에서 표준 마크로 론 케이지에서 그룹 보관(케이지 당 2-4 마리)되었다. 음식과 물 사용 가능한 광고 헌금했다.또한,이 약들은 10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속되며,10-15 일 동안 지속된다. 그 결과,마우스는 더 이상 사용되지 않습니다.혈액-뇌 장벽 투과성 분석 5 개월 된 이소 플루 란으로 마우스를 마취하고 오른쪽 경동맥을 분리 하였다. 경동맥 벽을 따라 작은 절개를 만들고 마이크로 카테터를 내부 경동맥 입구에 삽입했습니다. 카테터는 봉합사 실을 사용하여 제자리에 고정되었습니다. 또한,투여 후 10-120 분 동안 투여 한 후 10-120 분 동안 투여 한 후 10-120 분 동안 투여 한 후 10-120 분 동안 투여 한 후 10-120 분 동안 투여 한 후 10-120 분 동안 투여 하였다. 마이크로 카테터를 확산을 허용하기 위해 추가로 5 분 동안 방치 한 후 심장 내 천자에 의해 혈액을 수집했습니다. 마우스 경 심 얼음 차가운 식 염 수와 관류 하 고 해 마와 피 질 밖으로 해 부 했다. 샘플은 액체 크로마토 그래피 및 탠덤 질량 분석 분석을 위해 바이오 제약 플랫폼(몬트리올 대학교)으로 보내졌습니다.행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석,행동 분석: 운동 활성은 2100 자동 추적 시스템을 사용하여 측정되었습니다. 마우스는 오픈 필드 챔버(40,000,000,000 40 센티미터 플렉시 유리 상자,아니 천장,흰색 바닥)에 배치하고 5 분 동안 탐색 할 수 있었다.새로운 물체 인식(도):마우스를 5 분 동안 열린 필드 챔버에서 두 개의 동일한 물체에 미리 노출시켰다. 사전 노출 2 시간 후,마우스를 챔버에 다시 넣고 5 분 동안 하나의 친숙한 물체와 하나의 새로운 물체에 노출시켰다. 마우스는 다른 테스트 세션에 걸쳐 한 번만 특정 개체에 노출 하 고 새로운 개체 배치 각 치료 그룹 내에서 균형을 했다. 테스트 단계 및 차별 지수((#터치 소설−#터치 익숙한)/총 터치)동안 소설 개체의 백분율 터치 평가 했다.반스 미로:반스 미로 플랫폼(직경 91 센티미터,바닥에서 90 센티미터 상승)은 20 개의 구멍(직경 5 센티미터)으로 구성되었습니다. 움푹 들어간 탈출 상자로 이어지는 하나의 목표 구멍을 제외한 모든 구멍이 차단되었습니다. 공간 단서,밝은 빛 및 백색 잡음은 각 세션 동안 탈출을 찾기 위해 마우스에 동기를 부여하는 데 사용되었습니다. 적응 단계를 위해,각 마우스는 60 초 동안 플랫폼을 탐험했다.탈출 상자를 찾지 못한 모든 마우스는 그것을 안내하고 90 초 동안 거기에 머물렀다.획득 단계를 위해,각 시험은 동일한 프로토콜을 따랐으며,각 마우스가 대상을 찾고 180 초 이내에 탈출 상자에 들어가도록 훈련시키는 것을 목표로했다.마우스는 추가 60 초 동안 상자에 남아 있었다.하루에 약 15 분 간격으로 4 일 연속으로 시행되었다. 프로브 테스트(5 일)에서 각 마우스는 하나의 90 초 시험을 수행했습니다. 대상은 여전히 같은 위치에 있었지만 탈출 상자가 막혔습니다. 대기 시간 및 오류 대상에 도달,플러스 마우스 넘나들며 각 구멍(대상 환경 설정)의 수를 측정 했다. 동물을 팔 1 의 말단부에 배치하고 5 분 동안 미로를 탐험할 수 있도록 하였다. 총 팔 항목 및 3 개의 다른 팔에 연속 된 항목으로 정의 된 자발적인 교대가 기록되었습니다. 비율 교대가 결정되었습니다.면역조직화학을 위해,마우스는 이소플루오란으로 마취하고 얼음처럼 차가운 식염수로 경막 관류한 다음 얼음처럼 차가운 4%파라포름알데히드(시그마-알드리치,세인트루이스,미주리,미국)에 포스페이트-완충 식염수로 주입하였다. 두뇌는 10%중성 완충 포르말린(열 피셔 과학,미시 소거,캐나다)에서 16 시간 동안 고정 후 70%에탄올로 옮겨졌습니다. 뇌 파라핀을 포함 하 고 4 에서 절편 했다.해마와 피질을 해부하고 드라이 아이스에서 즉시 냉동시켰다. 프로 테아 제 억제제 칵테일(시그마-알드리치))조직 균질화기와 얼음(옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,옴니 인터내셔널,케네 소,조지아,미국). 샘플 원심 분리(20,000×g,4°C)20min,상등액을 복구,및 단백질 정량화 BCA 를 사용하는 방법입니다. 리파 불용성 펠렛은 70%포름산에서 추가로 추출되고,증발되고,200 밀리미터 트리스-에이치엘,산도 7.5 에서 분해된다.또한,이 물질은 면역 조직 학적 염색을 통해 면역 조직 학적 염색을 촉진하여 면역 조직 학적 염색을 촉진시킨다.0)다코 오토테이너 플러스 자동 슬라이드 프로세서 및 구상 플렉스 시스템(다코,벌링턴,온,캐나다)을 이용한 항원 회수 버퍼 및 면역 보유. 탈 파라핀 화 및 재수 화 후,과산화 효소를 처리하고,무 혈청 단백질 블록으로 차단하고,구상 플렉스 항체 희석제에 희석 된 다음 항체로 면역 보유 하였다.:1000 마우스 안티시냅토피신(시그마 알드리치 5768). 섹션 키트 제공 적절 한 마우스 또는 토끼 공액 2 차 항 체와 함께 처리 하 고 소량으로 시각화 했다. 섹션은 헤 마톡 실린 역 얼룩,탈수 및 커버슬립 퍼머 마운트(피셔 사이언티픽). 섹션은 디지털 분석을 위해 미락스 스캔으로 스캔했다(자이스,돈 밀스,에,캐나다). 탈 파라핀 화 및 재수 화 후,슬라이드를 여과 된 1%수성 티오 플라빈-에스(시그마-알드리치)로 염색 하였다.해마 영역의 피질 및 전방 부분의 양성 세포를 계측 프레임 48 의 변형 된 버전을 사용하여 정량화 하였다. 간단히 말해서,매 5 번째 슬라이드를 정량화했습니다(뇌 당 4 개의 섹션이 생성됨). 2015 년 12 월 15 일(토)~2015 년 12 월 15 일(일) 앞쪽 캘리포니아 1 영역 및 피 질에서 수치 밀도(셀 수 밀리미터−3)추정 했다. 지역당 150 의 명중의 최소한도 수는 믿을 수 있는 견적을 만들기 위하여 필요로 했다. 우리는 우리의 최소 수에 도달 할 수없는 경우 추가 섹션이 계산되었다. 정량화 치료 및 유전자형에 대 한 눈을 멀게 수행 했다. ImageJ 소프트웨어(NIH,Bethesda,MD,미국)측정에 사용되었 Aβ 축적,GFAP 및 synaptophysin immunopositive 염색 CA1 지역 및 cortex. 두뇌 당 4 개의 단면도는 분석되고,다각 심상은 캘리포니아 1 지구 및 외피를 커버하기 위하여 각 단면도에서 가지고 갔다. 임계값 스테인드 영역을 강조 하기 위해 모든 두뇌에 걸쳐 동등 하 게 조정 하 고 입자 염색의 총 면적을 결정 하기 위해 분석 했다. 결과는 분석 된 총 면적 당 염색 된 총 면적으로 표시됩니다. 대표 이미지는 크기 제약을 준수하기 위해 잘립니다 및 사후 처리를 거치지 않았습니다.단백질 샘플(25-100 개)을 램리(5%2-메르 캅토 에탄올,1 밀리미터 나노보 4,1 밀리미터 나노보 4,1 밀리미터 나노보 4,1 밀리미터 나노보 4,1 밀리미터 나노보 5 분 동안 끓인 후,폴리아크릴아미드 겔 전기영동(페이지)에 의해 분리하였다. 샘플을 다음과 같은 1 차 항체로 조사하여 트리스 완충 식염수에서 5%무 지방 분유 및 0.1%트윈-20 또는 피피 차단 완충액(열 과학)에서 희석시켰다.:2000 년 토끼 안티-네프릴리신,1:1000 토끼 안티-네프리신,1:500 토끼 안티-이데,1:1000 토끼 안티-카스파제-3(세포 신호 9665),1:1000 마우스 안티-카스파제-8(세포 신호 8592),1:1000 토끼 안티-이데,1:1000 토끼 안티-카스파제-8(세포 신호 8592),1:1000 토끼 안티-이데,1:1000 토끼 안티-이데,1:1000 토끼 안티-이데,1:1000 토끼 안티-이데,1:1000 토끼 안티-이데,또한,세포 시그널링 9504 및 1:5000 마우스 안티-카스파 제-9(세포 신호 9504)및 1:5000 마우스 안티-액틴(시그마-알드리치 5441). 또한,이 항체는 1:5000 또는 1:5000 의 항-래빗 항체(다코 아메 르샴)에 의해 검출되었다. 면역반응성 밴드는 이미지퀀트 라스 4000 이미징 시스템(미국 후지 필름,발할라,뉴욕,미국)을 사용하여 시각화되었고,이미지 게이지 분석 소프트웨어(미국 후지 필름)로 농도계 분석을 수행하였다. 이미지 전체와 동일하게 조정하여 대표 이미지를 생성했습니다. 추가 수정이 이루어지지 않았습니다. 최종 수치를 만드는 데 사용되었습니다. 웨스턴 오점의 원시 오점은 보충 그림 11 에서 사용할 수 있습니다.마우스 뇌에서 프로-및 항 염증 사이토 카인,및 제 2 차 세계 대전의 수준 메소 규모 디스커버리(록빌,메릴랜드,미국)에서 전기 화학 발광 면역 분석 키트를 사용하여 결정 하였다. 표준 및 샘플은 제조업체의 프로토콜에 따라 준비되었으며 중복으로 실행되었습니다. 10 플렉스 마우스 전 염증 패널은 마우스 해 마와 대뇌 피 질 및 샘플에 대 한 사용 되었다. 마우스 플라즈마를 측정하기 위해 단일 일리노이-1 제 1 차 키트가 사용되었습니다. 네 플렉스 인간 염증 패널은(아래 참조). 4-패널 인간 마우스 해 마와 피 질,그리고 표본에 대 한 제 10 키트에 사용 되었다.20 게이지 바늘로 균질화 한 다음 마우스 해마와 피질(그룹 당 엔=3)에서 키아 졸(키아 겐,발렌시아,캘리포니아,미국)을 추출 하였다. 이 미니 키트에는 칼럼 드나제 처리 단계가 포함되어 있습니다. 그 결과,분광 광도계(분광 광도계)는 분광 광도계(분광 광도계)에 의해 결정되었다. Five hundred nanograms of total RNA was reverse transcribed for each sample (with avian myeloblastosis reverse transcriptase (AMV-RT)) (Roche, Mannheim, Germany).

PCR and real-time PCR

HAPP transgene PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (New England Biolabs, Whitby, ON, Canada) using the following primers: (hAPP) 5′-AACACAGAAAACGAAGTT-3′ and 5′-CCGATGGGTAGTGAAGCA-3′ (480-bp amplicon)31, (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase, HPRT) 5′-GTAATGATCAGTCAACGGGGGAC-3′ and 5′-CCAGCAAGCTTGCAACCTTAACCA-3′ (177-pb amplicon) (Carcinogenesis). 제품은 레드 세이프에 시각화되었다(프로가 비오,노스 요크,에,캐나다)스테인드 2%아가로 오스 젤. 2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 유전자 증폭은 다음의 프라이머로 수행되었다:(18 초)5′-지타아크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크타크; (4)화학 물질,화학 물질 및 화학 물질. 결과 폴드 유도 값으로 표현 됩니다.학습과 기억 동안 시냅스 변화에 관여하는 84 개의 유전자와 5 개의 하우스 키핑 유전자의 발현을 프로파일 링한다(2-마이크로 글로불린;글리 세르 알데히드 3-포스페이트 탈수소 효소,갑;2-글루 쿠로 니다아제,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스 키아 겐,구스; 열충격 단백질 90 알파(세포질),세포질 단백질 90 알파,세포질 단백질 90 알파,세포질 단백질 90 알파,세포질 단백질 90 알파,세포질 단백질 90 알파,세포질 단백질 90 알파). 제조자의 프로토콜(제 1 가닥 합성 키트,키아겐)에 따라 역전사(게놈 제거 단계 포함)하였다. Real-time PCR 반응을 수행하였에 실시간 자전거 타는 사람 ABI7500(빠른 블록)(Applied Biosystems)를 사용하 RT2sybr 그린/ROX PCR master mix(Qiagen). 순환 조건은 다음과 같다:50 에서 2 분,95 에서 10 분,40 사이클,95 에서 15 초,60 에서 1 분. 임계 값 및 기준선은 제조업체의 지침에 따라 수동으로 설정되었습니다. 데이터 5 하우스 키핑 유전자의 기하 평균을 정규화 하 고 비교 하 여 분석 했다.12~16 주 된 태아 피질 조직은 맥길 기관 검토위원회의 승인 된 프로토콜에 따라 출생 결함 연구소(워싱턴 대학,시애틀,미국)에서 얻었다. 트립신과 해리된 뇌로부터 배양하고,데옥시리보뉴클레아제 1 로 처리하고,130,70 및 30 을 통해 여과하였다. 10 분 동안 분리된 세포를 원심분리하고,얼의 염과 함께 최소한의 필수 배지에 재수입하고,5%비합성된 비합성 페니실린-스트렙토마이신,1 밀리미터 피루브산 나트륨,및 2 밀리미터 엘-글루타민(인바이트로젠,칼스배드,캘리포니아,미국)으로 보충하였다. 폴리−엘−라이신-코팅 6-웰 조직 배양 플레이트(시그마-알드리치). 매 2 일마다 멤 배지를 변경하고 처음 4 일 동안 플루오로 데 옥시 유리딘(1 밀리미터,시그마)항 정신병 치료로 성상 세포 증식을 제한했습니다. 신경 배양 7-10 일 실험을 실시 하기 전에 성장 했다. 다른 시간에 4 개의 다른 신경 준비를 테스트 했다. 뉴런 제제 중 하나는 안정적이지 못했고,어떤 약물도 받지 않은 혈청+대조군을 포함한 배양은 실험 중 사망했다. 따라서,3 개의 유전자 다른 기증자에서 3 개의 다른 신경 준비를 사용 했다.또한,이 약물은 다른 약물보다 더 많이 투여 될 수 있으며,이 약물은 다른 약물보다 더 많이 투여 될 수 있습니다. 뉴런들을 72 시간 동안 25-200 회 또는 0.1%(사용 된 최고 농도)로 처리 하였다. 포르 마잔 결정을 100 에 용해시켰다. 흡광도는 시너지 4 판 판독기를 사용하여 560 및 670 나노미터에서 측정되었다.축삭 변성은 형질 감염 또는 혈청 박탈 스트레스에 의해 유발되었다. 전처리 전략(스트레스 요인 1 시간 전)또는 비드 후 치료 전략(스트레스 요인 48 시간 후)으로 투여되었습니다. 신경 세포는 유전자 총(바이오 라드,미시 소거,캐나다)에 의해 형질 전환되었습니다. 그 결과,뉴런(뉴런)은 신경 세포(뉴런)에 의해 변형되었다. 신경세포는 신경세포의 신경세포에 의해 생성되고,신경세포는 신경세포에 의해 생성되고,신경세포는 신경세포에 의해 생성되고,신경세포는 신경세포에 의해 생성되고,신경세포는 신경세포에 의해 생성되고,신경세포는 신경세포에 의해 생성되고,신경세포는 신경세포에 의해 생성되고,신경세포는 신경세포에 의해 생성되고,신경세포는 신경세포에 의해 생성된다. 2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 12 월 15 일,2015 년 백분율 신경 구슬 각 시점에서 총 수 이상의 골치 아픈 건 양성 신경 세포의 수를 계산 하 여 측정 했다. 각 조건에 대해 최소 150 개의 양성 뉴런을 계산했습니다. 세포 용해 완충액(50 밀리 헤페스,0.1%챕스,0.1 밀리 에타)에서 뉴런을 채취하여 분석 하였다.통계 분석 동물 또는 독립적 인 실험의 수와 사용 된 통계 분석(분산 분석 및 사후 비교)은 모두 그림 범례에 나와 있습니다. 모든 값은 평균으로 표시됩니다. 모든 통계 분석은 그래프 패드 프리즘 7 소프트웨어(그래프 패드 소프트웨어,라호야,캘리포니아,미국)를 사용하여 수행되었습니다.