resultat

vi bedömde först om CD63 och H,K-ATPas bor i samma subcellulära fack i gastriska parietala celler. Tidigare arbete har visat att råttparetalceller uttrycker höga nivåer av CD63 (22). Immunofluorescensmikroskopi på frysta delar av råttmagen indikerar att CD63 finns i de flesta celler i råttmagen, inklusive parietalceller (Fig. 1A). CD63 colocalizes delvis med HKa i parietalceller. Dessutom analyserade vi ett mycket renat TVE-preparat från hog mage (en snäll gåva från C. T. Okamoto). H, K-ATPas bidrar med 50% av proteininnehållet i liknande preparat (23). Western blot-analys indikerar att CD63 är rikligt närvarande i denna renade beredning av TVs (Fig. 1B).

för att undersöka en möjlig in situ-interaktion mellan CD63 och H,K-ATPas, utförde vi neddragningsexperiment med biotinylerad tomatlektin. Tidigare studier har visat att detta lektin binds specifikt och unikt till hk GHz i magpreparat (24-27). Vi blottade ett TVE-preparat med anti-hk Bisexuell mAb och biotinylerad tomatlektin för att bekräfta att lektinet associerar specifikt med den glykosylerade hk Bisexuell (Fig. 1C). Vi använde sedan biotinylerad tomatlektin för att isolera proteiner som interagerar med hk GHz i TVE-beredningen. Western blot-analys indikerar att CD63 fälls ut av tomatlektin (Fig. 1D), som visar att CD63 och H, K-ATPase associerar in situ och föreslår att denna förening kan vara fysiologiskt relevant. Förbehandling av TVE-preparatet med 4% SDS, följt av en 20-faldig utspädning i lysbuffert, minskade signifikant mängden CD63 som utfälldes. Den mängd hk-socker som fälldes ut ändrades inte av denna behandling (data visas inte). Dessa data tyder på att förekomsten av CD63 i neddragningen kan hänföras till dess associering med hk GHz och inte till en direkt koppling mellan CD63 och tomatlektin.

för att undersöka den funktionella betydelsen av samspelet mellan CD63 och hk GHz ytterligare transfekterade vi cos-7-celler med en cDNA-kodande kanin hk ie antingen enskilt eller tillsammans med en cDNA som kodar för en FLAGGMÄRKT CD63-konstruktion (CD63-FL). Vi har visat att hk GHz inte behöver monteras med HKa för att nå cellytan i transfekterade cos-celler (20). Vi använde en CD63-konstruktion som bär en FLAGGEPITOPE-tagg på sin N-terminal eftersom C-änden av CD63 innehåller ett tyrosinbaserat motiv som krävs för intracellulär handel med denna tetraspanin (13).

cos-celler som är kotransfekterade med hk GHz och CD63-FL utsattes för immunutfällning med användning av en Anti-FLAG pAb. Western blot-analys av det immunoprecipiterade materialet indikerar att hk-sockret samprecipiterar med CD63 (Fig. 2, hk 0 + CD63-FL). CD63-FL-och hk-Bronkialproteinerna koimmunoprecipiterar i en mängd olika tvättmedel, inklusive 2% CHAPS, 1% Brij 96 och 1% Triton X-100. Associeringen mellan CD63 och hk-exporten utgör ett av de få tetraspanin-komplex som beskrivs som överlever solubilisering i Triton X-100 och är således sannolikt att representera en direkt interaktion (28). Subenheten av cu har två former: cu (Mogen), som modifieras med komplexa kolhydrater och cu (kärna), som modifieras med kolhydrater med hög mannos (29). Båda formerna coprecipitate med CD63, även om förhållandet mellan sacg till sacg i fällningen varierar som en funktion av solubiliseringsbetingelserna.

hk-pab detekterades inte i FLAGGIMMUNUTFÄLLNINGARNA som utfördes på celler som transfekterades med hk-bara för att visa att flagg-pAb inte interagerar med subenheten för hCG (Fig. 2, hk. Hk-Kokimmunoprecipiterar inte med FLAG pAb från en blandning (50: 50, vol/vol) av lysater framställda från celler som transfekteras var för sig med CD63-FL och underenheten för att bekräfta att interaktionen sker in vivo (Fig. 2, andra körfält). Prover som inkuberats med FLAG pAb fäller inte ut den lysosomala proteinlampan-1, vilket indikerar att interaktionen mellan CD63-FL och hk Saigon är specifik och inte en artefakt av ofullständig solubilisering av CD63-facket (Fig. 2).

vi undersökte sedan om samspelet mellan hk och CD63 påverkar den subcellulära lokaliseringen av den subcellulära subenheten. Hk-sockret är närvarande vid cellytan i övergående transfekterade COS-celler (Fig. 3 A-C). Det finns en uttalad omfördelning av den subenheten i enlighet med den intracellulära cd63-innehållande vesiklar, när cos-celler kotransfekteras med både hk och CD63-fl (Fig. 3 D-F). För att utesluta möjligheten att denna förändrade lokalisering kan vara en ospecifik effekt av CD63-överuttryck undersökte vi effekten av CD63-uttryck på distributionen av AQP4. AQP4 är en vattenkanal som är närvarande i de basolaterala plasmamembranen i parietala celler. Det genomgår inte reglerad endocytos och exocytos med H,K-ATPas (30, 31). Denna kanal koimmunoprecipiterar inte med CD63-FL i ett Triton X-100-lysat av kotransfekterade COS-celler (Fig. 4A). När kotransfekterade celler visualiseras genom immunofluorescenskonfokal mikroskopi, är AQP4 inte närvarande i det CD63-innehållande facket (Fig. 4B), vilket indikerar att CD63-inducerad omfördelning till intracellulära vesiklar är specifik för proteiner som interagerar med detta tetraspanin.

för att undersöka mekanismerna för den CD63-medierade omfördelningen av hk Bisexuell, utnyttjade vi det senaste arbetet som har karakteriserat den intracellulära handeln med CD63. Rous et al. (13) visade att det tyrosinbaserade motivet som finns vid den extrema C-änden av CD63 samverkar med adapterunderenheterna https: / / 22 och 33. Protein 2 är en del av det heterotetramera AP – 2-komplexet. Detta komplex är närvarande vid plasmamembranet och länkar lastproteiner med klatrinskiktet och förmedlar deras endocytos (14). Proteinet av typ 3 är en del av det heterotetramera AP – 3-komplexet. Detta komplex deltar i lysosomal inriktning och finns både i trans-Golgi-nätverket och i ett vesikulärt fack som delvis kolokaliserar med endosomer (12). När det yevm-tyrosinbaserade motivet av CD63 muteras till AEVM, kan CD63 inte interagera med antingen 2 eller 3 och uttrycks främst på cellytan (13). När hk-underenheten är samuttryckt med den FLAGGMÄRKTA CD63-AEVM-konstruktionen, fördelas både CD63-AEVM och underenheten för exporterande tillverkare på cellytan (Fig. 3 G-I). Således påverkas den intracellulära fördelningen av hk Ghz av trafficking signaler inbäddade i CD63 cytoplasmatisk svans.

När YEVM-sekvensen i svansen på CD63 muteras till YEVI, fortsätter det modifierade motivet att interagera med sighuvud3 men associerar inte längre med sighuvud2 (13). CD63-YEVI lokaliseras främst till det sena endosomala-lysosomala facket, troligen för att det förändrade tetraspan-proteinet rör sig direkt till detta fack efter dess initiala biosyntetiska passage genom Golgi (13). Den lilla populationen av CD63-YEVI som når plasmamembranet uppvisar nedsatt internalisering eftersom den inte längre kan interagera med XX2 (13). När hk och en FLAGGMÄRKT Cd63-YEVI-konstruktion samuttrycks i COS-celler, är mycket av CD63-YEVI lokaliserat till det sena endosomala-lysosomala facket; emellertid förblir underenheten för sackaros på cellytan och omfördelas inte till ett intracellulärt fack (Fig. 3 J-L). Coimmunoprecipitationsanalys bekräftar att hk Macau kan associeras med både CD63-YEVI och CD63-AEVM (data visas inte). Dessa data tyder på att för att hk GHz ska distribueras till ett CD63-positivt intracellulärt fack måste dessa proteiner interagera på cellytan och endocyteras som ett komplex.

för att bestämma om hk-ci detekterades i intracellulära vesiklar motsvarar protein som endocytoserades från cellens yta, observerade vi internaliseringen av CI-subenheten i närvaro och frånvaro av exogent CD63-uttryck. COS-celler var kotransfekterade med hk GHz och CD63-FL. Cellerna kyldes sedan till 4 msk C för att stoppa endocytos och yta märkt med hk-Mab. De märkta cellerna inkuberades vid 37 C i 40 minuter för att tillåta endocytos att återupptas. Efter inkubationen kyldes cellerna till 4 msk C och ytan märktes med Cy5-konjugerad get anti-mus IgG. Celler fixerades och inkuberades med anti-flagga pAb och märktes sedan med både fluoresceinisotiocyanat-konjugerad get anti-mus IgG och rhodamin-konjugerad get anti-kanin IgG. Således visualiserades hk-exporten som återstod på ytan på Cy5-kanalen, internaliserad hk-exporten visualiserades på fluoresceinisotiocyanatkanalen och CD63-FL visualiserades på rhodaminkanalen. Denna analys visade att internaliserad Kubi-subenhet colocalizes med CD63, vilket tyder på att poolen av hk-exporten som är colocalized med CD63 härleds genom endocytos från cellmembranet (Fig. 5 E-H). Celler som inte överuttrycker CD63 uppvisar mycket mindre internaliserad subenhet i enlighet med en inkubation på 40 minuter (Fig. 5 A-D).

för att kvantifiera internaliseringen av hk Macau och verifiera vidare att hk Macau och CD63 associerar vid cellens yta utförde vi biotinyleringsexperiment på cellytan. I det första experimentet transfekterades cos-celler med enbart den underenhet som användes för att omvandla den till en subenhet och biotinylerades med biotin-SS-n-hydroxisuccinimidester vid 4 C. Dubblettprover inkuberades sedan vid 37 C under olika tidsperioder för att tillåta endocytos att återupptas. Celler återfördes till 4 CCB, och en platta från varje tidpunkt avlägsnades från det återstående cellytans biotin genom exponering för det membran-impermeanta reduktionsmedlet MesNa. Cellerna lyserades och inkuberades med streptavidinpärlor. Proteiner som associerades med streptavidin-pärlorna separerades med SDS / PAGE, och membranen undersöktes med hk XXL Mab (Fig. 6A). Fraktionen av en del av en del av en del av en cell på ytan förändras inte märkbart när internaliseringen av 37 C av en del av en del fortsätter. Efter den första 10 min, en liten bråkdel av den ytmärkta hk Asia sekvestreras inuti cellen, och förhållandet mellan yta och internaliserad hk Asia förblir hög. Dessa data tyder på att den underenhet som inte är associerad med cd63 antingen internaliserar mycket långsamt eller internaliseras men återvinns snabbt tillbaka till ytan, ungefär som transferrinreceptorn.

Vi försökte nästa gång karakterisera beteendet hos hk Bisexuell som associerar med CD63. COS-celler var kotransfekterade med hk GHz och CD63-FL. Cellerna biotinylerades och avlägsnades såsom beskrivits ovan. För att isolera populationen av hk, som är associerad med CD63, inkuberades celllysatet med FLAGGPAB och protein A-konjugerade agarospärlor. Det immunoprecipiterade materialet eluerades med en liten mängd buffert innehållande 3% SDS, späddes 30 gånger med 1% Triton X-100 och inkuberades med streptavidinpärlor. Proteiner som associerades med streptavidin-pärlorna separerades med SDS / PAGE och probed med hk XXL Mab (Fig. 6B). För celler som inte utsattes för ett strippningsprotokoll representerar signalen som detekterades i denna Västra blot den totala poolen av ytmärkt Bisexuell-subenhet associerad med CD63, inklusive komplex som fortfarande var vid plasmamembranet och komplex som hade internaliserats i vesiklar. För celler som utsattes för ett strippningsprotokoll representerar signalen populationen av Tubi-subenhet associerad med CD63 som var närvarande vid cellytan under biotinylering och därefter internaliserades och skyddades från MesNa-remsan.

vid 0-min-tidpunkten detekteras biotinylerat hk-Bronkiolimprecipitat lätt i anti-FLAGGIMMUNPRECIPITAT från ostrippade celler, vilket visar att hk-Bronkiolimprecipitater och CD63 kan associeras vid cellytan. Alla de biotinylerade hk-bronkierna som återvinns vid 0-min-tiden är känsliga för MesNa-remsan. Mängden CD63-associerad, biotinylerad exportorienterad subenhet skyddad från MesNa-reagenset ökar när cellerna får inkubera vid 37 kcal C. I själva verket är mängden hk, som är närvarande på ytan och associerad med CD63 vid 0 min, ungefär densamma som mängden hk, som är associerad med CD63 och skyddad från strippning vid 45 min. Dessa fynd tyder på att den subenhet som associeras med cd63 är internaliserad och inte återgår till cellytan.