개선 작은 규모의 지속적 재배 시스템
이 연구에서,우리는 더 발전과 응용 가능성의 작은 규모의 지속적인 시스템 재배,이전에 의해 개발되었 Klein et al. ,병렬화의 증가된 정도 및 개량한 취급 뿐 아니라 개인적인 반응기의 감시를 위해. 시스템 변경의 주요 측면은 병렬 배양 용기 세트의 증가 8 에 24 반응기 및 작업 볼륨의 감소 10 에 6.5 밀리리터. 본 시스템은 통기,매체 공급,국물 제거 및 접종 또는 샘플링에 사용되는 4 개의 고정 포트를 수용하는 맞춤형 뚜껑으로 구성됩니다(그림 1). 1). 네 개의 포트 외에,광학 막대 모양의 할 프로브는 재배 과정을 방해하지 않고 모니터링을 위해 뚜껑을 통해 삽입,이 방법으로 이전 설정의 산소 형광 센서 자리를 교체. 이전 셋업에서 일정한 재배 온도를 유지 물 목욕은,마이크로 플레이트 교반기 유닛에 융합 된 주문 제작 알루미늄 가열 블록으로 대체되었다. 이전 버전의 소규모 생물반응기 시스템은 핵분열효모 분열사카로미세스폼베를 사용하여 검증되었기 때문에,우리는 여기서 세레비시아에 배양하기 위한 개선된 배양설치를 제시한다.미디어 유입 펌프의 적절한 튜브 직경 및 펌프 속도를 선택하여 희석 속도의 조정뿐만 아니라 기본 작동 단계가 이전에 설명 된대로 수행되었습니다. 여기서,각 생물 반응기의 액체 함량의 무게는 재배의 끝에서 중량으로 결정되었으며,5 로 각각의 희석 속도를 정확하게 계산할 수 있습니다.1%편차. 배양액 및 반응기 가스상은 모두 유출펌프(도 2)를 이용하여 반응기 뚜껑의 동일한 포트를 통해 제거하였다. 1). 7.5 밀리리터 분−1 의 유출 펌프 속도는 모든 재배 실험에 사용되었다. 유출 펌프 비율은 배양기 안쪽에 경미한 부정 압력을 생성하는 먹이는 펌프 비율을 훨씬 초과하여 이었습니다. 이 압력 차이는 폭기 포트를 통한 공기의 유입을 초래했습니다. 달성 된 평균 산소 질량 전달 계수는 110 시간−1 이었고,이는 재배 과정 전반에 걸쳐 30%포화도를 훨씬 넘는 수준을 허용했다. 산도는 온라인으로 모니터링하거나 재배하는 동안 제어되지 않았다,매체의 산도로 조정 선험적으로했다 6.0,이는 최종 산도 결과 5.5 재배 국물에. 산도 원자로 및 수확 후 유출에서 매일-라인에서 측정 했다. 산도 최대한 빨리 정상 상태를 달성 하 고 반응 기 유출 물 0.1 산도 단위(데이터 표시 되지 않음)의 작은 편차를 보였다 일정 하 게 남아 있었다.2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 15 일-2013 년 12 월 포도당을 탄소 공급원으로 사용하여,바이오 매스 수율은 24.9 그램 몰−1 이었고,포도당에 대한 3 마력 탄소 수율은 0.6%씨−몰(표 1)이었다. 이 재배 모드에서,탄소의 대부분은 에탄올과 이산화탄소로 대사되었다,야생 형 에스 높은 당분 플럭스로. 세레 비시아는 알코올 발효와 강하게 관련이 있습니다. 화학 물질 배양은 성장 제한 기질의 공급에 의해 제어됩니다. 정상 상태에서,야생형 세레비시아는 일정 성장률 이하로 상당한 양의 오버플로 대사 산물을 생성하지 않으며,이는 탄소원 축적이 부족하여 임계 희석율을 나타낸다. 이 임계 희석 속도 이상으로 탄소 공급원은 반응기에 축적되고 오버플로 대사가 유발되어 에탄올,아세테이트 및 소량의 유기산과 같은 다양한 부산물이 생성됩니다. 따라서,지속적인 문화 성장 속도 바이오 매스 특정 3 마력 제품 형성 사이의 관계를 조사 하기 위해 사용 되었다. 상기 4 개의 상이한 희석율 디(에이치−1):0.04,0.09,0.17 및 0.21 은 배치 재배에서 결정된 에스. 포도 당에 바이오 매스 수율 뿐만 아니라 3 마력 수율,특정 3 마력 생산 속도 및 특정 기판 통풍 관 속도 조사 했다(그림. 표 1). 모든 관련 재배 매개 변수,즉 각각의 표준 편차를 가진 수확량 및 비율은 표 1 에 요약되어 있습니다.본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 실시예에 따른 2
Selected rates and yields for C-limited aerobic chemostat cultivations of S. cerevisiae ST938 a 3-HP yield (C-mol C-mol−1) on glucose, b biomass yield on glucose (g mol−1), c specific 3-HP production rate (mmol gCDW−1 h−1) and d specific glucose uptake rate (mmol gCDW−1 h−1) at different dilution rates for S. cerevisiae ST938. Cultivations were carried out in triplicates at 30 °C and pH 5.5 under C-limited conditions. 이는 더 높은 바이오매스 수율과 무시할 수 있는 에탄올과 글리세롤 형성에 반영된다(표 1). 게다가,0 이하 잔여 포도당의 작은 양.1 밀리미터 포도 당 제한 될 문화를 확인 하는 다른 반응 기의 유출에서 가져온 샘플에서 발견 되었다. 정상 상태 화학 물질 배양에서 발견 된 탄소 제한 조건은 3 마력의 형성을 촉진하는 것처럼 보였습니다.이 제품의 수율은 배치 배양에서 결정된 수율보다 20~25 배 높았습니다(표 1). 이것은 배치 배양에서 발효에 비해 호흡하는 동안 탄소를 에너지 형태로 더 효율적으로 변환하기 때문일 가능성이 큽니다. 흥미롭게도,의 재배. 16.6%의 가장 높은 3 마력 수율과 함께 관찰 될 수 있습니다. 2 에이). 바이오 매스의 3 마력 수율은 배치 배양에서 수율보다 10 배 더 높으며 희석 속도를 0.21 에서 0.04 시간−1 로 낮춤으로써 0.19 에서 0.43 로 두 배 이상 증가했습니다(표 1). 그 결과,3 마력의 최대 특정 생산성은 0.17 및 0 의 희석 속도로 나타났다.21 시간−1,이는 배치 배양에서 측정 된 것보다 약 4 배 더 높습니다(그림 1). 2 기음,표 1). 예상대로,특정 포도당 흡수율은 0.51 에서 2.1 로 더 높은 희석율로 증가했다. 2 차원). 이 값은 배치 모드(표 1)에서 포도당이 제한된 성장 조건 하에서 10.7 밀리몰-1 에이치−1 의 최대 특정 포도당 흡수율보다 최대 20 배 아래에 있습니다. 특정 기질 흡수율 및 바이오 매스에 대해 얻어진 값은 0 의 희석 속도로 수율합니다.2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 1 월 1 일,2013 년 그러나,이 매개 변수는 유지 보수 신진 대사가 낮은 희석 속도로 바이오 매스 수율을 감소시키는 상당한 탄소 싱크를 구성하는 한 일반적으로 디크리트 이하로 일정합니다. 의 경우 에스. 그러나,바이오매스 형성을 지향하지 않는 탄소는 3 마력과 부산물의 형성에 어느 정도 기여하고 있는 것처럼 보였다.결론적으로,서로 다른 희석 속도로 연속 배양에서 경험 한 차이뿐만 아니라 세레 비시 야생 형과 유사한 설정에 비해 3 마력을 생산하는 통합 생합성 경로가 효모 생리학에 엄청난 영향을 미친다는 것을 암시하며,이는 아마도 적응 스트레스 반응에 의해 증폭된다. 최종적으로,씨-의 최저 희석 속도로 제한 화학 물질 재배 0.04 시간−1 은 가장 높은 3 마력의 탄소 수율을 가져 왔습니다.질소와 인산염 제한 조건에서의 배양은 이전에 다른 유기체에서 다양한 토착 및 비 토착 대사 산물의 생산에 유리한 것으로 입증 되었기 때문에 수행되었다. 여기,질소(엔)및 인(피)제한에서 해당 경작 소규모 연속 재배 시스템(그림. 1)0.04 시간−1 의 세트 희석 비율로,이는 이전에 3 마력의 최고 탄소 수율을 초래했다. 효모 균주의 매개 변수 및 각 표준 편차는 표 2 에 요약되어 있습니다.표 2 의 희석 속도로 연속 배양에서 재배 된 세레 비시 아 938 의 재배 매개 변수 0.본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 따라,상기 실시예에 그러나,0.63 및 0.19 밀리미터의 범위에 있는 잔여 포도당의 작은 양은 엔-및 피-제한(표 2)하에서 검출되었다. 잔류하는 포도당 농도는 0.1 밀리미터보다 훨씬 낮았다(표 2). 17.7%와 21.1%의 3 마력의 수율을 나타냈다.,피-제한 조건에 대해 계산 된 3 마력의 탄소 수율 16.6%에 비해 피-제한 조건 하에서 상당히 높은 값을 나타냈다.(표 1,2). 2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 또한,바이오 매스의 3 마력 수율은 0.43 과 0 의 비교 가능한 값을 보였다.그러나,이러한 제한조건에서,피-제한조건의 경우,0.50 의 증가된 수율이 관찰되었다. 정량화 된 부산물의 전반적인 낮은 농도로 인해 이들은 무시할 수 있습니다(표 2). 상기 기판의 특정 흡수율(품질보증율)에 대한 값은 비교가능했고,0.61 밀리몰−1 에이치−1 의 약간 상승된 값이 엔-제한 조건 하에서 얻어졌다. 바이오 매스 수율 기판 당 밝혀 엔-및 피-제한 조건 72.4 및 75.2 그램 몰−1 의 유사한 값,각각. 78 의 바이오 매스 수율에 비해.4 지 몰−1 씨-제한된 조건에서 달성,이 값은 유사하다. 우리의 연구는 기판 당 높은 제품 수율 아래 달성 했다 이론적 근거를 지원 엔-과 피-제한 조건. 따라서,그것은 더 높은 특정 기판 통풍 관 속도 엔 제한의 경우 부산물의 최소한의 형성과 함께 궁극적으로 선호 제품 형성 나타납니다. 피 제한 조건 하에서 부산물의 최소 금액 형성 되었다,제품 합성을 선호 수 있습니다. 몇몇 변화 변화가 이산화탄소로 풀어 놓이는 탄소 낮춘 총계로 가능하게 지도한다 고 더 사색될 수 있는다.
에서 요약,chemostat 경작지에서 N 및 P-한 제한을 밝혔 증가한 3-HP 수익률 및 특정한 생산 요금에 비해 C-한 조건으로,P-제한하고 가장 높은 제품을 얻을 수 있습니다.이 연구는 다른 재배 조건 하에서 측정 된 생리 학적 매개 변수의 양도 성 및 비교 가능성을 평가하는 것을 더 목표로했기 때문에 화학 물질 배양에서 결정된 재배 매개 변수에서 얻은 재배 매개 변수를 공급 배치 모드에서 실행되는 1 리터 교반 벤치 탑 반응기로 옮겼다. 이 접근 방식의 개념은 비교 가능성을 보장하기 위해 화학 물질 및 공급 배치 배양에 대한 주요 조건 및 매개 변수를 일정하게 유지하는 것이 었습니다. 이러한 조건 구성(1)동일한 씨:피 피 제한 화학 물질 배양에 적용 비율,(2)산도 및 온도 같은 동일한 프로세스 조건,그리고(3)화학 물질에서 적용으로 동일한 특정 성장 속도,지수 피드 프로필을 통해 달성. 제품 역가를 최적화하기 위해 화학 물질 실험에서 기판 당 최대 생성물 수율을 가진 매개 변수(디=0.2014 년 11 월 31 일(토)~2015 년 12 월 31 일(일) 셋업의 기술적 제한으로 인해 0.05 시간-1 의 성장 속도로 먹이 배치 배양을 수행했으며,이는 화학 물질 배양에서 0.04 시간−1 의 세트 희석 속도에 비해 약간 높습니다. 먹이 배치 재배 성장 율을 제어 하기 위해 지 수,영양소 제한 공급 단계 다음에 바이오 매스를 생성 하는 초기 배치 단계로 구성 되었습니다. 이 단계 동안에만 기질 농도 제어 하 고 따라서 미생물 성장을 제한 했다 이후만 먹이 단계 연속 재배 시스템에서 얻은 매개 변수의 양도성 평가에 대 한 관련 된 간주 되었다. 본 발명의 실시예는 도 1 에 도시되어 있다. 도 3 에 도시 된 바와 같이,각각의 표준 편차를 갖는 대응하는 재배 파라미터는 표 3 에 요약되어있다.2018 년 10 월 1 일(토)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일) 1-벤치탑 발효기에서의 호기성 공급 배치 재배는 제한 기판과 함께 지수 공급 램프를 사용하여 탄소 또는 인을 생성한다. 검은 색 원은 바이오 매스 역가를,빨간색 사각형은 3 마력 역가를,파란색 점선은 반응기에 공급되는 포도당의 절대 양을 나타냅니다. 본 발명에 따른 바이오매스 배양에서 관찰된 바이오매스 수율은 각각 77.9 및 67.7 그램 몰−1 에 대한 씨-및 피-제한이었다. (표 2,3),바이오 매스 수율 모두에 대 한 관찰 된 표준 편차 내에 있는 동안 관찰 되었다. 3 마력에 대한 기판 당 탄소 수율은 15.9%였다. 4). 본 연구에서 결정된 3-마력 수율은 상기 기질당 탄소 수율 14%에 근접한 것으로,상기 기질당 탄소 수율 14%는 상기 기질당 탄소 수율 5.0 에서 얻어진 것으로,상기 기질당 탄소 수율 13%는 상기 기질당 탄소 수율 14%는 상기 기질당 탄소 수율 14%는 상기 기질당 탄소 수율 14%는 상기 기질당 탄소 수율 14%는 상기 기질당 탄소 수율 15%는 상기 기질당 탄소 수율 15%는 상기 기질당 탄소 수율 15%는 상기 기질당 탄소 수율 15%는 상기 기질당 탄소 수율 15%는 상기 기질당 탄소 수율 포도 당 먹이 배치 배양에서 42%의 값을 진술 하는 대장균과 연구에서 결정 했다.2018 년 10 월 1 일(토)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일) 소규모 화학 물질 및 공급 배치 모드에서 1 리터 벤치탑 반응기에서 결정된 상이한 제한 하에서 재배 파라미터의 비교. 1990 년대 초반에는 바이오매스 생산량이 증가하였다. 그러나 우리의 연구는 3 마력 탄소 수율이 25.6%증가한 것으로 나타났습니다(그림 2). 4). 바이오 매스에서 관찰 된 3 마력 수율은 각각 0.38 및 0.65 그램이었다. 에 대한 씨-제한 이것은 화학 물질 설정(그림 1)에서 관찰 된 값을 확인했습니다. 4 비). 피 제한 조건 하에서 기판 당 3 마력의 수율의 증가와 동시에 기판 당 바이오 매스 수율의 약간의 감소로 인해,바이오 매스 당 3 마력의 수율이 크게 화학 물질 실험에 비해 증가 하였다. 화학 물질에서 수행 하는 배양와 달리 에탄올 또는 글리세롤의 중요 한 축적 먹이 배치 배양에서 검출 되었다. 기음-및 피-제한 조건에 대한 폐쇄 된 탄소 균형은 관련 양의 다른(부산물)생성물이 형성되지 않았 음을 나타냈다(표 3). 부산물 스펙트럼의 이러한 차이는 포도당 당 3 마력 수율의 증가를 설명 할 수 있습니다.화학 물질에서 수행 된 배양에 비해,공급 배치 배양에서 결정된 특정 포도당 흡수율은 각각 0.75 및 0.77 의 상당히 높은 값을 나타낸다. 위에서 언급 한 바와 같이,피드 프로파일의 지수 인자에 대한 설정점은 0.05 시간−1 로 설정되었으며 0.059 시간−1 까지 다양하여 0 으로 화학 물질 실험에 비해 먹이 배치 배양에서 30-45%더 높은 특정 성장률을 보였습니다.특정 포도당 섭취 속도를 증가시킵니다. 그럼에도 불구 하 고,씨 제한 발효에 대 한 포도 당에 바이오 매스 수율 화학 물질 및 먹이 배치 재배 사이 비교 했다. 2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일,2013 년 12 월 15 일 기판 당 3 마 력 수익률 화학 물질 및 먹이 배치 재배,재배 설정에 작은 변동에 의해 유도 된 섭동에 저항 하는 강력한 재배 매개 변수 수율을 제안 사이 비교 했다. 포도 당 뿐만 아니라 잔여 인산 염,피 제한 조건에 대 한 다른 반응기에서 가져온 샘플에서 감지 되었습니다.,해당 제한에 대 한 제한 될 문화를 확인. 마찬가지로,에 대 한 다 제한 없음 잔류 포도 당 샘플에서 검출 되었다.
