국경|Degranulation 응답에서 세포 독성 쥐 림프구로 측정되는 소설 CD107a 체|면역

소개

Cytotoxic 세포는 핵심과의 싸움에서 바이러스 감염 및 암세포. 이 세포들은 세 가지 다른 경로,용해 과립의 방출,수용체-리간드 경로 또는 트레일-트레일 수용체 경로를 통해 죽입니다. 이 논문의 목적을 위해,우리는 탈과립에 초점을 맞출 것이다. 세포 독성 세포가 표적 세포를 만날 때,면역성이 있는 시냅스를 형성하는 그것에 단단히 고착합니다. 용균성 과립은 면역학 시냅스로 그 때 극화되고 표적(1)로 지시된 세포 독성 세포에서 풀어 놓입니다. 이들 과립은 퍼포린 및 그란 자임과 같은 다양한 세포 독성 매개체를 함유한다. 방출 된 퍼 포린은 표적 세포막 내에 일시적인 기공을 형성하여 그란 자임이 표적 세포로 들어갈 수 있습니다. 진입은 아마도 불완전한 기공(호)(2)을 형성하는 퍼포 린 올리고머에 의해 매개 될 것이며,그란 자임과 퍼포 린은 엔도 좀 경로(3,4)를 통해 표적 세포로 흡수 될 수 있다고 제안되었다. 이러한 제안 된 메커니즘 뒤에있는 데이터는 최근에 자세히 논의되었습니다(5). 그랜 자임이 표적 세포에 들어갈 때 카스파 제 경로가 활성화되어 세포 사멸(6,7)이 발생합니다. 이러한 세포 독성 과립의 막은 리소좀 관련 막 당 단백질 -1(램프 1)을 포함합니다. 쥐의 내강 부분은 다시 내면화되기 전에 탈과립화 후 세포막의 세포 외 측면에 일시적으로 노출된다. 따라서,107 염색 탈과립 이벤트가 발생했음을 나타낸다(9). 시르나(107)의 역할은 여전히 결정되고 있지만,시르나(107)에 대한 연구는 소포 내의 퍼포린 밀매에 필수적이라는 것을 보여 주었다. 또한 퍼포린에 결합하여 세포막으로의 삽입을 방지함으로써 세포 독성 세포를 사멸로부터 보호하는 역할을 하는 것으로 나타났다(11).세포 독성 림프구에는 두 가지 주요 유형이 있습니다. 두 세포 유형 모두 용해 과립,파스 수용체/파스 리간드 경로 및 트레일/트레일 수용체 경로의 방출을 통해 죽이지 만,이 두 세포 그룹을 활성화시키는 데 필요한 자극은 다릅니다. T 세포 인식 antigen 에 의해 제공 MHC class I 분자를 통해 자신의 활성화하 T cell receptor(TCR),동 NK cells 인식 목표 세포항원이 비록 다양한 억제 활성화 수용체. 억제 수용체는 엔케이 세포가 건강한 세포를 죽이는 것을 막는 데 중요하며,활성화 수용체는 엔케이 세포 세포 독성을 유도합니다.상기 세포 독성 능력을 측정하기 위한 출력은 표적 세포의 사멸이었다. 유세포 계측법에 의한 검출은 연구자들이 세포 독성 능력을 가진 특정 이펙터 세포를 식별 할 수있게했다. 그것의 발견부터,쥐와 인간적인 연구 결과에서 자료의 다양한 배열 간행물은 항체 107 항체 사용의 이점을 보여주는 완료되었습니다. 쥐는 백혈병 및 이식편과 같은 질병을 연구하기위한 귀중한 면역 동물 모델입니다. 숙주 질환(13),그러나 기능적 판독은 유세포 계측법에 대한 고품질의 특정 항-쥐 항체의 부족에 의해 방해 받았다. 이 논문은 쥐의 탈과립 반응의 특성 분석 및 쥐의 탈과립 반응의 생성에 대해 설명합니다.

재료 및 방법

동물

아르메니아 근친 햄스터(Cytogen 연구 및 개발 Inc. 미국)는 기관 지침에 따라 오슬로 대학 병원의 릭스 쇼 피탈 레트의 비교 의학과에 보관되었습니다. 쥐 균주는 상호 교환 적으로 사용되어 20 세대 이상 유지되었으며 노르웨이 농무부 산하 실험 동물위원회와 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물 보호를위한 유럽 협약에 의해 설정된 지침을 준수하여 보관되었습니다. 쥐는 8-12 주의 나이에 의해 사용되었다. 실험실 동물 시설은 일상적인 건강 모니터링 프로그램을 실시 하 고 유럽 실험실 동물 과학 협회 권고의 연맹의 수정에 따라 전염 성 유기 체에 대 한 테스트. 동물 실험은 노르웨이가 유럽연합 실험실 지시와 유럽연합 실험실 협약을 따르는 동물복지법에 의해 규정된 실험실 규정을 통해 규제되었다.항체는 항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체.2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 12 월 1 일,2013 년 그리고 표준 의정서에 따라 결합하는. 이러한 항체는 면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제,면역 억제제, 상업적인 반 CD107a 체에서 구입 한 AbCam(캠브리지,영국)(H4A3-FITC),eBioscience(San Diego,CA,미국)(ID48-PerCP-eFluor),그리고 수명(Seattle,WA,미국)(LS-C8580-접합). 또한,이 제품은 기능성 분석실험에 사용할 수 있습니다. Anti-FLAG 항체(M2,접합)및 anti-mouse IgG(goat polyclonal-FITC)에서 구입 한 Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,미국). 일-2 는 쥐 일-2 식 구성으로 안정적으로 형질된 중국 햄스터 난소(조)세포주의 투석된 세포 배양 상등액에서 얻은. Peridinin 엽록소-단백질(PerCP)활용 streptavidin,FITC 햄스터 polyclonal IgG isotype control,FITC 마우스 IgG1isotype control(MOPC-FITC),그리고 GolgiStop 에서 구입 한 BD biosciences(프랭클린 호수,NJ,미국). 염소 반 아르메니아 햄스터(폴리 클로 날-피트)는 잭슨 면역 연구(미국 펜실베이니아 주 웨스트 그로브)에서 구입했습니다. 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명에 따른 통제 햄스터 혈청은 유엔 면역화한 아르메니아 햄스터에서 파생되었습니다.본 발명은,본 발명은,본 발명은,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해,상기 발현 벡터에 의해 또한,본 발명에 따른 본 발명에 따른 본 발명의 실시예는 다음과 같다. 포워드 프라이머: 3′,역 프라이머:5′,역 프라이머:3′. 107 막 횡단 영역은 높은 표면 발현을 촉진하기 위해 막 횡단 단편으로 대체되었습니다. 107 단백질의 표면 발현을 검출할 수 있게 하기 위해 플래그 태그를 엔-말단에 결찰하였다. 모든 삽입 된 시퀀스 및 최종 키메라 플라스미드 구조에서 열린 읽기 프레임을 검사 하 고 생 거 유전자 시퀀싱에 의해 확인 했다.1000000000001640 배지로 6 웰 세포 배양 플레이트에 시딩하고,7.5 로 형질전환하고,37 에서 배양하였다. 상기 후겐 6 시약을 옵티멤(깁코)으로 미리 희석하고,1.5 플라스미드 및 1.5 플라스미드-에코 설치류 특이 레트로 바이러스 패키징 플라스미드(부가진#12371)와 혼합하였다. 24 시간 후 형질감염 후 상청액을 내려서 2%의 배지로 대체하고 레트로 바이러스 생산을 위해 32 로 옮겼다. 마흔 여덟 시간 후,상층액을 수확하고 필터링으로 0.2µm Filtropur S 필터(사르쉬테드)에 저장에서 -80°C retroviral 변환.105.우물당 36 개의 세포를 24-웰 세포 배양판(코닝)에 시드하고,하룻밤 사이에 10%의 신선한 배지로 배양하였다. 본 발명의 실시예에 따라,상기 제 1 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 따라,상기 제 2 실시예에 그 후,상청액을 1 시간 동안 배양한 후,상청액을 10%가 함유된 신선한 상청액 1640 배지로 대체하고,3 일 동안 배양한 후,37%가 함유된 상청액 5%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 상청액 37%가 함유된 플래그 태그의 표면 발현을 위해 검사 한 후 항체 면역화 또는 항체 스크리닝에 사용 하였다.

생성 CD107a 을 표현하는 Transfectants

chimeric 쥐 CD107a 플라스미드로 페 CHO cells. 2-메르 캅토 에탄올에 도달 할 때까지 조 세포를 완전히 배양 하였다. 2.5μg 플라스미드와 혼합 7.5µl 의 Fugene6 시약(Roche)및 추가에 cells 을 적가하였다. 2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 12 월 1 일,2015 년 10-12 일 배양 후,성장 클론을 항 플래그 항체로 스크리닝 하였다. 가장 높은 표면 수준의 플래그를 표현하는 클론 중 하나가 예방 접종에 사용되었습니다.3~10 주 된 남성 아르메니아 인 근친 햄스터는 복강 내 주사(예:106 조)에 의해 2 주 동안 일주일에 한 번 면역되었다. 첫 번째 예방 접종 후 32 일 후에 혈청을 투여하고 두 조 혈청의 표면 염색을 분석 하였다.107-깃발 형질감염제. 3 마리의 동물 중 2 마리는 양성이었고,부스팅 후 3 일 후에 비장 세포를 수확하고 두 동물에서 풀링했으며,그 중 하나는 비장 비대증이있었습니다. 108 비장 세포 및 1.4 골수종 세포를 첨가제(1 밀리미터 피루브산 나트륨,0.05 밀리미터 2-메르캅토에탄올 및 항생제/항균제)로 3 회 세척하고,90 그램에서 10 분 동안 원심분리하였다. 이 시점부터 모든 것을 유지하면서,튜브를 태핑하여 펠렛을 용해시키고,예열 된 폴리에틸렌 글리콜 1500(로슈)을 1 분 동안 부드럽게 교반하면서 한 방울 씩 첨가 하였다. 펠렛을 첨가제와 함께 조심스럽게 세척(재 현탁되지 않음)하고 밤새 배양하였다. 100%하이포잔틴-아미노페틴–티미딘(시그마)및 10%하이브리도마 클로닝 보충제(하이포잔틴–아미노페틴-티미딘)를 첨가하였다. 셀 현탁액을 96 웰 플레이트로 옮겼다. 12 일 후,성장 클론의 상등액을 유세포 계측법에 의해 시험하여 표면 항원에 존재하는 염색을 하였다.무관 한 플래그 태그 항 원 음성 컨트롤로 형질 36 세포. 특정 항체를 생산하는 12 개의 양성 클론 중 9 개는 하이포잔틴-티미딘과 하이포잔틴-티미딘이 보충된 디멤-20 을 사용하여 추가로 서브클론화되었다. 단 하나의 클론(심 1)만이 서브 클로닝 후 여전히 항체를 생성했으며 이는 한 번 더 서브 클로닝되었습니다. 햄스터에 의해 검출 된 항체(잭슨 면역 연구). 본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,본 발명의 실시예에 따라,비장으로부터 단일 세포 현탁액을 제조 하였다. 림프 구배를 사용하여 림프구를 분리 한 다음 나일론 울 칼럼을 통해 세포 및 대 식세포를 제거했습니다. 나머지 세포를 일-2 에서 밤새 배양하였다. 10%열 불활성화,1%스트렙토마이신/페니실린,1 밀리미터 피루브산 나트륨,및 50 메르 캅토 에탄올. 세포를 8-10 일 동안 재배 하였다. 농축된 엔케이 세포 또는 분류된 티 및 엔케이 세포의 생성을 위해,세포는 나일론 울 단계 후에 음의 선택에 의해 농축되었다. 그 결과,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성되고,대식세포에 대한 항체가 생성된다. 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체 및 대 식세포에 대한 항체. 세포는 4 에서 30 분 동안 염색 된 구슬로 두 단계의 음성 선택에 의해 농축되었다. 농축된 핵세포는 약 50-60%의 순도를 가지며 탈과립 연구에 사용되었다. 풍성 T 세포(79-85 로%순수성)을 추가 정한 TCR+셀을 사용하여 FACS Aria(BD 생명 과학).상기 표적세포 자극 동안 항-랫트로 염색함으로써 탈과립화 반응을 측정하기 위해,상기 표적세포의 이펙터와 야크 표적 세포를 배양하였고,상기 3 내지 1 의 비율로(달리 명시되지 않는 한)상기 심 1 맙,기타 시판되는 항-시디 107 아 항체,또는 이소타입 조절을 포함하는 배지에서 배양하였다. 항 체 자극에서 항 체 자극에 대 한 탈과 립 반응을 측정 하기 위해 우리는 평평한 바닥 96-잘 플레이트의 다양 한 농도로 코팅 사용. 다음 날,플레이트를 피피필로 세척하고 피피필로 차단하였다. 세포로부터 탈과립화를 측정하기 위해,이들을 2-3 일 동안 일-2 와 함께 분류하고 배양하였다. 96-웰 평평한 바닥 판을 밤에 걸쳐 항체로 코팅 하였다. 2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일,2015 년 1 월 1 일 세포를 세척 하 고 적절 한 표면 수용 체 쪽으로 항 체와 염색 하 고 팩스칸토 또는 생명과학(비디에스엠)를 사용 하 여 분석 했다.

크롬 릴리스 Assay

파-1 목표 세포(5×106cells/ml cRPMI)추가 3.15 분 마다 교반하면서,1 시간 동안 37,000,000,000,000 에서 배양하였다. 그 후,세포들을 2%와 함께 3 회 세척하고,105 개의 세포/밀리람베르트 당 105 개의 세포/밀리람베르트 당 105 개의 세포/밀리람베르트 당 105 개의 세포/밀리람베르트 당 3 회 세척하였다. 락 이펙터 셀 및 타겟 셀 200 의 최종 볼륨에서 지정 된 비율로 도금 했다. 코브라 자동 감마(팩커드)를 사용 하 여 측정 했다.항체는 세포 외 막 영역을 포함 하는 발현 벡터,쥐의 막 횡단 영역 8,그리고 3’터미널 플래그 태그 표면 발현(그림 1)을 감지 했다. 이 벡터는 세포 및 세포 세포로 형질 전환되었다.본 발명의 실시예에 따르면,세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 및 세포주 아르메니아 햄스터에 3 주 동안 1 주일에 1 회 안정적으로 형질전환된 조 세포를 주입하였다. 다른 클론의 상청액들은 -플래그에 대한 특이성에 대해 시험되었지만,관련성 없는 플래그-태그가 지정된 -플래그에 대해서는 시험되지 않았다.36 형질감염제 한 복제,SIM1 발견 되었습니다 바인딩에 특별히 CD107a 을 표현하는 transfectant 지만,국기 transfected control(Figure1B).

림 1

림 1. 이 항체는 항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체,항체. (1)리더 펩타이드,플래그 태그,삽입물 및 막 횡단 도메인과 함께 표식 벡터의 개략적 벡터 맵. (2)중국 햄스터의 난소를 안정적으로 형질 전환시켰다.36 개의 세포를 플래그 태그가 붙은 세포 표면 발현에 대해 테스트 하였다. 음성 대조군은 2 차 항체 단독(투명 히스토그램)입니다. (2)햄스터 대조군 혈청,심 1 상청액 또는 항-플래그 항체(미디엄 2)로 염색되었다.이 항체는 유동 세포 계측법에서 래트드 107 와 잠재적으로 교차 반응 할 수 있습니다. 항체 클론은 유세포 측정법에서 인간,쥐,마우스 및 영장류와 상호 반응 함)및 수명 생명 과학(제조업체 웹 사이트에 따르면 면역 조직 화학 및 웨스턴 블롯에서 마우스,인간 및 쥐와 상호 반응 함)에서 항체 클론을 시험 하였다. 우리의 심 1 항 체 복제 대상 세포의 존재 하에서 탈과 립 화 세포를 확인 하 고 대상(상단 패널 그림 2 에이)의 부재에 작은 배경 염색을 보였다. 클론은 표적 세포 자극(중간 패널)후 핵 세포의 가장 높은 비율을 염색했다. 그러나,또한 높은 수준의 배경 얼룩 대상 셀,불특정 바인딩을 나타내는 했다. 매우 낮은 수준의 탈과립화(있는 경우)는 클론에 의해 측정되었습니다. 이 항체의 특이성은 양성 염색에 의해 확인되었다.2015 년 10 월 15 일(토)~2015 년 10 월 15 일(일) 상기 항체 복제물(16)은 상기 항체 복제물(107)과의 교차 반응이 없음을 나타내고,상기 항체 복제물(16)은 상기 항체 복제물(107)과의 교차 반응이 없음을 나타내었다. (데이터는 표시되지 않음). 그러나,클론은 탈과립 연구를 위해 적응되지 않는 접합되지 않은 항체로서만 유효합니다. 우리의 실험실에 있는 반복한 시도는 불행히도 어떤 강한 얼룩이 지는 접합체도 제공하지 않았습니다,작은 표본 크기 및 농도가 빈약한 접합체의 원인일지도 모르더라도. 우리는 이 어원이 같은 것을 가진 기능적인 분석실험 도중 탈과립화 세포를 검출할 수 없었습니다. 결론적으로,심 1 맙은 표적 세포로 자극 한 후 탈과립 쥐 세포를 구체적으로 얼룩지게한다.2018 년 11 월 1 일-2018 년 12 월 15 일-2018 년 12 월 15 일 www.frontiersin.org 그림 2. 그 결과,자연 살생물 및 세포 내에서의 탈과립화를 측정 할 수 있습니다. ()퍼센트 탈과립화 세포는 자극으로 야크-1 표적 세포의 유무에 관계없이 항-1 항체를 사용하여 측정되었다. 4 개의 대표적인 실험 중 하나가 표시됩니다(비). 항체 클론을 이용한 세포주 염색. 버즈36 개의 세포가 관련없는 플래그 태그가 지정된 항원으로 형질 전환되었습니다.또한,상기 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 1 제 2 제 1 제 2 제 1 제 2 제 이 경우,상기 제 2 형은 상기 제 2 형에 대해 상기 제 2 형에 대해 상기 제 2 형으로 분할된다. 또한,세포 내 투여 후,상기 세포 내 투여된 세포 내 투여에 대한 투여를 실시하였다. 그런 다음 세포를 판 바인딩 된 안티-시디 3 및 안티-시디 2 또는 마우스 이소 타입 제어로 자극 하였다. 낮은 패널 자극으로 anti-CD3 및 anti-CD2 및 염색으로 SIM1isotype control(FITC 햄스터 polyclonal IgG). 항체 및 항체를 사용하여 분류 하였다. 도시 된 데이터는 세 개의 독립적 인 실험의 한 대표 실험에서 나온 것이다.판 결합 항체를 통한 북핵 수용체 활성화의 직접적인 자극은 탈과립화를 유도하는 또 다른 강력한 방법이다. 이 기능 분석 결과에서 심 1 클론을 테스트 하기 위해 우리 활성화 수용 체를 향해 항 체와 코팅 접시에 농축된 핵 세포 배양. 음수 대조군으로서,플레이트는 마우스 이소 타입 제어로 코팅되었다. 상기 제 1 항체와의 염색은 상기 제 1 항체 또는 상기 제 1 항체로 코팅된 플레이트에서 상기 제 2 항체 또는 상기 제 2 항체 또는 상기 제 2 항체 또는 상기 제 2 항체 또는 상기 제 2 항체 또는 상기 제 2 항체 또는 상기 제 2 항체 또는 상기 제 3 항체 또는 상기 제 3 항체 또는 상기 제 3 항체 또는 상기 제 3 항체 또는 상기 제 3 항체 또는 상기 제 3 항체 또는 상기 제 3 항체 또는 탈과립 세포의 비율은 플레이트가 더 높은 농도의 자극 항체로 코팅되었을 때 더욱 증가했다. 마우스 1 이소 타입 컨트롤로 코팅 된 우물에서 탈과립이 유도되지 않았습니다.우리는 우리의 심 1 항체를 사용하여 표적 세포 또는 활성화 수용체에 대한 항체로 자극 된 엔케이 세포에서 탈과립화를 분명히 보았다. 우리는 또한 세포 독성 세포에서이 확인 하 고 싶었다. 티 세포를 비장 세포로부터 분류하고 일-2 에서 2-3 일 동안 배양하였다. 그런 다음 판 바인딩 된 안티-시디 3 및 안티-시디 2 로 자극되었습니다(그림 2 차원). 2 일 및 3 일 모두에서 항-시디 3 및 항-시디 2 로 자극되었을 때 배양 된 시디 8+티 세포로부터 탈과립화를 측정 하였다. 비 세포 독성 세포 또는 자극 후 아이소 타입 컨트롤 항 체에서 더 우리의 심 1 항 체의 특이성을 보여주는 탈과 립 측정 했다.

Lymphokine 활성화한 킬러(LAK)세포를 만들었을 배양하여 NK 세포에서 일리노이-2 7-10 일은 일반적으로 사용되는 매우 강력한 이펙터 세포에서 릴리스 크롬 분석 실험을 연구하는 세포 독성 그리고,따라서 생성 할 수 있어야한 높은 수준의 degranulation. 락 세포에서 탈과립을 측정하기 위해,우리는 처음에 사용 1:1 대상에 대한 이펙터의 비율 그러나 예기치 않게 낮은 수준의 탈과립(데이터는 표시되지 않음)을 발견했습니다. 그러나 최적의 이펙터 대 표적 비율을 찾기 위해 적정을 수행하면 이펙터 대 표적 비율이 1 미만일 때 탈과립 수준이 증가 할 수 있습니다(그림 3). 따라서 탈과립 분석을위한 최적의 비율은 세포 독성 분석과는 대조적으로 세포 독성 수준이 더 높은 이펙터로 증가합니다.2018 년 10 월 15 일(토)~2018 년 10 월 15 일(일)www.frontiersin.org 그림 3. 낮은 이펙터:대상 비율은 쥐와 탈과립 분석 실험에서 적절 한 감도를 보장 하는 것이 중요 합니다. (1)다른 이펙터에서 야크-1 표적에 대해 일-2 에서 8-10 일 배양 된 락 세포의 탈과립화:표적 비율. (나)야크-1 표적 세포에 대한 일-2 배양 락 세포독성을 8-10 일에 완료된 크롬 방출 분석으로 확인하였다. 모든 그래프는 막대를 보여주는 세 개 이상의 별도의 실험의 누적됩니다.우리는 현재 문헌(12,16,17)에 기초하여 표적보다 더 많은 이펙터 세포쪽으로 기울어지면서 표적 비율에 대한 작은 범위의 이펙터를 선택했다. 이펙터 대 표적 세포 비율은 종이마다 다를 수 있지만,이펙터 대 표적 세포 비율을 적정 한 이전 연구에서는 마우스 대 표적 세포로부터의 최적 탈과립화가 4.5:1 의 비율로 정점에 도달 한 것으로 나타났습니다.:1 (12). 그러나,대상 비율 이펙터의 더 큰 범위를 사용 하 여,우리는 쥐 락 세포를 사용 하 여 탈과 립 보다 효과적으로 유도 했다 이펙터 셀 당 4 개 이상의 대상을 사용 하는 경우 보여줍니다. 최적의 이펙터:쥐와 다른 종 사이의 표적 비율의 이러한 차이는 상기 연구에서 인간과 마우스 이펙터 대 표적 비율 적정이 동일한 종에서 유래 한 표적 세포를 사용함에 따라 사용되는 표적 세포의 유형에 기인 할 수있다. 이펙터 세포는 동일한 종의 표적 세포에 더 민감 할 수 있으므로 활성화되기 위해 더 적은 표적 세포가 필요합니다. 이 연구는 쥐의 세포 독성을 자극하기 위해 수년 동안 표준이었던 마우스 티 세포 림프종입니다. 우리는 쥐 표적 세포를 사용 하 여 북한 세포의 강한 자극 귀 착될 것 이라고 하 고 이후 적은 대상 세포 탈과 립 유도 하는 데 필요한 수 있습니다 제외할 수 없습니다.또한 이 연구에서 세포 독성 분석에 사용되는 이펙터 대 표적 비율은 이펙터 세포에서 최적의 탈과립 반응을 측정하는 데 필요한 비율과 잘 상관 관계가 없다는 것이 분명합니다. 이 두 가지 분석에 대한 판독이 다르기 때문에 세포 독성은 표적 세포 사멸을 측정하고 탈과립은 표적에 대한 핵 반응을 측정하는 것은 놀라운 일이 아닙니다.결론적으로,우리는 쥐에 대한 항체를 제기하고 쥐의 세포 독성 림프구에서 탈과립화를 검출하는 능력을 특징으로했다. 우리는 심 1 은 탈과 립 셀에 특정 하 고 탈과 립 프로토콜의 최적화를 통해 우리 결정 이펙 터를 사용 하 여:대상 셀 비율 1 보다 낮은:4 락 세포의 최적의 자극을 보장 합니다. 쥐 림프구의 세포 독성 반응의 더 나은 분석 그리고 특성을 허용하고 쥐의 많은 질병 모형에 있는 귀중한 공구 일 것입니다.이 연구는 노르웨이 국립 동물 연구 기관의 승인을 받았습니다(허가 번호:신분증-1698).원고의 발현 분석,기능 분석 및 작성을 담당하고 있습니다. 본 연구에서는 형질감염제의 복제 및 생성을 수행하였다. 프로젝트 계획 및 감독,그리고 원고의 작성에 참여하고있다. 엘케이는 예방접종,하이브리도마 기술,원고 작성 및 프로젝트 감독을 담당하고 있습니다.저자는 연구가 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 동물보호법 제 10 조에 따라 과학적 토론에 대한 마리트 잉 저딩 겐 덕분에.이 연구는 오슬로 대학교,노르웨이 남동부 지역 보건(2009104)및 헨릭 호만 민데 총리가 자금을 지원했습니다.2018 년 10 월 15 일(토)~2018 년 10 월 15 일(일) 오렌지 제이에스. 용혈성 핵 세포 면역 학적 시냅스의 형성 및 기능. 냇 레브(2008) 8(9):713-25. 2018 년 10 월 10 일(토)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 10 월 15 일(일)~2018 년 본 발명의 실시예에 따르면,본 발명의 실시예는 다음과 같다. Perforin oligomers form arcs in cellular membranes: a locus for intracellular delivery of granzymes. Cell Death Differ (2015) 22(1):74–85. doi:10.1038/cdd.2014.110