resultat

modulering av cellulära P107-nivåer genom kontrollerad proteolys. Vi har tidigare visat att den endogena P107, en medlem av RB-familjen av proteiner, som inte är ett naturligt substrat av SCF–Sacritrcp, kan elimineras i c33a-cervikala karcinomcellerna genom det ektopiska uttrycket av ett chimärt sacritrcp ubiquitin-proteinligas (sacritrcp-E7N) som bär en P107-bindande peptid härledd från de N-terminala 35-aa-resterna av HPV-onkoproteinet, E7 (E7N) (1). Funktionerna hos många cellulära proteiner dikteras emellertid av deras intracellulära överflöd, och inte bara av deras närvaro eller frånvaro. Hittills har det inte funnits någon tillförlitlig metod för att exakt modulera de intracellulära proteinnivåerna i däggdjursceller.

vi undersökte först om P107-nivåerna systematiskt kunde minskas genom kontrollerat uttryck av olika mängder av humana c33a cervical carcinomacellerna infekterades med ökande doser av rekombinant adenovirus som bär på utomeuropeiska-E7N eller kontroll adenovirus i 24 timmar. Infektion var 100%, även vid den lägsta dosen som användes, vilket bedömdes av uttrycket av GFP som bärs av adenoviruset i alla mottagarceller (data visas inte). Såsom visas i Fig. 1 (Övre), de endogena P107-nivåerna reducerades systematiskt till 78%, 25% och 5% av steady-state-nivåerna när C33A-celler transducerades med rekombinant adenovirus från sacritrcp-E7N vid mois på 10, 35 och 80, men inte samma doser av Ad1-kontrollvirus. Därför erbjuder den iscensatte SCF-Utomrcp-BP ett enkelt och reproducerbart hjälpmedel för att förminska det Total-belopp av uppsätta som målproteiner på definierade jämnar för att analysera doseringen verkställer på biologiska aktiviteter.

P107 associerar stabilt med cyklin A och Cdk2 genom ett bindningsställe med hög affinitet i prolifererande celler (13-15). För att undersöka om dessa P107-associerade proteiner också utsätts för målinriktad nedbrytning genom att utföra en immunoblottning i c33a-celler infekterade av Ad-F-TrCP-E7N-viruset. Såsom visas i Fig. 1 förblev de endogena cyklin A-och Cdk2-nivåerna oförändrade, medan p107 var dramatiskt nedreglerad. Dessutom påverkades inte halterna av icke-inriktat hCG-aktin av F-TrCP-E7N (Fig. 1). Detta resultat gav starka bevis för att det konstruerade äppltrcp-E7N ubiquitin–proteinligaset specifikt bryter ned riktat substrat p107, men inte dess associerade proteiner.

selektiv nedbrytning av en specifik Posttranslationellt modifierad Subpopulation av målprotein. Modifiering av ett cellulärt protein på posttranslationell nivå, såsom fosforylering, är ett grundläggande medel som celler använder för att reglera funktionen eller för att ge nya aktiviteter av proteinet. Experimentella verktyg för att dissekera funktionen associerad med en specifik posttranslationell modifieringshändelse är för närvarande begränsade. Eftersom protein knockout fungerar på posttranslationell nivå som direkt känner igen målproteiner, är en applikation att konstruera en specifik E3 som kan välja en subpopulation av posttranslationellt modifierade proteiner för nedbrytning, istället för att förstöra hela befolkningen.

HPV16 E7 befanns selektivt binda till den hypofosforylerade formen av RB (16). Vi undersökte om det chimära askorrcp-E7N ubiquitin-proteinligaset kunde skilja hypo-och hyperfosforylerad RB och endast välja hypoformen för nedbrytning. De mänskliga u2os-osteosarkom-cellerna uttrycker båda formerna av RB som lätt kan identifieras, baserat på deras olika elektroforetiska rörlighet på SDS/sida (Fig. 2A, körfält 1) (17). Identiteten hos dessa två RB-arter verifierades ytterligare genom immunoblotting med användning av antikroppar specifika för antingen hypo-eller hyperfosforylerade former av RB (Fig. 2A, körfält 2 och 3). U2OS-celler infekterades med rekombinant Ad-F-TrCP-E7N eller kontroll AD1 adenovirus för 48 h, och steady-state nivåer av RB-P och RB analyserades samtidigt genom Western blotting, med användning av en anti-RB monoklonal antikropp som känner igen båda formerna. I överensstämmelse med preferensbindningen av E7N till hypofosforylerad RB resulterade ektopiskt uttryck av F-TrCP-E7N i eliminering av hypofosforylerad RB, medan den hyperfosforylerade RB-P lämnades intakt (Fig. 2b övre, jämför körfält 4-6 med körfält 1-3). Detta resultat belyser förmågan hos det konstruerade F-TrCP–E7N ubiquitin-proteinligaset vid val av en specifik subpopulation av RB för nedbrytning, vilket baserades på statusen för viss posttranslationell modifiering av målproteinet.

HPV16 E7 i full längd kunde interagera med de cyklinberoende kinashämmarna p21Waf1 och p27Kip1, men bindningsdomänen mappades till C-terminaldomänen (rester 40-98), istället för e7n-fragmentet (rester 18-20). För att ytterligare undersöka specificiteten hos F-TrCP-E7N undersöktes också samma U2OS – cellextrakt med antikroppar mot p21Waf1 och p27Kip1. Som framgår av Fig. 2B (mitten) förblev steady-state-nivåerna för p21Waf1 och p27Kip1 oförändrade. Sammantaget demonstrerade den konstruerade F-TrCP-E7N proteolytisk specificitet mot RB-familjen proteiner, men inte andra cellcykelregulatorer såsom Cdk2, cyklin A, p21Waf1 och p27Kip1.

Strukturbaserad mutagenes för att generera ett mycket specifikt ubiquitin-Proteinligas för ubiquitin–e7n. Den chimära askorbtrcp-E7N kan fortfarande binda de endogena substraten av askorbtrcp, inklusive IKB, catenin och atf4 (3-7). Överuttryck av audrcp-E7N kan störa nedbrytningen av dessa naturliga substrat. Omvänt kan bindningen av det endogena substratet till tairtrcp-E7N störa den korrekta positioneringen av det avsedda substratet för att acceptera ubiquitin från ubiquitin-konjugerande enzym och därför minska effektiviteten för riktad nedbrytning (Fig. 3AUpper). Vidare interagerar med ett pseudosubstrat hnrnp-u, som binder och dess derivat i kärnan och utesluter deras interaktion med substraten (21). Genom att införa specifika mutationer av aminosyraresterna på accordrcp för att eliminera dess bindning till Accord-catenin, IkB eller Hnrnp-U, räknar vi med att förbättra inte bara specificiteten utan också tillgängligheten av den konstruerade accordrcp-E7N för att rekrytera det avsedda substratet (Fig. 3lägre).

substratbindningsdomänen för augrtrcp innehåller sju WD40-upprepningar i C-terminalområdet, som viks in i den typiska sjubladiga strukturen för augr-propellern bevarad bland WD40-proteiner (3-7). Eftersom den övergripande integriteten hos strukturen av WD40-proteiner för saxpropellern är avgörande för deras funktioner, kommer standardmetoden för radering av mutagenes sannolikt att inducera grova strukturella förändringar, och är således inte tillämplig för att definiera substratbindningsställen på saxtrcp. Den kända kristallstrukturen hos WD40-proteiner kan emellertid utnyttjas för att identifiera ytrester som är involverade i bindning av substrat för sackaros. En strukturbaserad mutagenes-metod utformades för att identifiera och mutera fem positivt laddade rester (R285, K365, R474, R521 och R524), som förutspås ligga på den övre ytan av WD40-propellern, som är involverade i bindning till WD40-associerade proteiner (Fig. 3B) (22). Detta tillvägagångssätt beskrivs i stödjande metoder, som publiceras som stödjande information på PNAS webbplats. Se även Fig. 6, som publiceras som stödinformation på PNAS webbplats. Dessutom kommer substitutioner av dessa Lys/Arg-rester sannolikt inte att förändra den totala strukturen i enlighet med detta.

genom att använda QuikChange multisite-directed mutagenesis kit (Stratagene) har vi samtidigt muterat dessa rester till Glu. Denna FLAGGMÄRKTA sammansatta mutant, betecknad F-TrCP (m1)-E7N, testades för dess bindning till både de endogena (IkB) och de avsedda (p107) knockout-målen. HeLa-celler transfekterades övergående med F-TrCP (m1)-E7N eller F-TrCP-E7N, och deras interaktioner med IkB och p107 bestämdes genom coimmunoprecipitation. F-TrCP-E7N och F-TrCP uppvisade liknande affiniteter till det fosforylerade IkB-proteinet, medan föreningen M1-mutationer avskaffade f-TrCP(m1) – E7N-bindning (Fig. 3C mitten). Däremot detekterades liknande nivåer av p107 i immunkomplexen av F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1)-E7N (Fig. 3C lägre), vilket indikerar att det konstruerade F-TrCP(m1)-E7N ubiquitin–proteinligaset är fullt funktionellt vid rekrytering av de avsedda cellulära målen. Dessa resultat överensstämmer med de strukturella förutsägelserna i Fig. 3b, och vidare definiera aminosyrarester på sighi-trcp kritiska för endogent substratigenkänning.

den konstruerade F-TrCP (m1)-E7N analyserades ytterligare för sin styrka vid nedbrytande endogen p107. C33a-celler kotransfekterades med F-TrCP, F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1)-E7N, tillsammans med en CD19-uttrycksplasmid. Fyrtioåtta timmar efter transfektion skördades och berikades celler för dem som fick de transfekterade plasmiderna genom att använda de immunomagnetiska pärlorna konjugerade till den monoklonala antikroppen Anti-CD19. Endogena P107-nivåer bestämdes därefter genom immunoblotting. Såsom visas i Fig. 3D, ektopiskt uttryck av F-TrCP (m1)-E7N resulterade i en 95% reduktion av endogena P107-nivåer, medan en 82% nedreglering av p107 observerades för F-TrCP-E7N (Fig. 3D övre, jämför körfält 4 och 3). Vidare hade expression av F-TrCP (m1)-E7N ingen observerbar effekt på tumörnekrosfaktor (TNF)-sacrib inducerad nedbrytning av IkB av den infödda SCF–Sacribrcp, eller på förstörelse av p27kip1 av SCFSkp2 ubiquitin-proteinligaser (data visas inte). Därför påverkar ektopiskt uttryck av den konstruerade F-TrCP(m1)-E7N inte den totala SCF-ubiquitinationsaktiviteten genom att krossa SCF-kärnkomponenterna (Skp1, CUL-1 och Rbx1/Roc1) som delas av de endogena f-box-proteinerna.

riktad P107-nedbrytning bedömdes ytterligare i enskilda c33a-celler genom indirekt immunofluorescensanalys. Konsekvent utrotades p107 till stor del i C33A-celler som uttryckte F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1)-E7N, men inte f-TrCP ensam (Fig. 3E). Sammantaget tyder dessa resultat på att genom att eliminera bindningsställena för de endogena askorrcp-substraten visade det konstruerade F-TrCP(m1)–E7N ubiquitin-proteinligas ökad specificitet och robust proteolytisk aktivitet mot det avsedda målet.

Minimal Bindningsdomän som riktad peptid för effektiv Substratrekrytering. För att uppnå hög specificitet av substratrekrytering och för att minimera icke-specifik inriktning av andra cellulära proteiner testade vi om den minimala P107/RB-interaktionsdomänen för E7N (betecknad E7m), som omfattar rester 21-29 av E7 som spänner över LXCXE-motivet (23), kunde uppnå effektiv bindning och nedbrytning av p107. Ett chimeriskt ubiquitin-proteinligas konstruerades i vilket accordrcp och E7m kovalent länkades samman av en flexibel 20-aa-distans bestående av 10 kopior av Gly-Ser-upprepningar (betecknade 10gs). F-TrCP-E7N eller F-TrCP-10gs-E7m transfekterades övergående till C33A-celler och deras bindning till den endogena p107 bedömdes genom immunutfällning i extrakt beredda efter behandling med proteasomhämmaren MG132 för att hämma nedbrytning som en följd av denna interaktion. Såsom visas i Fig. 4A (körfält 2 och 3), F-TrCP-10gs-E7m hade något ökad affinitet till p107 än den för den ursprungliga F-TrCP-E7N. F-TrCP-E7N och F-TrCP-10gs-E7m utvärderades ytterligare för deras effektivitet i P107-nedbrytning genom övergående transfektion i C33A-celler som i Fig. 3D. som visas i Fig. 4B, F-TrCP-E7N och F-TrCP-10gs-E7m inducerade upp till 92% och 95% nedreglering av p107, vilket indikerar att den konstruerade jacobtrcp som bär den minimala P107-bindande domänen fungerar lika effektivt som den ursprungliga F-TrCP-E7N i nedbrytande målproteiner.

Retroviral-medierad leverans av den konstruerade jacobtrcp för varaktig nedbrytning av endogena mål. Vi undersökte därefter om de konstruerade ubiquitin-proteinligaserna kunde uttryckas stabilt för att uppnå hållbar nedbrytning av det avsedda målet. HL-60-promyelocytiska leukemicellerna omvandlades med de rekombinanta retrovirusen som uttryckte PBMN-GFP, F-TrCP(m1)-E7N eller kontrollen F-TrCP-E7N (OCCULDLYC), där RB/p107-bindningsstället raderades (1). Infekterade celler med kromosomalt integrerade chimära f-TrCP-transgener isolerades genom FACS-sortering, baserat på uttrycket av GFP från virusen, och nedbrytning av den endogena p107 bedömdes från infekterade HL-60-celler antingen omedelbart efter infektion (Fig. 5A), eller efter 3 månaders odling i tillväxtmedium (Fig. 5B). Eftersom två andra medlemmar av RB-familjen proteiner, RB och p130, också uttrycks i hl-60-celler undersökte vi om en enda F-TrCP-E7N samtidigt kan rikta nedbrytning av hela RB-familjen av proteiner som interagerar med samma lxcxe-motiv av E7N. ektopisk uttryck av retroviralt transducerad F-TrCP-E7N inducerad dramatisk nedreglering av den hypofosforylerade formen av RB, såväl som p107 (Fig. 5A) och p130 (data visas inte) i hl-60-celler, antingen omedelbart efter infektion och FACS-sortering (Fig. 5A), eller 3 månader efter infektion och kontinuerlig odling (Fig. 5B, körfält 3). Däremot hade stabilt uttryck av F-TrCP-E7N (OC-DLYC) i hl-60-celler ingen effekt på förändring av p107, RB (Fig. 5A, lane 3) och P130 nivåer (data visas inte). Överensstämmer med observationen att F-TrCP-E7N företrädesvis försämrar hypofosforylerad RB i U2OS-celler (Fig. 2), reduktion av hyperfosforylerade RB-arter genom stabilt uttryck av F-TrCP-E7N var mindre uttalad jämfört med den för den hypofosforylerade formen i HL-60-celler (Fig. 5A, jämför körfält 2 av pRB och pRB-P).

vid behandling med all-trans retinsyra (ATRA) lämnar HL-60-celler cellcykeln och genomgår terminal differentiering. En ackumulering av hypofosforylerad RB observerades, vilket tidigare rapporterades bidra till ATRA-inducerad tillväxtstopp, medan den hyperfosforylerade RB inte var detekterbar (24, 25). För att undersöka om SCF-maskinen kan utnyttjas även under cellcykelutgång, behandlades HL-60-celler som stabilt uttryckte F-TrCP-E7N eller F-TrCP(m1) – E7N med 1 accugm ATRA för 72 h och nedbrytning av RB-familjproteiner utvärderades. HL-60-celler som stabilt uttryckte F-TrCP-E7N resulterade i 95%, 98% och 85% minskning av RB -, p107-respektive p130-nivåer jämfört med celler infekterade med kontroll pBMN-GFP-viruset (Fig. 5B, körfält 2). Eftersom ATRA också aktiverar transkription av gener under kontroll av Moloney murine leukemivirus LTR av pBMN-GFP (26) bidrog det ökade uttrycket av F-TrCP-E7N på ATRA-behandling sannolikt ytterligare till effektiv nedreglering av p107, p130 och hypofosforylerad RB (Fig. 5B).

effekten av RB-familjproteinerna på normal cellcykelprogression har undersökts i musembryofibroblaster med störningar i RB -, p107-och p130-gener och befunnits inte svara på signaler som inducerar G1-arrestering, såsom tillväxtfaktor dra tillbaka eller DNA-skada (27, 28). De kollektiva effekterna av RB-familjemedlemmarna i tumörcellsproliferation har emellertid inte studerats på grund av bristen på effektiva omvända genetiska verktyg. De stabila HL-60-cellerna som uttrycker F-TrCP(m1) – E7N från denna studie gjorde det möjligt för oss att bedöma hur tumörceller bristfälliga för alla tre RB-familjproteiner svarade på G1-arresteringssignaler. I exponentiellt växande HL-60-celler som uttrycker F-TrCP (m1)-E7N som inducerade konstitutiv nedbrytning av RB-familjeproteinerna observerades en markant acceleration av cellcykelprogression i jämförelse med de infekterade av kontroll pBMN-GFP-viruset (Fig. 5c vänster). Detta resultat överensstämmer med nedsatt kontroll av G1-S-övergångar observerade i RB–/–, p107–/– och p130 – / – trippel knockout-musembryofibroblaster (27, 28).

ATRA-behandling hämmade G1-till-s-fasövergången i hl-60-celler infekterade av kontrollen pBMN-GFP (Fig. 5C) eller f-TrCP-E7N(OCCLUDLYC) – virus (data visas inte), vilket överensstämmer med vad som rapporterades för oinfekterade HL-60-celler (Fig. 5C) (24). En initial fördröjning i G1-S-övergången observerades också i pbmn-F-TrCP(m1)-E7N/HL-60-celler vid 48 timmar efter ATRA. En fullständig G1-arrestering kunde emellertid inte uppnås i det senare skedet (72-96 h) och celler fortsatte cellcykelprogressionen (Fig. 5C). Däremot var kontrollen pBMN-GFP / HL-60-celler alla blockerade i G1 mellan 72 och 96 h. dessa observationer tyder på att F-TrCP(m1)-E7N-medierad nedbrytning av RB–familjemedlemmar försämrar en sen ATRA-responshändelse som är nödvändig för att slutföra tillväxtstopp, medan den tidiga dämpningen av G1-s-progression i stort sett inte påverkades. Vidare observerades en dramatisk minskning av cellantal mellan 72 och 96 timmar efter ATRA-behandling på grund av massiv celldöd under ATRA-inducerad cellcykelutgång och differentiering (29). Påfallande visade HL-60-celler som uttryckte F – TrCP(m1)-E7N en genomsnittlig ökning av 2-till 3– faldig i subG1– populationerna jämfört med den för kontrollvirusinfekterade HL– 60– celler (data visas inte), vilket överensstämmer med den ökade celldöd i RB–/–, p107-/ – och p130 – / – trippel knockout-mus embryonala fibroblastceller under tillväxthämmande förhållanden (28). Sammantaget inducerade konstitutivt uttryck av F-TrCP (m1)-E7N nedreglering av hela RB-familjeproteinerna, vilket leder till en hämning av tillväxtstopp och en ökning av celldöd vid ATRA-behandling.

ATRA-inducerad G1-arrestering innebär samordnad reglering av flera cellulära signaler/komponenter som negativt styr cellcykeln (granskad i ref. 30). Dimberg et al. (31) rapporterade att ATRA utlöser en sekvens av händelser i myeloida celler som involverar en tidig ökning av p21waf1-uttryck, stabilisering av p27kip1 och senare defosforylering av RB vid början av G1-arresteringen. Eftersom endast rb-familjemedlemmar(M1)-e7n försämrar rb-familjemedlemmar och inte har någon effekt på stabiliteten hos p21waf1 och p27kip1, är det troligt att endast det sena, RB-beroende ATRA-svaret påverkas, vilket överensstämmer med motståndet hos pbmn-F–TrCP(m1) – E7N/HL-60-celler för att slutföra G1 arresterat72-96 h (Fig. 5C). Den observerade tidiga tillväxthämningen av ATRA vid 48 timmar (Fig. 5C) kan tillskrivas, åtminstone delvis, till uppregleringen av p21waf1 och p27kip1, vars stabilitet inte påverkas av konstitutivt f-TrCP(m1)-e7n-uttryck (Fig. 2 och 5).